植物乳植杆菌KSFY01对抗生素相关性腹泻的作用及肠道菌群影响研究

抗生素作为一种合理的治疗策略被广泛用于治疗各种临床科室的感染,然而,目前滥用抗生素已成为一个全球性问题[1]。长期普遍使用抗生素不仅导致细菌耐药性、造成临床环境的抗生素耐药基因的污染,还会增加临床并发症的风险,比如导致神经系统、造血系统、口腔,尤其是胃肠道等相关性疾病[2]。长期或大剂量使用抗生素,杀灭或抑制肠道内对药物敏感的菌群,留存耐药性的菌群大量繁殖,条件致病菌转变为致病菌,最终导致肠道菌群紊乱失调并对于宿主细胞产生直接损伤,引起宿主一系列的病理变化,如抗生素相关性腹泻(antibiotic-associated diarrhea,AAD)、炎症性肠病、易激惹综合征和艰难梭菌结肠炎等胃肠道疾病,甚至通过肠肝轴及肠脑轴作用的肝脑疾病导致全身性免疫疾病[3]。其中,AAD是抗生素治疗最常见的副作用,各种抗生素均可能引起AAD,尤其是头孢菌素、β-内酰胺类、克林霉素、氨基青霉素和第3代先锋霉素等抗生素的AAD发生率较高[4]。不同的抗生素在不同年龄以及身体状况的患者身上所导致AAD的发生率不同,一般为5%～39%[5]。研究表明AAD患者的肠道菌群发生了显著改变,肠道短链脂肪酸(short-chain fatty acids,SCFA)浓度降低,肠道碳水化合物和结肠胆汁酸积累,水分吸收改变,最终导致腹泻;AAD不仅引起简单的腹泻,也可能发展为肠炎或者伪膜性结肠炎(pseudomembranous colitis,PMC),甚至严重的并发症包括低钾血症、肾衰竭、中毒性巨结肠、结肠穿孔和休克[4]。肠道菌群紊乱还会导致其他疾病的发生发展,而这些疾病可以通过益生菌的调节作用而逆转,即益生菌可以改变肠道菌群并导致菌群代谢物的形成从而影响健康。

目前,AAD尚无理想的治疗药物,窄谱抗生素及微生物制剂虽是治疗AAD的首选,但疗效并不理想,比如像万古霉素、头孢菌素类抗生素等甚至也是导致 AAD的原因之一,在治疗/诱发AAD中有双重作用[6]。目前已有相关临床以及动物实验研究证明特定种属,包括乳杆菌、酵母菌和双歧杆菌等可有效、安全地预防婴幼儿和老年患者AAD的发生,可作为AAD的选择性预防方案[7]。但是微生态制剂也存在影响有益菌定植和生长,从而导致疗效不稳定的问题,因此所用菌株的安全性及有效性还有待更多证据确认,并且可用的益生菌资源匮乏,因此,寻找开发作用稳定的更多优良益生菌株改善肠道菌群及AAD具有重要的意义。

新疆地区作为我国少数民族的聚居地,独特的地理、环境与气候条件,孕育了繁荣的畜牧养殖业。丰富的奶资源为当地牧民开展乳制品手工加工提供了充足原料,尤其是游牧民族,保留着自制酸乳的传统。这些手工酸乳地域特色鲜明,风味独特,微生物结构丰富,堪称益生菌菌株的天然宝库,具有极高的研究与应用价值。植物乳植杆菌(Lactiplantibacillus plantarum)作为乳酸菌的重要成员,广泛分布于发酵乳制品、肉类及蔬菜等各类环境中,同时也是人体胃肠道内的重要益生菌群;植物乳植杆菌可能通过调节肠道微生态平衡,促进有益菌群生长,抑制有害菌繁殖,维护肠道健康,研究证明其可辅助抗生素治疗,有效缓解AAD等副作用[8]。

因此,本研究从新疆传统发酵乳来源的乳酸菌资源库中筛选并获得一株具备优良体外益生特性的植物乳植杆菌。通过构建小鼠AAD模型,用该菌株对 AAD 小鼠进行干预,系统评价其对 AAD 的改善效应及对小鼠肠道菌群结构的调控作用,进而初步阐明其潜在作用机制。研究旨在为抗 AAD 益生菌功能性食品的研发提供候选菌株及科学理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

L.plantarum KSFY01由新疆维吾尔自治区喀什地区牧民家中自然发酵乳分离纯化而来,进行基因测序鉴定后保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心(保藏编号:15654)。

氨苄青霉素A9518-25G-9、万古霉素V2002-250MG、新霉素/硫酸新霉素N6386-5G、克林霉素C5269-50MG,Sigma-Aldrich公司;异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate,FITC)标记葡聚糖(FITC-Dextran)(HY-128868A),MedChemExpress公司;紧密连接蛋白1(zonula occludens-1,ZO-1)抗体兔抗鼠(14-9776-80),Thermo Fisher Scientific公司;荧光二抗FITC Goat anti-rabbit IgG(GR200G-02C),天津三箭公司;IL-6、IL-10、TNF-α、干扰素-γ(Interferon-gamma,IFN-γ)、酶联免疫吸附(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)试剂盒,上海酶联生物科技有限公司;粪便 DNA 提取试剂盒(DP328),中国北京天根生物科技;其余试剂均为国产生化试剂或分析纯。

1.2 仪器与设备

6D45415正置显微镜,日本奥林巴斯仪器有限公司;Bioprep-24生物样品均质仪、Nano-300微量分光光度计,杭州奥盛仪器有限公司;A200梯度PCR仪,杭州朗基科学仪器有限公司;VLBL0TD1多功能酶标仪、StepOnePlus Real-Time PCR System,赛默飞世尔科技(苏州)有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 动物实验设计

实验用雄性BALB/c小鼠(SPF级,雄性,9周龄)购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司,本动物实验经动物实验伦理委员会批准,批准号:2022092301B。所有小鼠在恒温恒湿的循环光照环境中适应性饲养1周后随机分为4组,每组6只:正常组、抗生素模型组、抗生素+德氏乳杆菌保加利亚亚种干预组(LB组)以及抗生素+L.plantarum KSFY01干预组(KSFY01组)。LB组以及KSFY01组小鼠分别按1×109 CFU/kg的剂量灌胃菌悬液,其余2组灌胃用同等体积的PBS,总共持续2周,其中从第2周开始建立AAD模型,除正常组外其他3组灌胃相应菌液之后,分别灌PBS配置的抗生素混合液:氨苄青霉素(1 mg/mL)、万古霉素(0.5 mg/mL)、新霉素(1 mg/mL)、克林霉素(400 mg/kg)混合抗生素溶液,0.2 mL/只,连续7 d。在实验过程中观察各组小鼠状态,每天称量并记录小鼠体质量、饮水和摄食变化,记录排便次数并观察粪便变化及干湿重比。

1.3.2 体质量及脏器指数测定

每天观察小鼠状态及毛发,称质量记录每只小鼠体质量,实验结束后脱颈处死实验小鼠,取实验小鼠脾脏、胸腺组织称重,小鼠脏器指数的计算如公式(1)所示:

1.3.3 粪便评分及含水量

造模结束时,出现软便、水样便、黏液便视为腹泻。给予抗生素最后1 d观察 120 min 内粪便输出质量、粪便含水量评估小鼠的腹泻情况。粪便含水量的计算如公式(2)所示:

1.3.4 小鼠血清中炎症相关因子水平测定

实验结束前,小鼠禁食不禁水12 h后,于眼球收集小鼠全血样本,将收集的血液在37 ℃静置2 h后于3 000 r/min、4 ℃离心15 min后分离上层血清,分装后置于-20 ℃冰箱中备用。根据ELISA试剂盒说明书,测定小鼠血清中IL-6、IL-10、TNF-α、INF-γ水平。

1.3.5 肠道组织病理学观察及肠道屏障通透性检测

苏木精-伊红(hematoxylin and eosin,H&E)染色:截取新鲜近端结肠组织,40 g/L多聚甲醛固定过夜后石蜡包埋切片,厚4 μm,后经H&E染色,光学显微镜下观察拍照。

免疫组化:先将组织用10%(体积分数)中性福尔马林固定12～24 h,后经过脱水、透明、浸蜡等步骤,然后用石蜡包埋组织,制成蜡块。用切片机将蜡块切成4 μm薄片,捞片至载玻片上,放入60～65 ℃烘箱中烤片1～2 h,使切片牢固地粘贴在载玻片上。将切片用抗原修复液(柠檬酸缓冲液,pH 6.0)修复后进行内源性过氧化物酶阻断,之后用正常血清兔血清进行封闭,将ZO-1一抗按1∶500稀释后于4 ℃孵育过夜,用 PBS缓慢冲洗后用辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)标记的二抗于室温下避光孵育1～2 h,PBS清洗后进行双花扁豆凝集素(dolichos biflorus agglutinin,DBA)显色反应,最后用苏木精对细胞核进行复染使细胞核呈蓝色;最后经过酒精梯度脱水、二甲苯透明后中性树胶封片,并在光学显微镜下观察拍照。

采用FITC-Dextran (4 kDa)法测定回肠上皮屏障通透性:于实验最后 1 d取材前 3 h,对所有小鼠以 80 mg/mL的质量浓度灌胃给予溶解于PBS的FITC-Dextran溶液,灌胃体积为 0.15 mL/只。随后采集小鼠血清样本,在激发波长 485 nm、发射波长 535 nm 条件下检测其荧光强度,以反映肠道屏障通透性水平。

1.3.6 16S rRNA基因测序分析微生物群组成

实验结束取材之前,无菌采集粪便标本。样本立即在液氮中快速冷冻,然后保存在-80 ℃中。粪便 DNA提取试剂盒提取粪便DNA,测定DNA的浓度和纯度后,选择针对16S rRNA基因的特定可变区的引物进行PCR扩增;采用凝胶回收试剂盒对PCR扩增产物进行纯化后再次通过核酸检测仪测定浓度和纯度;然后进行文库构建及使用Illumina MiSeq高通量测序平台对构建好的文库进行测序;最后在云数据平台进行数据分析,进行序列比对,物种分类鉴定以及多样性和差异分析。

1.4 数据分析

所有数据均表示为“平均值±标准差”,采用GraphPad 9.3.1中的one-way ANOVA进行显著性分析以及绘图,图表中不同小写字母表示经Duncan多量程检验差异有统计学意义(P<0.05)。

2 结果与分析

2.1 KSFY01对小鼠一般体征及脏器指数的影响

造模期间,正常组体质量增长最显著,其余组前5 d体质量下降明显,随后缓慢回升,模型组增重最少,LB和KSFY01组次之(图1-A)。除正常组外,其余各组小鼠经混合抗生素干预后均出现腹泻,其中模型组最严重。第7天时,正常组粪便成型、质地较硬;模型组粪便呈松散黏液状(图1-D),含水量显著增高(P<0.05);LB组和KSFY01组粪便较模型组更成型,且KSFY01组含水量与正常组无差异(图1-F)。模型组粪便评分最高,LB组和KSFY01组可显著降低评分(P<0.05)(图1-E)。造模结束时,模型组腹泻率达100%,表明AAD模型成功建立。恢复期除模型组外,其余组体质量显著增加及粪便含水量降低。

与正常组相比,模型组脾脏指数显著升高(P<0.05),胸腺指数显著降低(P<0.05),提示抗生素具有抑制免疫功能。KSFY01干预可显著缓解脾脏指数升高及胸腺指数降低(P<0.05),LB组效果次之(图1-B、图1-C)。

2.2 KSFY01对小鼠血清炎症因子水平的影响

为评价各组小鼠的全身炎性状况及KSFY01的抗炎作用,检测了血清中炎症相关细胞因子水平,如图2所示。与正常组比较,抗生素模型组小鼠IL-6、IFN-γ、TNF-α促炎因子水平升高(P<0.05),IL-10抗炎因子水平显著降低(P<0.05),提示混合抗生素可导致炎症反应,增加促炎因子的分泌。与模型组相比,LB和KSFY01处理均降低了TNF-α、IFN-γ和IL-6细胞因子含量,其中KSFY01组对IL-6含量影响比LB组更显著(P<0.05)。且KSFY01处理显著提高了IL-10的含量(P<0.05),效果优于LB组。

2.3 KSFY01对小鼠结肠组织病理学及肠道屏障功能的影响

由病理学切片H&E染色可知(图3-A),正常组小鼠的结肠组织学特征正常,黏膜上皮细胞完整,隐窝正常,腺体排列整齐;模型组小鼠结肠显示黏膜层有大量炎性细胞浸润(黑色圆圈),肠腔变大黏膜层破坏(黑色箭头),肠壁平滑肌及浆膜层变薄(黑色虚线)等明显病理学变化;LB组和KSFY01组可见轻度炎性细胞浸润,KSFY01程度较模型组病理改变明显减轻。

利用FITC-Dextran在血浆中的荧光强度反映肠道组织的通透性,结果显示(图3-C),模型组的荧光强度显著高于正常组(P<0.05),显示小肠通透性增高,屏障功能受损,LB组和KSFY01组通透性中度,比模型组有所减轻;且回肠组织ZO-1免疫组化染色及阳性面积统计结果显示(图3-B、图3-D),模型组的棕黄色阳性表达比正常组弱,而KSFY01能显著抑制抗生素导致的ZO-1蛋白表达的减少(P<0.05),缓解肠道屏障损伤,LB组效果次之。

2.4 KSFY01调节AAD小鼠肠道菌群失调

2.4.1 α多样性指数分析

采用α多样性分析方法对样本内的物种丰富度和均匀度进行了评价。本实验从ACE、Chao、Shannon指数进行评价,各组的良好覆盖指数均大于0.999,说明样本测序结果具有良好的完整性和可靠性。如图4-A、图4-B、图4-C所示,与正常组相比,抗生素模型组ACE、Chao、Simpson指数显著降低(P<0.05),KSFY01和LB干预分别抑制了抗生素导致的ACE、Chao、Shannon指数下降,且KSFY01组与正常组无显著差异,效果优于LB组,尤其是对于ACE指标。说明KSFY01可以明显改善抗生素对菌落丰富度和均匀度的影响。

2.4.2 β多样性指数分析

采用基于加权Unifrac距离矩阵的主坐标分析(principal co-ordinates analysis,PCoA)研究样本群落组成的相似性或差异性,如可视化的散点图(图4-D)所示,模型组与正常对照组距离较远,群落组成差异显著(P<0.05)且模型组离散性较高,KSFY01和LB组均可以拉近与正常组的距离,且KSFY01组比LB组群落组成更集中。基于Kruskal-Wallis检验的β多样性差异分析箱线图(图-E)显示了不同组样本距离值差异,正常组内β多样性相对较小,群落组成或结构较为相似;模型组距离值高于正常组,样本内部β多样性有所增加,与正常组群落结构等差异更明显,可能模型构建引发了群落变化;LB组距离值在4组中最高,箱体上移,表明该组样本β多样性大,群落组成或结构离散程度高,LB 干预后群落变化特点与其他组不同;而KSFY01组距离值处于中间位置,证明KSFY01有调节群落结构、降低β多样性离散程度的作用。

2.4.3 菌群失调指数(microbial dysbiosis index,MDI)

采用肠道MDI确定微生物生态失调的程度,MDI值越大菌群紊乱的程度越大。如图4-F所示,KSFY01和LB能在一定程度上改善抗生素导致的肠道菌群紊乱,KSFY01组效果略好于LB组。通过对正常组与模型组进行候选物种筛选后,发现罗斯伯里氏菌属(g__Roseburia)、短链梭菌属(g__Lachnoclostridium)、粘液螺旋菌属(g__Mucispirillum)、厌氧梭菌属(g__Anaerostipes)、布劳特氏菌属(g__Blautia)、厌氧菌属(g__Anaeroplasma)等在模型组升高了10～226倍。

2.4.4 肠道菌群群落组成分析

采用群落柱状图和Heatmap图展示各组中优势物种微生物群落,直观观察物种在不同分组中的变化趋势。结果显示(图5),各组肠道微生物物种的相对丰度发生了显著变化。

在门水平上(图5-A),所有类群主要由拟杆菌门(p__Bacteroidota)、厚壁菌门(p__Firmicutes)、变形菌门(p__Proteobacteria)、弯曲杆菌门(p__Campylobacterota)、脱硫杆菌门(p__Desulfobacterota)、放线菌门(p__Actinobacteriota)、疣微菌门(p__Verrucomicrobiota)、髌骨细菌门(p__Patescibacteria)组成,其中p__Firmicutes、p__Bacteroidota和 p__Proteobacteria是肠道的优势菌群代表。正常组中p__Bacteroidota、p__Firmicutes相对丰度分别为48.23%和47.35%,而模型组p__Bacteroidota显著上升至52.35%,p__Firmicutes下降至24.73%,优势菌群丰度发生了显著变化。LB组和KSFY01干预明显改善了抗生素导致的肠道p__Bacteroidota、p__Firmicutes丰度变化,恢复至与正常组菌群丰度相似(两者分别为LB:45.88%,45.07%;KSFY01:44.52%,48.8%)。

在属水平上,不同群体的相对丰度差异如图5-B所示,与正常组相比,模型组g__norank_f__Muribaculaceae及异杆菌属(g__Allobaculum)显著下降,拟杆菌属(g__Bacteroides)、副拟杆菌属(g__Parabacteroides)、克雷伯菌属(g__Klebsiella)显著增多,而LB组和KSFY01组能显著改善抗生素导致的g__norank_f__Muribaculaceae下降,并显著增加g__unclassified_f__Lachnospiraceae、乳杆菌属(g__Lactobacillus),降低g__Bacteroides、g__Parabacteroides、g__Klebsiella,调整菌群结构。

2.4.5 物种差异分析

多组间单因素方差分析结果(图6-A)从属水平显示了4组之间有显著差异的菌种,其中KSFY01能非常显著的降低抗生素导致的g__Parabacteroides、丹毒丝菌属(g__Erysipelatoclostridium)的增多,提高肠杆菌属(g__Enterorhabdus)、g__Lactobacillus、气味杆菌属(g__Odoribacter),平衡肠道菌群。其中差异最大的菌属为g__Parabacteroides。

采用线性判别分析效应大小(linear discriminant analysis effect size,LEfSe)方法(图6-C),在从门到属多个层级进行物种差异判别分析,以筛选组间差异显著的物种;并用线性判别分析得分(linear discriminant analysis score,LDA)值(图6-B)来量化各物种对组间差异的贡献程度,用以提示该物种可能在疾病的发生发展过程中起到关键的作用。此分析也可作为寻找疾病组与健康组biomarker的方式之一。结果显示4个组间主要微生物存在显著差异,正常组优势菌种为丹毒丝菌科(f__Erysipelotrichaceae)、丹毒丝菌目(o__Erysipelotrichales)、芽孢杆菌纲(c__Bacilli)等;模型组优势菌种为p__Proteobacteria、γ-变形菌纲(c__Gammaproteobacteria)、肠杆菌科(f__Enterobacteriaceae)、肠杆菌目(o__Enterobacterales)、g__Klebsiella等;LB组优势菌种为乳杆菌目(o__Lactobacillales)、乳杆菌科(f__Lactobacillaceae)、g__Lactobacillus;KSFY01组优势菌种为梭菌纲(c__Clostridia)、毛螺菌目(o__Lachnospirales)、毛螺菌科(f__Lachnospiraceae)等。

3 讨论

AAD为与使用抗生素相关且没有其他明确病因的腹泻,是抗生素临床治疗中最常见的不良事件之一。统计资料显示,使用氨苄青霉素患者中AAD的发生率为5%～10%,使用羟氨苄青霉素-克拉维酸钾的为10%～25%,使用头孢菌素的为15%～20%,使用先锋霉素类、氟喹诺酮类、阿奇霉素、克拉霉素、红霉素、四环素的为2%～5%[9]。益生菌因其预防和治疗AAD的能力而受到广泛认可,尤其是植物乳植杆菌有望成为应对AAD的优势菌种。本研究选用了4种(氨苄青霉素、万古霉素、新霉素、克林霉素)具有不同抗菌机制的抗生素,针对不同类型的肠道微生物,建立了抗生素混合液诱导的腹泻模型,探讨了植物乳植杆菌KSFY01对AAD的效果及其潜在机制。

本研究结果显示,除正常组外,其余各组小鼠在混合抗生素给药后均表现出典型的腹泻症状,包括排便次数增加、粪便含水量升高及精神状态萎靡,其中模型组症状最为严重,证实AAD模型构建成功。造模过程中各组小鼠体质量变化趋势存在显著差异,提示抗生素干预抑制了小鼠的进食和正常生长发育,KSFY01及LB干预组小鼠体质量下降幅度低于模型组,且在恢复期表现出更快的体质量回升趋势,表明这2种干预措施可能通过改善肠道功能促进了机体的恢复。粪便形态分析进一步揭示了不同干预措施对腹泻症状的缓解效果。模型组小鼠粪便呈黏液状、不成型且含水量显著升高,与临床AAD患者的病理特征高度一致[10]。相比之下,KSFY01及LB干预组粪便成型度及含水量显著改善,其中KSFY01组的粪便性状与正常组无统计学差异,且2组粪便评分均显著低于模型组(P<0.05)。这一结果提示,KSFY01可能通过调节肠道菌群平衡或增强肠道屏障功能,有效缓解了抗生素导致的肠道稳态失衡,本研究后续结果也证实了这一点。免疫器官指数变化为阐明干预机制提供了重要线索。模型组脾脏指数显著升高而胸腺指数显著降低(P<0.05),反映了混合抗生素对免疫系统的双重影响:一方面可能通过诱导炎症反应导致脾脏代偿性增生,另一方面则可能直接抑制胸腺的免疫功能。KSFY01干预显著逆转了这种免疫失衡状态(P<0.05),表明灌胃益生菌可能通过调控Th1/Th2免疫平衡或促进T细胞分化,从而减轻抗生素的免疫抑制效应。这一发现与既往研究报道的益生菌免疫调节作用相符,比如嗜热链球菌菌株能够调节各种人类细胞系的免疫反应,但KSFY01的独特菌株特异性可能赋予其更高效的免疫保护特性,有进一步研究价值[11]。

本研究通过检测血清炎症因子水平,评估了KSFY01对混合抗生素诱导的小鼠全身炎症反应的作用。细胞因子是炎症细胞释放的主要信号分子,参与多种功能。临床研究表明,AAD表现为明显的全身炎症反应,血清中促炎因子增加而抗炎因子水平降低[12]。LING等[13]研究指出,丁酸梭菌和长双歧杆菌婴儿亚种可以通过将 IL-10、IFN-γ 和 TNF-α恢复到正常水平来缓解AAD小鼠的全身炎症。L.plantarum H-6可显著降低盐酸林可霉素诱导的小鼠AAD模型结肠组织中IL-1β、IL-6等促炎因子的表达[14]。植物乳植杆菌ELF051可下调阿莫西林、克林霉素和链霉素三联抗生素诱导的AAD小鼠IL-1β和TNF-α水平,降低炎症相关蛋白含量,上调IL-10水平[15]。与以上研究结果一致,本研究结果显示模型组小鼠血清中促炎因子IL-6、IFN-γ和TNF-α水平显著升高(P<0.05),而抗炎因子IL-10水平显著降低(P<0.05),证实混合抗生素诱导了系统性炎症反应。这一发现与既往研究报道的AAD患者血清中促炎因子水平升高的现象一致,提示炎症因子级联反应可能在AAD的病理过程中发挥重要作用。KSFY01干预显著降低了IL-6、IFN-γ和TNF-α的水平(P<0.05),并显著提高了IL-10的表达(P<0.05)提示KSFY01可能通过抑制促炎因子的释放及增强抗炎因子的分泌,有效缓解了抗生素诱导的系统性炎症反应,为KSFY01的抗炎机制提供了基础。

为了初步探索KSFY01改善AAD模型小鼠粪便性状、降低肠道炎症及调节免疫器官等的机制,本研究首先研究了结肠的病理变化、屏障功能。本研究表明,模型组小鼠结肠组织表现出典型的炎症反应,包括大量炎性细胞浸润、黏膜层破坏及肠壁结构变薄;血液中FITC-Dextran证明了小肠通透性显著增加(P<0.05),表明抗生素破坏了肠道屏障的完整性,这一结果与ZO-1的表达变化一致,模型组ZO-1蛋白表达显著减少,反映了抗生素对肠道紧密连接结构的破坏。抗生素导致的肠道病理变化可能会诱发结肠炎,甚至出血性腹泻,以上结果与AAD相关的肠道炎症及屏障功能损伤的病理特征一致[16]。KSFY01干预组结肠组织炎症程度显著减轻,KSFY01显著降低了肠道通透性以及提高了ZO-1蛋白的表达(P<0.05),接近正常组水平,提示其可能通过抑制炎症细胞浸润及促进组织修复、增强肠道屏障功能、减少肠道内容物泄漏及系统性炎症反应,从而最终对混合抗生素诱导的AAD小鼠起到显著的保护作用。有研究表明食用乳酸杆菌混合物(JUP-Y4)可以通过促进抗生素诱导的肠道菌群失调的恢复,从而增强肠道屏障的功能,降低小鼠循环内毒素的水平[17]。

进一步检测了小鼠粪便微生物,反应抗生素以及益生菌干预对肠道菌群结构变化的影响和差异。通过α-多样性指数分析、β-多样性指数分析、菌群MDI指数评估以及肠道菌群群落组成分析,本研究发现抗生素破坏了肠道菌群的丰富度和均匀度,抗生素模型组菌群严重失调;KSFY01能够显著改善由抗生素引起的肠道菌群失调,与模型组的菌群差异显著,对肠道菌群的恢复具有积极作用,效果优于标准益生菌LB组。肠道菌群群落组成分析显示,正常组肠道菌主要是p__Bacteroidota和p__Firmicutes,抗生素干预导致p__Bacteroidota显著上升,p__Firmicutes下降,优势菌群丰度发生了显著变化,导致菌群失调及进一步疾病的发生的可能。从属水平看,模型组中占据肠道正常菌群主要位置的g__Allobaculum显著下降,取而代之的是g__Bacteroides、 g__Parabacteroides、g__Klebsiella显著上升。g__Bacteroides虽然是参与人体结肠中包括碳水化合物的发酵、含氮物质的利用以及胆汁酸和其他类固醇的生物转化重要代谢活动的常驻菌群,但是多种因素如饮食、环境、抗生素的使用等,导致不同人群以及不同生理状态下g__Bacteroides丰度不同。肠道菌群菌间的拮抗和防御机制是维持肠道稳态的机制之一,p__Bacteroidota为了在菌间竞争中获取优势地位进化出多种特定的杀菌蛋白,可能是抗生素模型组g__Bacteroides显著上升的原因之一[18]。过度使用抗生素、免疫系统受损、肠道屏障被破坏等情况下,肠道菌群失衡导致g__Bacteroides过多而逃到肠道以外的身体其他部位时,会充当致病菌,导致脓肿和中枢神经系统、头部、颈部、胸部、腹部等多部位感染,甚至促进肿瘤生长[19]。例如脆弱拟杆菌属(g__Bacteroides fragilis)引发的细胞事件导致结肠上皮细胞增殖、粘膜炎症和潜在的转移,是人类结肠直肠癌的主要启动子和促进剂;浸润性乳腺癌患者的肠道微生物组与健康女性相比,g__Bacteroides水平显著增加;g__Bacteroides的相对丰度与躯干脂肪含量、全身脂肪含量也呈正相关[20]。研究显示L. plantarum H-6可以显著增加AAD模型小鼠肠道中g__Lactobacillus和阿克曼氏菌属(g__Akkermansia)的丰度,降低g__ Bacteroides丰度,对调节结肠微生物结构缓解腹泻具有很好潜力[14]。根据系统发育分析,g__Parabacteroides与g__Bacteroides物种由共同祖先分化,g__Parabacteroides属于p__Bacteroidota,卟啉单胞菌科的革兰氏阴性菌,具有致病和益生双重潜力,被报道与炎症性肠病和其他疾病有关。g__Parabacteroides物种存在抗生素耐药性,一些g__Parabacteroides对克林霉素或莫西沙星产生耐药性[21]。g__Klebsiella俗称肺炎杆菌,f__Enterobacteriaceae革兰氏阴性菌,为低级条件致病菌,易感于所有的哺乳类动物,也是造成院内感染的主要病原菌之一,可引起肺部、泌尿道、血液、脑部等部位的感染;抗生素治疗后由于破坏有益菌群,导致g__Klebsiella的过度繁殖和感染[22]。g__Lachnoclostridium是一类革兰氏阳性菌,属于p__Firmicutes、o__Clostridiales、f__Lachnospiraceae,其相对丰度在一些疾病中有所增加,如肠炎病变、肠道肿瘤、肝脏脂肪变性以及代谢性疾病。LB组和KSFY01组干预明显改善了抗生素导致的这种肠道菌群的变化,明显降低了g__Klebsiella、g__Bacteroides、g__Parabacteroides、g__Lachnoclostridium。进一步通过物种差异分析寻找组间具有显著差异的生物标识,发现正常组具有肠道中的常见优势菌群p__Firmicutes,包括如f__Erysipelotrichaceae、o__Erysipelotrichales、c__Bacilli等。模型组各菌种的优势性变得不明显,各菌种LDA分值差异不大,对差异效果影响比较平均;且菌种以p__Proteobacteria为主,临床研究显示p__Proteobacteria等菌群在多种腹泻患者中丰度增加,且与疾病的严重程度相关,同时伴随着SCFA等代谢物的变化,其产生的毒素和代谢产物对肠道黏膜屏障具有损伤作用,表明p__Proteobacteria可能通过影响肠道代谢参与AAD的发生发展[23]。o__Enterobacterales是p__Proteobacteria, c__Gammaproteobacteria下的一个目,包括如f__Enterobacteriaceae、欧文菌科(f__Erwiniaceae)、溶果胶菌科(f__ Pectobacteriaceae)等在内的7个科,其中f__Enterobacteriaceae包括一些对人类和动物致病的病原菌,如大肠杆菌(g__Escherichia)、沙门氏菌 (g__Salmonella)和志贺菌(g__Shigella)等。另外已知g__Klebsiella可能引起肺炎、尿路感染、口腔感染等[24]。LB组优势菌种为o__Lactobacillales、f__Lactobacillaceae、g__Lactobacillus等,它们是在酸奶等食品中首次被发现,广泛存在于自然界和人体中,有助于维护肠道和阴道健康的革兰氏阳性菌。KSFY01组优势菌种与正常组相似,多属于p__Firmicutes,例如o__Lachnospirales属于p__Firmicutes下的c__Clostridia的1个目;f__Lachnospiraceae也属于p__Firmicutes,是一类能够参与碳水化合物代谢的厌氧菌,尤其能分解果蔬中的果胶,并产生乙酸、丁酸等SCFA,为宿主提供能量。以上结果提示模型组与正常组之间存在显著的微生物差异,抗生素应用导致肠道的优势菌下降,致病菌增加,破坏了菌群稳态,KSFY01和LB组能够调整这些差异,对于维持肠道菌群稳态有一定作用。GUO等[25]报道,L. plantarum CICC21809发酵苹果汁能显著增加头孢曲松诱导的AAD小鼠肠道中普雷沃氏菌属(g__Prevotella)的相对丰度,g__Prevotella为o__Bacteroidales、f__Prevotellaceae的厌氧革兰氏阴性菌,此结果与本研究结果一致。

综上所述,本研究建立复合抗生素诱导的AAD腹泻模型,发现 KSFY01 在AAD模型中展现出显著的保护作用。其机制可能涉及肠道菌群重构、黏膜屏障修复及系统性免疫调节等多重途径。肠道菌群受抗生素干预后,肠道屏障功能显著受损,且门、属、种水平的菌群组成均发生显著变化,如p__Bacteroidota上升、p__Firmicutes下降,部分属种的增减改变,且一些菌属在特定情况下可致病或与多种疾病相关。L.plantarum KSFY01 能显著改善抗生素引起的肠道菌群失调,效果优于益生菌 LB 组,具体表现为能抑制抗生素导致的肠道菌群丰富度、均匀度指标下降,改善菌群紊乱及菌群结构变化。LB 组和 KSFY01 组干预可降低相关致病菌群的相对丰度,同时 KSFY01 组优势菌种与正常组相似,多属于p__Firmicutes,有助于恢复正常菌群结构,调整菌群差异。本研究的局限性在于未对肠道菌群组成及炎症因子谱进行动态监测,后续工作可结合宏基因组学和代谢组学深入探讨其作用网络。未来研究需进一步解析KSFY01的活性成分及其分子靶点,以期为临床AAD的防治提供新的干预策略。

4 结论

通过构建AAD小鼠模型,系统评估了L.plantarum KSFY01对AAD的缓解作用及其潜在机制。结果表明,KSFY01能够显著改善抗生素诱导的腹泻症状,包括降低粪便含水量、促进粪便成型、减轻体质量下降及加速恢复期体质量回升。此外,KSFY01通过调节肠道菌群结构、增强肠道屏障功能以及改善免疫器官指数,有效缓解了抗生素导致的肠道稳态失衡。血清炎症因子检测进一步证实,KSFY01通过降低促炎因子(IL-6、IFN-γ、TNF-α)水平并提升抗炎因子(IL-10)水平,显著减轻了系统性炎症反应。结肠组织病理学分析显示,KSFY01通过减少炎性细胞浸润、修复黏膜层结构及提高ZO-1表达,显著改善了肠道屏障功能。肠道菌群分析表明,KSFY01能够显著逆转抗生素导致的菌群失调,恢复p__Firmicutes与p__Bacteroidota的正常比例,并抑制致病菌如g__Klebsiella和g__Bacteroides的过度增殖。这项研究可能为AAD提供一种新的治疗选择。

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