透明质酸(hyaluronic acid, HA)是一种天然存在的高分子糖胺聚糖,广泛分布于人体皮肤、关节滑液及结缔组织中,具有优异的保湿、抗衰老以及免疫调节作用。近年来,HA作为新食品原料获准用于普通食品,并且因其主流的发酵生产工艺具有高效、可控与高纯度等优势,进一步推动了其在功能性食品领域的快速发展[1]。作为一种天然、安全可食用的功能性多糖,口服HA被证明通过调节生理代谢呈现缓解皮肤老化、提升皮肤亮度以及调节肠道健康的作用[2]。根据分子质量的不同,HA通常可分为以下四类:高分子质量HA(MW:>106 Da)、中分子质量HA(MW:2.5×105～1.0×106 Da)、低分子质量HA(MW:1.0×104～2.5×105 Da)以及寡聚HA(MW:<104 Da)[3]。值得注意的是,HA的生物学功能与其分子质量密切相关。研究表明不同分子质量的HA生物学活性差异显著,这也是其在临床应用中重要的考量因素。通常低分子质量的HA被报道能够激活免疫和加速血管生成,而高分子质量的HA则表现出抗炎和抗血管生成作用[4-5]。此外,进一步研究表明相较于其他分子质量范围的HA,中等分子质量的HA在维持皮肤水合状态与弹性方面表现更为优异,从而展现出显著的抗衰老功效[6]。这一特性提示可通过调控HA的分子质量实现精准功能定位。然而,上述研究多集中于抗衰、抗炎以及保湿等方面的功效,对于HA在特定病理微环境下(如缺氧)的作用机制,仍缺乏系统研究。
氧气对于维持机体与组织的正常功能至关重要,而缺氧则可诱发脑、肾脏、心肌及皮肤等多器官损伤,其中关于皮肤缺氧损伤的研究仍较为有限。缺氧不仅会抑制细胞代谢与增殖,更易引发线粒体功能障碍,促使活性氧(reactive oxygen species,ROS)的大量释放,从而加剧氧化应激与炎症反应,阻碍皮肤修复[7]。当前缺氧治疗手段如高压氧疗法的疗效短暂且存在氧化应激风险,而各种新型人工氧载体则存在生物相容性、稳定性以及长效性的限制[8-9]。鉴于上述外源性给氧策略的局限性,从皮肤组织内源性修复机制中寻找干预靶点,已成为一种有前景的新途径。近年来,越来越多的研究表明皮肤稳态的维持并非仅受控于单一细胞的功能,而是高度依赖成纤维细胞与角质形成细胞通过释放信号分子实现的“对话”[10]。在这一过程中,成纤维细胞常通过旁分泌方式释放多种细胞因子、生长因子及外泌体等信号介质,作用于邻近的角质形成细胞。条件培养基(conditioned medium,CM)作为一种富含细胞分泌物的培养液,可作为模拟细胞间通讯的有效物质,并且已被证明能够传递生物活性因子而促进细胞修复[11]。此外,外源因子的预处理可显著增强CM的生物功能[12-13]。这些研究提示,利用特定外源性活性因子(如HA)对细胞进行预处理后所得的CM,可能是治疗缺氧损伤的一种创新策略。然而,目前尚无HA干预成纤维细胞分泌改善角质形成细胞缺氧损伤的相关报道。
本研究分别采用4种不同分子质量(5～2 000 kDa)的HA预处理人真皮成纤维细胞以制备CM(HA-conditioned medium,HA-CM),并将其应用于缺氧损伤的角质形成细胞模型。其中所选的HA分子质量分别代表寡聚HA、低分子质量HA、中分子质量HA及高分子质量HA,旨在系统探究其生物学效应的分子质量依赖性。通过检测ROS水平、炎症因子、细胞凋亡率及抗氧化通路等关键指标,并结合对HA-CM中生长因子的定量分析,深入揭示了HA通过调控细胞间互作缓解皮肤缺氧损伤的潜在机制。本研究不仅为HA在功能性皮肤健康食品的扩展应用提供新证据,也为基于分子质量精准设计的新型抗缺氧产品开发奠定理论基础。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
CCK-8试剂盒、ROS试剂盒、细胞凋亡Annexin V-FITC试剂盒、转化生长因子-β1(transforming growth factor-beta 1, TGF-β1)ELISA试剂盒、核因子E2相关因子2(nuclear factor erythroid 2-related factor 2, Nrf2)、血红素加氧酶-1(heme oxygenase-1, HO-1)、β-微管蛋白(β-Tubulin)一抗,上海碧云天生物技术股份有限公司;杜尔贝科改良伊格尔培养基(Dulbecco’s modified Eagle medium, DMEM),美国赛默飞世尔科技公司;肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-alpha, TNF-α)和白细胞介素-6(interleukin-6, IL-6)ELISA试剂盒,北京正四柏生物科技有限公司;血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)ELISA试剂盒,美国R&D Systems公司;HaCaT角质形成细胞,北纳生物;HFF-1成纤维细胞,中国科学院细胞库;HA4(MW≈1 253.7 kDa)、HA3(MW≈268.1 kDa),HA2(MW≈30.8 kDa),HA1(MW≈5.8 kDa)样品按照先前酶解的方法制备[14]。
1.2 仪器与设备
1300 SERIES A2生物安全柜、ST 8R高速冷冻离心机、STERI-CYCLE i160二氧化碳恒温培养箱,赛默飞世尔科技公司;PTX-FA220S电子天平,华志电子科技有限公司;SpectraMax M2多功能酶标仪,美谷分子仪器有限公司;Tanon 4600全自动化学发光图像分析,上海天能科技有限公司;BD LSRFortessa Cell Analyzer流式细胞仪,美国碧迪公司;Carl Zeiss LSM880激光共聚焦显微镜,德国卡尔蔡司股份公司。
1.3 实验方法
1.3.1 成纤维细胞CM的制备
将HFF-1细胞用完全培养基重悬,然后以4×105个/孔接种于6孔板中。待细胞融合度至80%时,分别加入不同分子质量的HA(100、500、1 000 μg/mL)处理细胞24 h。HA处理结束后,弃去含HA的培养基,用PBS轻柔清洗细胞2次,以去除游离的HA。随后更换成DMEM基础培养基继续培养细胞24 h。收集培养上清液,于4 ℃、1 000×g下离心10 min,取上清液即为HA预处理的CM(HA-CM)。对照组细胞不加HA处理,其余操作步骤一致,所获上清液作为对照CM(C-CM)。
1.3.2 CM中分泌因子的检测
收集经不同处理后的成纤维细胞CM,于4 ℃、1 000×g离心10 min。采用酶联免疫吸附测定法分别检测各CM中TGF-β1、VEGF及IL-1α的含量。
1.3.3 细胞活力测定
将HaCaT细胞以1×104 g个/孔接种于96孔板中,贴壁培养24 h。随后弃去培养基,将细胞分为以下3组:对照组[50%(体积分数,下同)C-CM]、模型组(50% C-CM+2 000 μmol/L CoCl2)及HA-CM组(50% HA-CM+2 000 μmol/L CoCl2)。其中各组细胞先用不同的CM处理12 h,然后模型组和HA-CM组再加入CoCl2继续孵育6 h后,采用CCK-8试剂盒检测细胞活力。
1.3.4 ROS水平检测
HaCaT细胞以4×105个/孔接种于6孔板中,并按照1.3.3节分组处理细胞。然后弃去培养基,用PBS洗涤2次。随后加入DCFH-DA荧光探针,37 ℃避光孵育30 min,再用PBS洗涤2次以去除未结合探针。然后分别采用共聚焦激光扫描显微镜和流式细胞仪在488 nm激发波长下检测细胞内ROS水平。
1.3.5 细胞凋亡检测
按照1.3.3节所述方法对细胞进行相应处理后,收集细胞,用Annexin V-FITC结合缓冲液重悬,随后加入Annexin V-FITC和PI染色液充分混匀,于37 ℃避光孵育20 min。染色完成后,立即通过流式细胞仪对细胞凋亡进行分析。
1.3.6 炎症因子的检测
收集经过不同处理后的HaCaT细胞培养上清液,于4 ℃、1 000×g条件下离心10 min,取上清液置于-80 ℃保存,避免反复冻融。按照制造商的说明书采用相应的ELISA试剂盒检测上清液中TNF-α和IL-6的含量。
1.3.7 Western blotting实验
采用含蛋白酶抑制剂的放射免疫沉淀法裂解缓冲液对细胞进行裂解,于4 ℃、12 000×g离心15 min,收集上清液。采用二喹啉甲酸法测定裂解液中总蛋白浓度。取等质量的蛋白样品经SDS-PAGE凝胶电泳分离,随后转移至聚偏二氟乙烯膜上。用含5%(质量分数)牛血清白蛋白溶液室温封闭1 h,以减少非特异性结合。封闭结束后,将膜与一抗(Nrf2、HO-1、β-Tubulin)于4 ℃孵育过夜。用含吐温-20的三氨基甲烷缓冲盐溶液洗涤3次后,加入相应的二抗,室温避光孵育1 h。最后,采用化学发光试剂显影,通过化学发光成像系统获取蛋白条带图像。使用ImageJ软件对目标蛋白条带进行灰度值定量分析,并以β-Tubulin作为内参进行归一化处理。
1.4 数据分析
所有实验均独立重复3次,数据以“平均值±标准差”表示。采用GraphPad Prism 9.5软件进行单因素方差分析,以P<0.05记为组间差异具有统计学意义。
2 结果与分析
2.1 HA分子质量对CM中分泌因子的影响
成纤维细胞可通过旁分泌细胞因子调控角质形成细胞的功能状态。本研究为探究HA对细胞间通讯的调控及保护作用,首先检测了HA-CM中TGF-β1、VEGF及IL-1α的分泌水平,以阐明细胞间潜在的旁分泌分子调控网络。由图1-a和图1-b可知,与未处理的对照组(C-CM)相比,所有HA-CM处理组均可促进成纤维细胞分泌TGF-β1和VEGF,且其分泌水平与HA的分子质量密切相关。其中,低分子质量HA2诱导的TGF-β1和VEGF分泌量最高,分别达到942.13 pg/mL和300.88 pg/mL,较对照组提升近2倍(P<0.001),显著高于中分子质量HA3(P<0.01);然而,与对照组(C-CM)相比较,寡聚HA1和高分子质量HA4组均未呈现显著性差异。该结果表明,HA对成纤维细胞分泌活性的调控具有明显的分子质量依赖性。现有研究表明,TGF-β1在皮肤稳态维持中发挥关键作用,不仅能抑制炎症、促进细胞外基质合成,还可以激活Nrf2抗氧化通路[15];同时,VEGF除了能够促进血管生成外,亦被证实可诱导Nrf2蛋白的表达[16]。这些结果提示特定分子质量的HA可调控成纤维细胞的分泌表型,使其更多地释放具有抗氧化、抗凋亡以及组织修复功能的TGF-β1与VEGF,从而可能提升CM对细胞氧化应激缓解的作用。
a-TGF-β1的含量;b-VEGF的含量;c-IL-1α的含量
图1 CM中分泌因子的定量分析
Fig.1 Quantitative analysis of secreted factors in CM
注:与C-CM相比,*表示P<0.05,**表示P<0.01,***表示P<0.001。
IL-1α作为皮肤中重要的早期促炎因子,其水平升高常与屏障损伤和慢性炎症相关[17]。结果表明,与对照组(C-CM)相比,在HA-CM中的IL-1α分泌水平呈下降趋势(图1-c),其中HA2-CM组显著下降(P<0.05),提示HA不仅能促进生长因子(如TGF-β1和VEGF)的释放,还可抑制成纤维细胞的炎症反应(如IL-1α的分泌),从而提升CM的生物活性。
KAWANO等[18]发现较低分子质量的HA能显著促进成纤维细胞TGF-β1的表达,而高分子质量HA表现出相对较弱的促进效果,这与本研究结果类似。基于以上研究结果,进一步评估了HA-CM对缺氧角质形成细胞的氧化应激、炎症反应以及细胞凋亡的影响。
2.2 HA-CM对细胞活力的影响
缺氧可导致线粒体功能障碍与氧化应激,进而引发细胞能量代谢紊乱与活力下降,是皮肤屏障受损的重要诱因之一[19]。本研究采用CCK-8法检测HA-CM对缺氧角质形成细胞活力的影响。如图2所示,缺氧模型组HaCaT的细胞活力仅为69.10%,与对照组相比具有极显著差异(P<0.001),表明缺氧损伤模型成功建立,而HA-CM的处理可剂量依赖性地增强缺氧HaCaT细胞的活力。然而,当HA的质量浓度达到500 μg/mL时,其细胞活力与1 000 μg/mL处理组相比无显著差异;此外,HA在500 μg/mL的质量浓度下,HA2-CM和HA3-CM效果最为显著,分别将细胞活力恢复至88.78%和87.72%(P<0.001)。该结果与HA2-CM和HA3-CM中更高的TGF-β1与VEGF分泌水平相符,提示HA-CM对缺氧细胞的保护作用可能归因于上述旁分泌因子的协同调控,并为后续深入探究HA-CM抗缺氧损伤的机制提供了基础依据。
图2 HA诱导的CM对细胞活力的影响
Fig.2 Effect of HA-induced CM on cell viability
注:与膜型组相比,##表示P<0.01,###表示P<0.001。
2.3 HA-CM对ROS的影响
缺氧可破坏线粒体的电子传递链,导致细胞内ROS的大量积累,引发脂质过氧化、蛋白质氧化及DNA损伤,进而加剧皮肤屏障功能障碍与炎症反应[20]。为评估HA-CM对HaCaT细胞缺氧介导的氧化应激的干预作用,本研究采用DCFH-DA荧光探针检测细胞内ROS的水平。如图3-a和图3-b所示,缺氧损伤模型组的ROS显著升高至251.92%,表明缺氧导致细胞内ROS水平急剧升高。与缺氧模型组相比较,各HA-CM组均能不同程度抑制ROS生成,其中HA2-CM的抑制作用最强,将ROS的水平抑制至162.28%;其次为HA3-CM与HA4-CM亦表现出良好的清除活性(P<0.05)。该结果提示中低分子质量的HA通过调控成纤维细胞分泌功能,改变了CM中的生物活性分子,从而使HA-CM呈现出抗氧化效果。REINA等[21]的研究亦表明干细胞CM可以明显提升斑马鱼内源性的抗氧化分子水平,该结果与本文相似。荧光染色图片的结果同样显示缺氧会使细胞内的DCFH荧光显著增强(图3-c),而经过不同的HA-CM处理之后,细胞内的绿色ROS荧光不同程度地减弱,其中,HA2-CM与HA3-CM处理组的ROS荧光减弱最为显著。综上,推断HA-CM通过TGF-β1/VEGF旁分泌信号激活角质形成细胞的内源性抗氧化防御系统,从而实现ROS的清除。
a-流式细胞术检测的ROS;b-ROS的定量分析;c-ROS的荧光染色图(比例尺:50 μm)
图3 HA诱导的CM对ROS的影响
Fig.3 Effect of HA-induced CM on ROS
注:与膜型组相比,*表示P<0.05,**表示P<0.01(下同)。
2.4 HA-CM对炎症因子的影响
氧化应激与炎症反应在缺氧损伤中密切相关。过量的ROS可激活核因子κB(nuclear factor-κB, NF-κB)、MAPK等促炎通路,进而诱导TNF-α、IL-6等炎症因子的释放,形成“氧化应激-炎症”恶性循环,加剧皮肤屏障损伤[22]。如图4-a所示,在缺氧微环境下,HaCaT细胞分泌的TNF-α水平升高至45.46 pg/mL,较正常对照组(3.74 pg/mL)增加近12倍(P<0.001),表明缺氧可显著地触发炎症通路。经过不同分子质量透明质酸预处理的CM干预后,各组的TNF-α分泌水平均显著降低,提示HA-CM具有抑制缺氧诱导炎症的作用。另外,与模型组相比,HA2-CM和HA3-CM效果最为显著(P<0.001),分别将TNF-α水平抑制至30.49 pg/mL和32.59 pg/mL。同时HA1-CM和HA4-CM均表现出良好的抑制作用(P<0.01)。如图4-b所示,IL-6水平亦呈现类似趋势,HA2-CM和HA3-CM处理组相较模型组显著降低(P<0.05),而HA1-CM和HA4-CM效果则相对较弱。同时,此结果与其ROS清除能力表现出高度一致性,进一步佐证HA-CM可有效逆转“氧化应激-炎症”恶性循环,进而有助于皮肤损伤修复。
a-TNF-α水平;b-IL-6水平
图4 透明质酸诱导的CM对炎症因子分泌的影响
Fig.4 Effect of HA-induced CM on inflammatory cytokines secretion
注:与模型组相比,***表示P<0.001。
a-流式细胞术检测的细胞凋亡百分比(Q1:坏死细胞;Q2和Q3:凋亡细胞;Q4:活细胞);b-凋亡率的定量分析
图5 HA诱导的CM对细胞凋亡的影响
Fig.5 Effect of HA-induced CM on cell apoptosis
2.5 HA-CM对细胞凋亡的影响
缺氧诱导的氧化损伤和炎症往往会导致细胞发生凋亡,因此本研究采用Annexin V-FITC/PI双染法通过流式细胞术检测角质形成细胞的凋亡率。如图5-a和图5-b结果显示,正常对照组细胞凋亡率极低(4.80%),而缺氧模型组细胞凋亡率显著升高至26.45%,表明缺氧可有效诱导角质形成细胞发生程序性死亡。经不同的HA-CM干预后,各组细胞凋亡率均较模型组有所下降,其中HA2-CM组效果最为显著,凋亡率降至17.92%(P<0.001),其次为HA3-CM组,而HA1-CM组和HA4-CM组呈现较弱的抑制作用而未达到统计学差异(P>0.05)。该结果表明,中低分子质量制备的HA-CM能够有效缓解缺氧诱导的角质形成细胞凋亡,其保护作用的强弱与分子质量大小紧密相关。GE等[12]的研究也表明,经过生长激素释放肽预处理的CM能显著缓解炎症诱导的细胞凋亡,该结果与本文的发现相互佐证,共同说明外源性物质的预处理可以提升CM的生物活性,从而有效缓解应激所致的细胞凋亡。
2.6 HA-CM对Nrf2/HO-1通路的影响
前期结果证实HA预处理可显著促进成纤维细胞分泌TGF-β1和VEGF,且两者均可激活Nrf2/HO-1抗氧化轴,提示HA-CM对角质形成细胞的保护效应可能与该机制相关,故本研究进一步采用Western blotting检测了Nrf2及其下游效应分子HO-1的蛋白表达水平。如图6所示,与对照组相比,缺氧模型组中Nrf2与HO-1蛋白表达显著下调,提示缺氧应激会破坏细胞内源性抗氧化防御系统。在不同的HA-CM的作用下,各组细胞的Nrf2和HO-1蛋白相对水平均有所提升,其中HA2-CM组的上调作用最为显著(P<0.05),表明其具有最强的Nrf2/HO-1通路激活能力。该结果表明,HA-CM能够有效逆转缺氧所致的Nrf2/HO-1通路抑制,从而增强角质形成细胞的抗氧化应答能力。
a-Western blotting蛋白印迹;b-Nrf-2相对定量;c-HO-1相对定量
图6 HA诱导的CM对Nrf2/HO-1通路的影响
Fig.6 Effect of HA-induced CM on Nrf2/HO-1 signaling
与此同时,Nrf2的激活不仅可通过HO-1依赖的途径清除ROS,还可抑制NF-κB通路以减轻炎症反应,进而阻断细胞凋亡进程[23]。上述结果为本文中观察到的ROS水平下降、炎症因子(TNF-α、IL-6)分泌减少及细胞凋亡率降低等结果提供了科学依据,进一步支持HA-CM通过激活Nrf2/HO-1通路实现对缺氧损伤的多靶点协同保护。
3 讨论与结论
缺氧微环境所引发的氧化应激是导致皮肤功能障碍与衰老的核心病理机制之一,因而增强内源性抗氧化防御体系是缓解皮肤缺氧损伤的重要策略。在体外抗氧化研究领域,传统方法多聚焦于直接评估化合物对自由基的清除能力。然而,皮肤作为一个复杂的器官,其稳态的维持高度依赖于表皮角质形成细胞与真皮成纤维细胞之间的精密对话[10,24]。这种细胞互作网络不仅调控皮肤修复与抗氧化应答,还是构成内源性防御系统的关键组成部分。因此,评估一种原料的皮肤保护功效,不仅要关注其直接抗氧化能力,更应深入探究其对细胞间通讯的调控作用。
本研究系统探究了不同分子质量HA通过调控成纤维细胞(HFF-1)旁分泌功能,缓解角质形成细胞缺氧损伤的作用机制。结果表明,HA对HFF-1细胞生长因子分泌(TGF-β1和VEGF)的调控作用具有明显的分子质量依赖性,其中HA2(30.8 kDa)诱导效应最为突出,显著优于其他分子质量组别。该结果提示HA的生物学活性并非随分子质量呈线性变化,而是在特定分子质量范围内活性达到最优。ZHENG等[25]利用亚临界水解法制备了一系列不同分子质量的生姜多糖,发现其对巨噬细胞吞噬活性及细胞因子分泌的促进作用随分子质量变化呈先升后降的趋势,这与本研究中HA对HFF-1细胞生长因子分泌的调控高度相似。同时,另一项研究表明低分子质量的银杏叶多糖(44 kDa)能够更好地促进血管内皮细胞的增殖及多种因子的表达[26]。此外,进一步的研究显示分子质量介于10～1 000 kDa的多糖常表现出更显著的免疫调节或细胞激活效应,而分子质量低于10 kDa或高于1 000 kDa的多糖则活性较弱[27]。上述研究提示中低分子质量多糖往往在细胞激活方面更具优势,而该现象主要源于分子质量对细胞受体识别和信号转导调控的影响[28]。一方面,高分子质量多糖(>1 000 kDa)由于空间位阻大、扩散受限,难以有效接触细胞膜受体;另一方面,寡聚糖(<10 kDa)则因无法维持稳定的高级构象,导致其无法诱导受体聚集与下游信号转导。因此,分子质量是决定多糖生物活性的关键因素,这与本研究的发现一致。
成纤维细胞会分泌多种生长因子影响其他细胞的代谢活动,并且由该细胞衍生的CM表现出一定的损伤修复作用。HA的处理可以促进成纤维细胞生长因子的合成、线粒体的代谢以及细胞外基质的重组[29],故推断HA预处理可能增强CM的生物活性。本实验结果表明,与对照组C-CM相比,HA-CM能够显著降低缺氧环境诱导的ROS蓄积;抑制TNF-α和IL-6的分泌;并最终减少细胞凋亡率,提升受损细胞的活力。值得关注的是,万级分子质量HA2所制备的CM(HA2-CM)展现出最显著的综合保护效应,这说明HA介导的旁分泌信使(TGF-β1和VEGF)发挥至关重要的作用。Nrf2是调控细胞氧化应激防御的核心转录因子。在压力应激下,它会启动下游抗氧化酶基因(如HO-1)的表达,从而增强细胞的抗氧化能力并抑制炎症反应。本研究发现,HA-CM均能激活HaCaT细胞中的Nrf2/HO-1信号通路,从而降低缺氧诱导的氧化损伤和炎症。RU等[30]研究也表明,真皮细胞衍生的CM能够通过调控Nrf2通路,有效逆转紫外线诱导的细胞衰老,并在小鼠模型中显著减轻皮肤光老化。
综上,本研究揭示了微生物发酵来源的4种不同分子质量HA(千级HA1、万级HA2、十万级HA3、百万级HA4)可通过“重编程”成纤维细胞的分泌表型,以旁分泌因子TGF-β1/VEGF为关键介导分子,协同激活皮肤组织的抗氧化防御系统,进而实现对皮肤缺氧损伤的靶向修复。该研究从调控细胞旁分泌的视角,为阐释HA的皮肤保护作用提供了新的机制解释,同时为开发HA用于缺氧相关干预的功能性食品提供了新的理论依据与研发思路。后续研究可致力于阐明其构效关系,并在体内模型中验证其改善皮肤健康的功效与机制,以推动基于分子质量精准匹配的皮肤营养食品的开发。
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