黄酮类化合物是天然多酚中最多的一类物质,广泛存在于蔬菜、水果、谷物和茶叶中,占人类饮食中多酚摄入量的一半以上,已有超过8 000种黄酮类化合物被发现。如图1所示黄酮类化合物是指2个具有酚羟基的苯环(A环和B环)通过中央3个碳原子连接在一个含氧杂环(C环)上的一系列化合物,可根据其B环和C环结构的差异分为:黄酮醇、黄酮、黄烷醇(儿茶素)、黄烷酮、异黄酮、二氢查尔酮类等[1]。该类物质B环的邻二酚羟基、多羟基结构和C环2～3位的碳碳双键与C-4位羰基相结合的结构均具有强有效自由基清除能力[2]。目前,已经有相关研究报道显示黄酮类化合物具有抑制油脂氧化和抑制油烟中醛形成的作用,其抑制醛形成的途径主要有3种机制:清除自由基、与醛发生反应、与脂肪酸发生酯化反应[3]。
A-槲皮素结构;B-EGCG结构;C-根皮素结构;D-芹菜素结构;E-花旗松素结构;F-黄酮化合物的基本骨架
图1 五种黄酮类化合物的结构及基本骨架
Fig.1 Structures and basic skeleton of five flavonoids
FAN等[4]的研究指出,随着加热时间的延长,槲皮素对加热二十二碳六烯酸(docosahexaenoic acid, DHA)强化大豆油油烟中醛的抑制效果逐渐减弱,这与多酚类活性物质清除自由基的机制一致,为保护不稳定的碳氢键(C—H)以减少脂肪酸自氧化链起始阶段R基自由基(R·)的形成,或者清除链传递阶段中产生的自由基,均为不可逆的过程,会在一定程度上使黄酮类物质抗氧化活性降低[4]。该类化合物大多具有热不稳定性,在热加工过程中,不仅可以在C环发生降解反应,C环羟基位点同时还可与脂肪酸发生亲核加成反应[5],A环也可与醛发生迈克尔加成反应[6],还可能在加工过程中发生挥发和转化反应[7]。这些因素均可能导致黄酮类化合物抑制油脂氧化效率或抑制油烟中醛类物质的能力随加热时间的延长而减弱。然而,目前还未有针对黄酮类化合物在油脂体系中抗氧化活性改变机制的系统研究。进一步了解其在油脂热加工过程中抗氧化活性改变的机制,对天然活性物质是否可作为安全抗氧化剂,从而应用于油脂热加工领域尤为重要。
本实验首先在模拟油炸系统中(180 ℃,30 min),以槲皮素(黄酮醇)、芹菜素(黄酮)、花旗松素(黄烷醇)、根皮素(异黄酮)、没食子儿茶素没食子酸酯(epigallocatechin gallate,EGCG)(儿茶素类)5种黄酮类化合物为研究对象(图1),通过分析其浓度变化与ABTS阳离子自由基清除率初步探究其损耗规律。然后在人肝癌细胞(human hepatic cancer cell,HepG2)模型中研究油炸体系的细胞毒性,对其安全性进行系统性评估,明确黄酮类化合物在油脂热加工体系中可能对健康造成的影响,为日常烹饪和食品加工提供科学的指导。最后在亚油酸加热体系中,通过傅里叶变换红外光谱超高效液相色谱-四极杆-飞行时间串联质谱法(ultra performance liquid chromatography-quadrupole time-of-flight mass spectrometry/tandem mass spectrometry,UPLC-Q-TOF-MS/MS)分析槲皮素在加热过程中的变化机制,初步解析黄酮化合物在油脂加热过程中抗氧化活性改变的机制,为黄酮类化合物在油脂中的应用理论依据和实践基础。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
大豆油、芹菜素、花旗松素、根皮素、EGCG,泰坦科技;槲皮素,Sigma公司;二甲基亚砜和磷酸盐缓冲溶液,国药集团化学试剂有限公司;最低必需培养基(minimum essential medium,MEM),美国Gibco生物科技公司;胎牛血清和青霉素/链霉素溶液,美国ScienCell研究实验室;CCK-8(Cell Counting Kit-8)试剂盒,上海生工生物工程有限公司;其他试剂和实验耗材,上海安谱实验科技股份有限公司。
1.2 仪器与设备
7890A-5975C气相色谱-质谱联用仪, 美国Agilent公司;多功能酶标仪,美国Biotek公司;Waters e2695高效液相色谱仪,Waters(上海)有限公司;Spotlight 400傅里叶变换红外光谱仪(DTGS检测器及Spectrum 100通用ATR UATR附件),德国Perkin Elmer公司;Agilent 1290高效液相色谱仪、Agilent 6550 Q-TOF/MS,美国Agilent公司。
1.3 实验方法
1.3.1 油烟模拟系统
本研究所采用的油烟模拟系统参考FAN等[4]的研究设计。为探究不同温度下油烟中醛类物质释放的浓度,将50 mL大豆油倒入反应釜中,分别加热至140、160、180、240 ℃,待温度恒定时,在Tedlar集气袋中收集500 mL气态油烟,时间为0.5 min。油烟中的醛类物质采用顶空固相微萃取-气相色谱-质谱联用进行分析。
1.3.1.1 顶空固相微萃取-气相色谱-质谱联用分析
萃取条件:利用气密注射器,在油烟收集袋中吸取30 mL模拟油烟气体,注射入真空状态下的顶空瓶中,同时加入内标2,4,6-三甲基吡啶(2.5 μL,0.1 mg/mL),将萃取头(65 μm PDMS/DVB)插入进样瓶中,60 ℃下顶空萃取30 min,然后,迅速将SPME萃取头插入进样口,解析5 min后通过气质联用仪分析鉴定油烟中挥发性成分[8]。
色谱条件:DB-5MS弹性毛细管柱(60 m×0.32 mm×0.25 μm);升温程序:起始柱温35 ℃,保留5 min;然后以4 ℃/min升至250 ℃,保留5 min;载气流量1.0 mL/min,不分流模式。
质谱条件:电子能量70 eV,传输线温度230 ℃,离子源温度为230 ℃,质量扫描范围35～550 m/z。
定性与定量分析:由标准品和NIST 11标准谱库检索对油烟中挥发性醛进行定性分析。通过7个浓度下标准物质峰面积与内标峰面积之比形成的校准曲线对油烟中醛类物质进行定量分析,具体操作如下:将不同浓度的混合标准品(10 μL,0.3～600 μg/mL)和2,4,6-三甲基吡啶(2.5 μL,100 μg/mL)加入30 mL棕色顶空瓶中,在60 ℃下气化5 min,然后按照油烟检测方式进行分析,制作标准曲线。
1.3.2 样品的制备
准确称取100 g大豆油,分别将5种黄酮类化合物加入其中(200 μg/g 油),均质15 min后在25 ℃下超声15 min,最后贮藏在-80 ℃下待用。另外,将5种黄酮在甲醇中配制成10、25、50、75、100 μg/mL的标准多酚溶液,贮藏在4 ℃下待用。
1.3.3 油样加热实验
在模拟油炸系统中,将50 mL含5种黄酮类化合物的大豆油分别加热至180 ℃,于120 min时,收集氧化油脂,最后贮藏在-80 ℃下待用。
1.3.4 细胞毒性实验
将2 g含有不同黄酮类化合物的大豆油用10 mL甲醇提取3次(4 mL、3 mL和3 mL),每次涡旋5 min后,4 000 r/min下离心3 min,将上清液合并。用旋转蒸发器在45 ℃真空下将上清液蒸发至最小体积后,用甲醇定容2 mL备用。HepG2细胞用MEM培养基(含质量分数10%的胎牛血清,质量分数1%青霉素和链霉素)在细胞培养箱培养(37 ℃、质量分数5%二氧化碳)。将细胞活力良好的20代HepG2细胞接种至96孔板中,培养24 h,使细胞贴壁并保持活力稳定;然后加入10 μL含有5种黄酮类化合物的氧化大豆油提取物,培养24 h后,去掉上清液,用磷酸盐缓冲溶液清洗3次,再加入200 μL含有质量分数10%CCK-8的培养基,于细胞培养箱(37 ℃、质量分数5%二氧化碳)中培养30 min,在450 nm处测定吸光度。细胞活力计算如公式(1)所示:
细胞活力
(1)
式中:A0,具有培养基和CCK-8溶液而没有细胞的孔的吸光度;A1,具有细胞、CCK-8溶液和氧化油脂的孔的吸光度;A2,具有细胞和CCK-8溶液而没有氧化油脂的孔的吸光度。
1.3.5 加热过程中5种黄酮类化合物的含量变化
为了研究油脂加热过程中黄酮类化合物含量变化,将50 mL含有5种黄酮类化合物的大豆油在油炸模拟系统中加热至180 ℃,分别在0、30、60、90和120 min收集热氧化油脂,立即冷却后,将1 mL收集到的氧化油脂用甲醇稀释至5 mL,涡旋混匀后,超声5 min,用0.22 μm有机滤膜过滤后待测。
检测条件:色谱柱:C18色谱柱(YMC-Pack ODS,5 μm, 250 mm × 4.6 mm);流动相:质量分数1‰甲酸水溶液(A),甲醇(B);槲皮素、根皮素和芹菜素用40%A:60%B等度洗脱15 min;EGCG和花旗松素用70%A:30%B等度洗脱15 min;流速:1 mL/min;柱温:35 ℃;进样量:10 μL;槲皮素、根皮素、芹菜素、EGCG和花旗松素的检测波长分别为:360、280、345、280、290 nm。通过保留时间及标准曲线对黄酮类化合物的浓度进行定量分析。
1.3.6 ABTS阳离子自由基清除能力的测定
ABTS阳离子自由基清除能力的测定参考ANCUCEANU等[9]的方法,并稍加修改。取ABTS 3 mg溶于0.735 mL超纯水中,混匀后取0.4 mL该溶液与相同体积的K2S2O8(2.6 nmol/L)混合,在室温黑暗条件下反应12 h后,再稀释40～50倍,直到在734 nm的吸光值为0.7±0.02,避光备用。
取1 mL ABTS溶液加入50 μL 1.3.5节中5个时间点下的氧化油脂,涡旋混匀后避光反应7 min,在734 nm处测定吸光值。ABTS阳离子自由基清除率计算如公式(2)所示:
ABTS阳离子自由基清除率
(2)
公式中,A1为样品测定的吸光值;A0为超纯水代替样品测定的吸光值。
1.3.7 FTIR分析
在模拟油炸系统中,将50 mL含槲皮素和含EGCG(200 μg/g 油)的亚油酸分别加热至180 ℃,于0、30、60、90、120 min时,收集氧化油脂。利用FTIR仪测定油脂样品的红外光谱,分析2种黄酮类化合物在亚油酸加热体系中的抗氧化活性的变化。红外光谱的检测范围为4 000～400 cm-1,分辨率为4 cm-1,空气背景校准,扫描次数为32次。
1.3.8 UPLC-Q-TOF-MS/MS分析
含有槲皮素的亚油酸在模拟油炸系统中加热120 min后,取1 mL氧化油脂用甲醇稀释至5 mL,旋涡混匀后,超声5 min,用0.22 μm有机滤膜过滤后待测。使用液相色谱和质谱对样品进行分析。色谱柱为waters BEH C18色谱柱(2.1 mm×100 mm,1.7 μm),流动相A和B分别为质量分数0.1%的甲酸和甲醇,梯度洗脱:0 min～15 min,40%A,60%B。进样体积5 μL,流速为0.3 mL/min。电喷雾离子源(ESI);正、负离子模式下采集数据,质荷比(m/z)扫描范围50～1 000,扫描间隔0.2 s,毛细管电压4.0 kV,脱溶剂氮气流速12 L/min,脱溶剂温度350 ℃。
1.4 数据处理
所有实验重复3次,数据由SPSS 25.0进行单因素方差分析并采用邓肯检验进行多重比较,结果以“平均值±标准差”(n=3)表示,P<0.05认为数据具有显著性差异。
2 结果与分析
2.1 模拟油炸系统的建立
由图2可得,加热温度在140、160、180、240 ℃时,大豆油油烟中醛的质量浓度分别为(355.94±20.20)、(567.33±27.08)、(1 617.53±15.28)和(3 307.78±95.01) ng/L。随着温度的升高,大豆油油烟中醛的质量浓度呈现上升的趋势,且有显著性差异(P<0.05),这与ZHANG等[10]的研究结果一致。在加热温度由140 ℃升至160 ℃时,醛的浓度增加缓慢,当温度达到180 ℃时,油烟中醛的质量浓度增加比较明显,这是由于高温条件可以达到热分解和氧对饱和脂肪酸的攻击等较多反应所需的焓值[11],尤其是当温度大于烟点时,油脂会发生不完全燃烧,快速氧化分解产生大量醛类物质[12]。由此可得,烹饪温度越高油烟中醛的浓度越高,油烟的危害性越大。为此,本实验选取油烟中醛类浓度发生突变的温度(180 ℃)作为油烟模拟系统的实验条件,以探究模拟油炸系统中黄酮化合物抗氧化活性改变的机制。
图2 加热温度对大豆油油烟中挥发性醛的影响
Fig.2 Effect of temperature on the concentration of aldehydes from heated soybean oil
注:图中不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。
2.2 加热过程中5种黄酮的含量变化
槲皮素、根皮素、芹菜素、EGCG和花旗松素在油脂加热过程中的含量变化如图3所示。5种黄酮类化合物均具有热敏性,随加热时间的延长,5种黄酮类化合物的质量浓度呈现下降趋势,在120 min时分别下降了23.16、22.51、27.03、34.50、5.08%,这说明多酚在加热过程中发生了损耗,这可能与其参与抗氧化反应有关。此外,还发现5种黄酮类化合物的热稳定性存在差异,按照热稳定性由大到小依次为花旗松素>根皮素>槲皮素>芹菜素>EGCG。有研究表明,多酚暴露在空气和高温环境中,还会发生挥发、热降解、热氧化、聚合、羟基化或亲核等一系列复杂反应[13],从而使多酚的质量浓度降低改变油脂抗氧化能力,这可能会导致其对脂肪酸氧化和油烟中醛的抑制作用发生改变。因此进一步检测其ABTS阳离子自由基清除能力,对油脂抗氧化活性随时间增长的变化进行量化。
图3 油脂加热过程中5种黄酮的含量变化
Fig.3 The changes of the content of 5 flavonoids during the heating process
2.3 加热过程中油脂抗氧化活性的变化
含有槲皮素、根皮素、芹菜素、EGCG和花旗松素的5种油脂加热过程中抗氧化活性变化如图4所示。随加热时间的延长,5种油脂的抗氧化活性均有不同程度的下降。但加热过程中,ABTS阳离子自由基清除率的变化规律与黄酮类化合物浓度的变化规律不太一致,随时间延长,EGCG质量浓度降低了34.50%,其油脂抗氧化活性降低程度较小,这说明EGCG的损耗可能主要是在油脂中转化为其他具有抗氧化活性的物质,例如差向异构化为没食子儿茶素没食子酸酯(gallocatechin gallate,GCG)或与活性羰基化合物形成衍生物[14-15]。而含有槲皮素、根皮素、芹菜素和花旗松素的油脂抗氧化活性均随黄酮类化合物质量浓度的降低而呈现下降的趋势,说明在热加工过程中黄酮化合物质量浓度的变化会显著影响油脂体系的抗氧化活性,质量浓度的降低并不是直接挥发所导致,可能是由于黄酮类化合物在热加工过程中降解为抗氧化活性与其相当或抗氧化活性较低的新物质。有研究表明,槲皮素在油脂热氧化过程中会与油脂中氧化的短链羧酸或脂肪酸反应,生成不易挥发的化合物,例如:槲皮素二聚体、酚酸、醌类和槲皮素脂肪酸酯[5,16],与槲皮素相比,这些化合物的化学抗氧化活性均有所降低[17],从而导致油脂抗氧化能力降低,进而导致槲皮素对油烟中醛和脂肪酸氧化的抑制作用随着加热时间延长而降低[4]。此外,ZHANG等[18]和WANG等[19]在研究槲皮素、葛根素和大豆苷元在油脂热加工过程中的化学变化时,也发现相同的规律,并且发现黄酮类化合物在油脂体系中同时形成了新的衍生物。由此可见,黄酮类化合物在高温条件下的降解和转化也是其损耗的主要因素。
图4 加热过程中5种油脂抗氧化活性的变化
Fig.4 The changes of antioxidant activity of five edible oils during heating process
2.4 5种油脂体系的细胞毒性
由于黄酮类化合物在油脂热氧化过程中转化产物的不确定性,本实验将油烟中醛抑制效果较好的五类黄酮类化合物:黄酮醇(槲皮素)、黄酮(芹菜素)、黄烷醇(花旗松素)、异黄酮(根皮素)及儿茶素类(EGCG)添加至大豆油中,在180 ℃条件下加热120 min,在HepG2细胞模型中的细胞毒性实验评估氧化油脂的安全性。与空白对照相比,5种氧化油脂处理的HepG2细胞如果存活率降低10%以上,则具有细胞毒性。结果如图5所示,含5种黄酮类化合物的氧化大豆油(200 μg/g 油)作用于HepG2细胞均未检测到细胞毒性,说明槲皮素、芹菜素、花旗松素、根皮素及EGCG在抑制油脂热氧化过程中产生的副产物细胞毒性低或细胞耐受性强,即这5种化合物可以抑制油烟中醛类的排放,并在120 min长时间加热的过程中并未产生有害物质。
图5 添加5种黄酮的油脂热氧化后对HepG2细胞存活率的影响
Fig.5 The effect of five oxidized lipids on the viability of HepG2 cells
2.5 亚油酸-黄酮体系中化学键分析
为更直观地分析模拟油炸系统中黄酮化合物抗氧化活性改变的趋势,本实验将大豆油中含量最高的亚油酸作为研究对象,在其中添加槲皮素和EGCG(浓度为0.5 mmol/mL),通过FTIR对不同加热时间下亚油酸-黄酮体系中化学键进行分析,并同时检测EGCG和槲皮素的浓度变化,结果如图6所示。
A-随加热时间延长亚油酸-EGCG体系中FTIR图谱变化;B-随加热时间延长亚油酸-EGCG体系中EGCG浓度变化;C-随加热时间延长亚油酸-槲皮素体系中FTIR图谱变化;D-随加热时间延长亚油酸-槲皮素体系中槲皮素浓度变化
图6 亚油酸-黄酮体系中化学键分析
Fig.6 Analysis of chemical bonds in linoleic acid-flavonoids system
如图6-B和6-D所示,EGCG和槲皮素的浓度均随着加热时间的延长呈现降低的趋势,且EGCG比槲皮素降低更明显。这与模拟油炸体系的结果一致。如图6-A和6-C所示,亚油酸体系中出现多个可代表其氧化降解的特征峰,其中3 664 cm-1处的峰形较为尖锐,符合游离羟基(O—H)的伸缩振动[20],3 009 cm-1表示顺式双键(
C—H)的伸缩振动,2 924 cm-1和2 858 cm-1处的尖峰分别表示亚油酸中亚甲基(CH2)官能团中C—H键的不对称和对称拉伸振动,顺式双键(CC)的伸缩振动与1 654 cm-1的峰值变化相关,羰基(CO)的伸缩振动与1 744 cm-1处峰值变化相关,1 465 cm-1和1 249 cm-1分别表示亚油酸CH3和CH2官能团中C—H键的弯曲震动,1 249 cm-1和1 051 cm-1分别代表C—O—C化学键的不对称伸缩和C—O键的伸缩,897 cm-1表示苯环C—H键的面外弯曲,724 cm-1亚油酸碳链中连续的亚甲基(—CH—)序列的整体摇摆振动[21]。
随着加热时间的延长总体信号模式相似,但其中显示亚油酸氧化的特征峰变化较明显。如3 664 cm-1处的峰值变化显示,在亚油酸中添加槲皮素和EGCG后,随加热时间的延长吸收峰强度逐渐增强,即游离羟基(O—H)含量不断累积。这可能是由于亚油酸自由基链式反应中会生成氢过氧化物(ROOH)后,在二级氧化阶段由氢过氧化物裂解成醇、酸、醛等次级氧化产物,不易挥发的长链醇随加热时间的延长出现叠加效应,从而导致游离羟基特征峰强度的持续增加。此外与槲皮素组相比,EGCG组变化较显著,反映出槲皮素抑制脂肪酸热氧化效果较好,但均随加热时间的延长抑制效果逐渐减弱;2 924 cm-1和2 858 cm-1吸收峰值取决于脂肪酸的饱和度,结果显示随着加热时间的延长,亚油酸由于高度氧化导致其饱和度增加,其中槲皮素比EGCG抑制脂肪酸高度氧化的效果更佳;1 744 cm-1处峰值变化结果显示,在亚油酸中添加槲皮素和EGCG可有效抑制该处峰值的变化,即抑制醛酮类活性羰基化合物的产生,这与ZHANGF等[22]的结果一致;1 654 cm-1处代表亚油酸不饱和双键以及醌类的响应值,结果显示槲皮素组在该处的吸收峰值略有增加,一方面是由于槲皮素抑制亚油酸热氧化过程中不饱和双键的断裂,这与姚磊等[23]的研究结果一致,另一方面可能是槲皮素氧化产物(醌)积累的叠加效应;而EGCG组该处峰值吸收度随加热时间延长逐渐下降,表示部分亚油酸发生深度氧化和聚合,导致双键断裂,且EGCG氧化裂解后生成的没食子酸等难以形成稳定的醌类积聚以补偿该处峰值的损失。1 249 cm-1和1 051 cm-1处的吸收峰强度也随加热时间的延长而增加,可能是由于随着亚油酸在高温下发生氧化聚合生成醚键及部分酯键,或者氧化断裂生成不易挥发的醇类终产物,也有研究指出,多酚会与脂肪酸发生亲核加成反应,生成酯键[24],或者与亚油酸氧化中间产物醛酮类化合物通过迈克尔加成形成稳定的缩醛,也会导致这两个峰值吸收度增加,这类化合物的抗氧化性往往低于多酚,可能导致体系抗氧化活性降低。综上,在模拟油烟系统中亚油酸氧化、聚合或降解生成氢过氧化物,添加槲皮素和EGCG可抑制部分亚油酸双键的断裂抑制醛类物质的产生,导致其浓度降低。此外可能还会通过与脂肪酸或者其氧化中间产物发生加成反应形成酯类物质抑制醛类物质的产生,导致其抗氧化活性改变。为此本实验收集加热150 min后的槲皮素样品,通过UPLC-Q-TOF-MS/MS分析模拟油炸系统中黄酮类化合物抗氧化活性改变的机制。
2.6 热处理后槲皮素的变化
UPLC-Q-TOF-MS-MS的结果如图7所示,亚油酸体系中槲皮素在经过150 min加热后,出现3个新的峰,将其标注为A(m/z 727.152 2 [M-H]-)(图8-A)、B(m/z 389.002 0 [M-H]-)(图8-B)和C(m/z 631.109 7[M-H]-)(图8-C)3个物质。A物质主要的子离子有363.0726 [M-H]-、331.046 2 [M-H]-、301.035 0 [M-H]-和61.988 5 [-H]-(图8);B物质主要的子离子有301.035 5 [M-H]-、285.041 0 [M-H]-和88.983 0 [M-H]-(图9);C物质主要的子离子有315.051 6 [M-H]-、301.035 6 [M-H]-和285.040 8 [M-H]-(图8-C)。
图7 热处理后槲皮素的变化
Fig.7 Changes of quercetin after heat treatment
A-化合物A;B-化合物B;C-化合物C
图8 亚油酸体系中槲皮素经热处理后新物质的MS/MS谱图
Fig.8 MS/MS spectra of three new compounds derived from quercetin after thermal treatment in the linoleic acid system
A物质的质荷比(m/z)为727.152 2 [M-H]-,可能是由分子质量为364的物质在电喷雾离子源中形成的二聚体[2M-H]-,二聚体通常会首先断裂成单体,因此产生了极强的m/z 363.072 6 [M-H]-信号,即A物质的分子质量约为364。目标物通过丢失CH3OH得到二级碎片离子331.046 2 [M-H]-,说明A物质中含有甲氧基(—OCH3),301.035 2 [M-H]-为槲皮素的特征离子,结合A物质的分子质量,推测其结构为槲皮素与分子质量为62的乙二醇发生加成反应生成槲皮素-乙二醇加合物,为溶剂杂质。
B物质的质荷比(m/z)为389.002 0 [M-H]-,母离子通过丢失分子质量为88的物质得到槲皮素的特征离子301.035 5 [M-H]-和285.041 0 [M-H]-,说明B物质分子质量约为390,可由槲皮素与分子质量为88(C4H8O2)的醛或酮发生迈克尔加成反应,然后醛的羟基和CO羰基之间形成半缩醛基团,从而形成稳定的羰基-苯酚加合物。B物质形成与傅里叶变换红外光谱中的推测结果一致,槲皮素与脂肪酸中间产物发生加成反应形成酯类物质抑制醛类物质的产生,但由于其抗体氧化能力的降低,亚油酸加热体系的抗氧化能力也会降低。
C物质的质荷比(m/z)为631.109 7 [M-H]-,可能是由分子质量为316的物质在电喷雾离子源中形成的二聚体[2M-H]-,因此产生了极强的m/z 315.051 6 [M-H]-信号,继续脱去CH3得到槲皮素的特征离子301.035 6 [M-H]-和285.040 8 [M-H]-,说明C物质由槲皮素甲基化而来,与此相对应的结构为异鼠李素,C物质可能由槲皮素杂质引入。
综上,亚油酸体系中,部分槲皮素在180 ℃加热条件下可与亚油酸氧化中间产物醛或酮(C4H8O2)发生迈克尔加成反应,转化为羰基-苯酚加合物,且加合物的抗氧化性低于槲皮素,从而导致其抗氧化活性降低。
3 结论
本研究探究了在模拟油炸体系中黄酮类化合物抗氧化活性改变的机制。槲皮素、根皮素、芹菜素、EGCG和花旗松素均表现出显著的热不稳定性,浓度和抗氧化性均随加热时间的延长而降低,但并未衍生出具有细胞毒性的副产物,确立了其在高温食品加工中应用的安全性基础。此外,通过傅里叶变换红外光谱和UPLC-Q-TOF-MS/MS确定槲皮素在高温下可能通过迈克尔加成反应与亚油酸氧化的C4中间体(短链醛/酮),转化为抗氧化能力较弱的羰基-苯酚加合物(m/z为389.002 0 [M-H]-)。黄酮化合物可作为安全的油脂抗氧化剂,高温诱导的化学损耗和低抗氧化活性的羰基-苯酚加合物的生成是导致其在油炸体系中抗氧化活性衰减的主要机制。为天然抗氧化剂在油脂热加工中的稳定性调控及安全性评价提供了坚实的理论支撑与科学依据。
[1] GAO Y, XIA W, SHAO P, et al.Impact of thermal processing on dietary flavonoids[J].Current Opinion in Food Science, 2022, 48:100915.
[2] LANG Y X, GAO N X, ZANG Z H, et al.Classification and antioxidant assays of polyphenols:A review[J].Journal of Future Foods, 2024, 4(3):193-204.
[3] 付贵, 樊震宇, 孙亚婷, 等.烹饪油烟中醛类形成的影响因素以及防控技术研究进展[J].食品科学, 2024, 45(10):298-309.FU G, FAN Z Y, SUN Y T, et al.Research progress on influential factors of and control technologies for aldehyde formation in cooking oil fume[J].Food Science, 2024, 45(10):298-309.
[4] FAN Z Y, WANG L, JIANG Q Q, et al.Effects of quercetin on emissions of aldehydes from heated docosahexaenoic acid (DHA)-fortified soybean oil[J].Journal of Hazardous Materials, 2023, 442:130134.
[5] XU X Q, LIU A M, HU S Y, et al.Synthetic phenolic antioxidants:Metabolism, hazards and mechanism of action[J].Food Chemistry, 2021, 353:129488.
[6] JIANG X Y, LV H F, LU Y, et al.Trapping of acrolein by curcumin and the synergistic inhibition effect of curcumin combined with quercetin[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2021, 69(1):294-301.
[7] FU G, LI Y F, FAN F Y, et al.Genistein-7-O-octanoate, a lipophilized genistein, exhibits antioxidant activity through activating the Nrf2 signaling pathway in Caco-2 cells[J].Journal of Functional Foods, 2024, 119:106338.
[8] LIU Y, WANG J H, PI Y M, et al.The chemical components and adhesion performance of the oil fume fouling sourced from cooking:Experimental investigation and molecular simulation[J].Journal of Industrial and Engineering Chemistry, 2025, 146:456-467.
[9] ANCUCEANU R, ANGHEL A I, HOVANET M V, et al.Antioxidant activity of essential oils from Pinaceae species[J].Antioxidants, 2024, 13(3):286.
[10] ZHANG D C, LIU J J, JIA L Z, et al.Speciation of VOCs in the cooking fumes from five edible oils and their corresponding health risk assessments[J].Atmospheric Environment, 2019, 211:6-17.
[11] ZHUANG Y, DONG J, HE X M, et al.Impact of heating temperature and fatty acid type on the formation of lipid oxidation products during thermal processing[J].Frontiers in Nutrition, 2022, 9:913297.
[12] ADENIRAN J A, YUSUF R O, ABDULKADIR M O, et al.Evaporation rates and pollutants emission from heated cooking oils and influencing factors[J].Environmental Pollution, 2020, 266:115169.
[13] ZHANG Q, SALEH A S M, SHEN Q.Monitoring of changes in composition of soybean oil during deep-fat frying with different food types[J].Journal of the American Oil Chemists’ Society, 2016, 93(1):69-81.
[14] XIAO J B.Recent advances on the stability of dietary polyphenols[J].eFood, 2022, 3(3):e21.
[15] ZHU Q, LIANG C P, CHENG K W, et al.Trapping effects of green and black tea extracts on peroxidation-derived carbonyl substances of seal blubber oil[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2009, 57(3):1065-1069.
[16] LIN S Y, ZHANG H L, SIMAL-GANDARA J, et al.Investigation of new products of quercetin formed in boiling water via UPLC-Q-TOF-MS-MS analysis[J].Food Chemistry, 2022, 386:132747.
[17] TROISE A D, FIORE A, COLANTUONO A, et al.Effect of olive mill wastewater phenol compounds on reactive carbonyl species and Maillard reaction end-products in ultrahigh-temperature-treated milk[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2014, 62(41):10092-10100.
[18] ZHANG X, NI L, ZHU Y M, et al.Quercetin inhibited the formation of lipid oxidation products in thermally treated soybean oil by trapping intermediates[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2021, 69(11):3479-3488.
[19] WANG R, TAO M R, ZHU Y M, et al.Puerarin inhibited 3-chloropropane-1, 2-diol fatty acid esters formation by reacting with glycidol and glycidyl esters[J].Food Chemistry, 2021, 358:129843.
[20] DAI F W, ZHUANG Q Y, HUANG G, et al.Infrared spectrum characteristics and quantification of OH groups in coal[J].ACS Omega, 2023, 8(19):17064-17076.
[21] OZULKU G, YILDIRIM R M, TOKER O S, et al.Rapid detection of adulteration of cold pressed sesame oil adultered with hazelnut, canola, and sunflower oils using ATR-FTIR spectroscopy combined with chemometric[J].Food Control, 2017, 82:212-216.
[22] ZHANG Y F, FAN Z Y, FAN D M, et al.The structure-activity relationship of flavonoids in inhibiting aldehyde emissions from heated soybean oil[J].ACS Food Science &Technology, 2025, 5(6):2362-2370.
[23] 姚磊,付贵,韩昕苑,等.茶多酚对加热大豆油油烟中醛类物质释放的影响[J].食品与发酵工业, 2025.https://doi.org/10.13995/j.cnki.11-1802/ts.045694.YAO L, FU G, HAN X Y, et al.Effect of tea polyphenols on emission of aldehydes in soybean oil fumes during heating[J].Food and Fermentation Industries, 2025.https://doi.org/10.13995/j.cnki.11-1802/ts.045694.
[24] GEMINGNUER A, WANG H L, LIU Y, et al.Genistein nanopreparations:Recent advances in preparation, bioactivities, and applications[J].Journal of Cluster Science, 2025, 36(6):236.