酱油作为中国传统的液体调味品,其风味形成主要依赖于曲霉、酵母菌和乳酸菌等微生物的协同作用[1]。然而,传统工艺发酵的酱油存在周期较长、风味质量不稳定等问题,这严重影响了酱油的生产效率。近年来,通过添加外源添加物提升酱油发酵品质成为研究热点,杜雯[2]研究发现,苦荞蛋白水解物的添加能够促进酱油产香鲁氏酵母细胞中K+的积累、胞质Na+的去除以及甘油与海藻糖的生成,进而提升酵母的抗逆性,将水解物添加到高盐稀态酱油发酵过程中能够显著提升酱油中氨基酸态氮和总酸的含量且产生具有米饭香、甘草香等的独特挥发性成分,丰富了酱油的风味。ZHOU等[3]研究发现,添加酵母抽提物于高盐稀态酱油发酵过程中可提升乳植杆菌属的竞争优势,并且促进了鲜味氨基酸的积累,显著提升了酱油的鲜味。曲艾钰等[4]研究发现,在酱油发酵前期添加酵母抽提物能够增强酱油的焦糖香和麦芽香,而在酱油发酵中、后期添加则对酱油风味影响不明显。潘平平等[5]研究发现,大豆蛋白水解物的添加对广式高盐稀态酱油种曲和成曲的中性蛋白酶活性提升显著。RUAN等[6]研究发现,将低值鱼水解物作为原料发酵酱油提高了酱油中游离氨基酸的含量,并且显著改善了酱油的鲜味同时也减弱其苦味。
干酵母粉具有成本低、易获取、营养丰富等优点[7]。其蛋白质含量高达49 g/100 g,所含氨基酸种类丰富、组成合理,明显高于联合国粮食及农业组织/世界卫生组织的推荐标准,属于优质蛋白,是制备蛋白水解物的理想原料。酶解法能够在提高蛋白质的生物学和功能特性的同时不破坏其氨基酸的构型[8],且酶解过程易于控制,是目前制备蛋白水解物的主流方法。蛋白质经酶解产生的有机氮源和游离氨基酸对于挥发性风味物质的产生与积累至关重要,酱油中的微生物尤其是酵母菌和耐盐乳酸菌可以直接利用这些化合物作为营养底物加速对天然风味物质的合成[2]。而酶解产物因水解程度的不同,其游离氨基酸和寡肽的种类和含量均不同,从而影响微生物的生长代谢。微生物利用此类前体物质合成的滋味和风味也会有所差异。酶解法条件温和,属于绿色加工范畴,适用于食品工厂的大规模生产[9]。然而目前提升酱油发酵品质主要通过优化原料配比及外源添加菌种[10],利用引入氮源物质优化酱油发酵工艺体系的研究报道相对较少,对于新型促发酵剂的开发仍处于持续探索的阶段。综上,本研究使用干酵母粉酶解制备酵母蛋白水解物,以水解度为指标从5种常见的商业蛋白酶中筛选出酶解效果较佳的2种酶(风味蛋白酶、中性蛋白酶)和二者复合酶酶解的水解物作为外源添加物应用于高盐稀态酱油发酵中,对比解析其对酱油的理化指标、挥发性风味物质、微生物菌群结构及感官评价的影响,为酵母蛋白水解物在酱油酿造中的应用奠定基础,以期为新型促发酵剂的开发和高盐稀态酱油的发酵工艺优化及品质提升提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
本研究所用酱油成曲由广东德仕利食品有限公司提供;干酵母粉,广东五洲药业有限公司;风味蛋白酶(150 U/mg)、中性蛋白酶(50 U/mg),上海麦克林生化科技股份有限公司;菠萝蛋白酶(1 200 U/mg)、木瓜蛋白酶(800 U/mg)、碱性蛋白酶(200 U/mg),上海源叶生物科技股份有限公司。其他试剂均为国产分析纯。
1.2 仪器与设备
MA600R冷冻离心机,上海冯博生物科技有限公司;HJ-M4磁力搅拌水浴锅,上海赫田科学仪器有限公司;LRH-150F生化培养箱,上海一恒科学仪器有限公司;K9840自动凯氏定氮仪,海能未来技术集团股份有限公司;7000D气相色谱质谱联用仪,美国安捷伦科技有限公司;GL-6250B智能恒温数显定时磁力搅拌器,海门市其林贝尔仪器制造有限公司;FE28 pH计,梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司;TU-1901双光束紫外-可见分光光度计,北京普析通用仪器有限责任公司;ME204电子分析天平,瑞士METTLER TOLEDO公司。
1.3 实验方法
1.3.1 酵母蛋白水解物的制备
干酵母粉按1∶8(g∶mL)的料液比与水混匀,加入酵母粉质量4%的蛋白酶,在蛋白酶的最适酶解温度和最适pH下酶解12 h,取样,100 ℃下灭酶15 min,冷却后离心15 min(4 ℃,8 000 r/min),取上清液,置于4 ℃冰箱待用。
1.3.2 水解度的测定
水解度是指蛋白质水解过程中断裂的肽键数与酶解产物中肽键总数的比值。参考梁天姣等[11]关于酵母粉中水解度测定的方法进行测定。
1.3.3 高盐稀态酱油发酵工艺
将W(成曲)与W(220 g/L盐水)以1∶2.5(g∶mL)料液比混合搅拌后制成高盐稀态酱醪置于30 ℃恒温培养箱进行为期60 d的发酵,在发酵开始时分别添加风味蛋白酶水解物(Y1)、中性蛋白酶水解物(Y2)和复合酶水解物(Y3),添加量为成曲质量的5%,以增加5%(质量分数)成曲的传统盐水发酵(不添加水解物)的酱醪作为对照组(C)。在发酵的前10 d每天搅拌酱油1次,之后每隔5 d搅拌1次,直至发酵结束。
1.3.4 理化指标的测定
在指标测定前对酱油样品进行预处理,取出酱油后离心10 min(4 ℃,6 000 r/min),取上清液待测。氨基酸态氮、总氮、总酸及可溶性无盐固形物根据GB/T 18186—2000《酿造酱油》进行测定;还原糖含量根据GB 5009.7—2016《食品安全国家标准 食品中还原糖的测定》测定;pH值使用pH计测定;游离氨基酸组成根据GB 5009.124—2016《食品安全国家标准 食品中氨基酸的测定》测定。
1.3.5 DNA提取
使用E.Z.N.A.Soil DNA Kit试剂盒,从不同发酵阶段(1、30、60 d)的酱油样品中分离微生物总DNA。通过2%(质量分数,下同)的琼脂糖凝胶电泳和超微量分光光度仪,分别评估所获DNA的完整性程度与浓度水平。
1.3.6 PCR扩增及测序
采用提取的基因组DNA作为模板,分别扩增细菌和真菌的特定基因区域。细菌16S rDNA V3-V4区扩增:引物为341F(5′-CCTACGGGNGGCWGCAG-3′)和805R (5′-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3′)。真菌ITS1区扩增:引物为ITS1 (5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′)和ITS2 (5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′)[12]。扩增程序如下:98 ℃预变性3 min;随后进行30轮循环:98 ℃变性30 s,50 ℃退火30 s,72 ℃延伸60 s;最终72 ℃延伸5 min,并于4 ℃保存。反应体系(50 μL)包含:5 μL 10×PCR缓冲液,0.1 mmol/L dNTPs,10 ng DNA模板,0.5 μmol/L正向和反向引物,0.05 U Taq DNA聚合酶,以ddH2O定容至50 μL。
1.3.7 高通量测序与数据分析
扩增反应完成后,利用1.8%的琼脂糖凝胶电泳验证产物,并通过SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒纯化目标片段。纯化所得DNA浓度采用Qubit2.0 DNA检测试剂盒进行精确定量,随后进行高通量测序。获得的原始数据为双末端序列。数据处理流程包括:利用cutadapt软件切除引物及接头序列;使用PEAR软件将成对末端序列合并为单条序列;根据样本特异性barcode标签和引物序列拆分各样品数据,并校正序列方向;应用PRINSEQ进行质量过滤:切除尾部质量值低于20的碱基;设置10 bp滑动窗口,若窗口平均质量值低于20,则截去该窗口之后的所有碱基;移除含有模糊碱基(N)的序列、长度过短序列及低复杂度序列,最终获得各样本的有效数据。
对优化后的序列,运用Usearch软件在97%相似度阈值下进行聚类,划分操作分类单元(operational taxonomic units,OTUs)。基于OTU结果,绘制稀释曲线,计算微生物群落的Alpha多样性指数,并对细菌及真菌的群落组成结构进行统计分析。
1.3.8 酱油中挥发性风味成分检测
取样品5 mL与2-甲基-3-庚酮甲醇溶液(内标物,质量浓度0.816 mg/mL)5 μL,移入20 mL顶空瓶中。于55 ℃恒温振荡器内平衡25 min后,采用固相微萃取(solid phase microextraction,SPME)针头于顶空吸附20 min,随后进行GC-MS进样分析。GC条件:进样口温度250 ℃,解析时间4 min;程序升温为40 ℃保持3 min,以4 ℃/min升温至180 ℃,保持2 min,以5 ℃/min升温至230 ℃,保持3 min,载气为高纯氦气,载气流速为1.0 mL/min,不分流。MS条件:采用电子轰击离子源(electron impact,EI),电子能量70 eV,发射电流200 μA。离子源与传输线温度均设定为230 ℃。全扫描模式采集数据,扫描时间范围1～45 min,质量扫描范围35～400 m/z。挥发性化合物定性分析:使用NIST20光谱库检索和比较,根据保留时间与标准质谱的比较确定物质的结构,使用内标法进行定量。
1.3.9 酱油感官评价分析
参考ZHANG等[13]关于酱油酿造感官评价的方法对发酵结束的酱油进行感官评分。感官评价小组由10名经系统培训的成员(5男5女)构成,成员年龄分布在25～45岁,成员在酱油的感官评估方面至少具有150 h的经验,通过香气、色泽、滋味和体态4个指标来评价酱油的品质,总分为100分。评分标准根据GB/T 18186—2000《酿造酱油》中酱油的感官特性拟定,如表1所示。
表1 酱油的感官评价表
Table 1 Sensory evaluation form of soy sauce
项目标准评分/分色泽(20分)深红褐色,色泽鲜亮,有光泽18～20红褐色,色泽红亮,有光泽13～17浅红棕色,色泽明亮,有光泽10～12浅棕色,色泽较亮,有光泽7～9浅黄色,色泽暗淡,无光泽4～6香气(30分)酱香浓郁,酯香醇香丰满,柔和协调,无不良气味25～30酱香浓郁,酯香或醇香较浓,无不良气味20～24酱香较浓,酯香淡,醇香淡,无不良气味15～19酱香平淡,无明显酯香及醇香,无不良气味10～14酱香很淡,无明显酯香及醇香,无不良气味5～9滋味(40分)滋味鲜美,酸味爽口,醇味醇厚,整体滋味协调适口35～40鲜味、酸味明显,醇味绵长,酸味整体滋味较协调30～34鲜味、有酸味、醇味明显,咸味适度25～29鲜味、酸味较淡,醇味较薄,咸味适度20～24鲜味、酸味很淡,醇味很薄,咸味适度15～19体态(10分)澄清透明,浓稠,有持久挂壁感8～10澄清透明,较浓稠,有明显挂壁感5～7澄清透明,较浓稠,有轻微挂壁感3～6澄清透明,稀薄,无挂壁感1～2有悬浮物0
1.4 数据分析
每个实验进行3次,使用SPSS 17.0软件对数据显著性差异进行分析,Origin 2024软件绘图。
2 结果与分析
2.1 蛋白酶的筛选及其复配工艺
不同蛋白酶的酶切位点与作用机制各异,导致水解物组成差异明显,故有必要对蛋白酶类型进行筛选。有研究表明,双酶酶解效率高于单酶,这是因为不同种酶具有不同的酶切位点,对底物的选择具有特异性[14]。水解度是指蛋白质水解过程中断裂的肽键数与酶解产物中肽键总数的比值。水解度与酶解效率息息相关,若水解度过低说明酶解不充分,小分子活性肽及游离氨基酸释放不完全,这可能导致水解物中的营养物质难以被酱油中的微生物吸收利用。而根据前期预实验表明水解度过高(>30%)的酶解产物会产生苦涩味,这可能会影响酱油的风味。因此本研究以水解度为指标,从5种常见的商业蛋白酶中筛选出酶解干酵母粉最适的2种酶,并对二者进行复配。由图1可知,使用风味蛋白酶和中性蛋白酶酶解酵母蛋白的效果最佳,水解度分别达到22.37%、22.56%。将风味蛋白酶与中性蛋白酶进行复合酶解,当风味蛋白酶与中性蛋白酶的质量复配比为2∶1时,其水解度可达29.74%,更加充分地释放了酵母蛋白中的寡肽、氨基酸等营养物质。综上本研究选择风味蛋白酶水解物(Y1)、中性蛋白酶水解物(Y2)及两者的最佳复合酶水解物(Y3)对酱油进行促发酵研究。
a-酶的种类;b-酶的配比
图1 以水解度为指标对蛋白酶的筛选及其最佳复配比的选择
Fig.1 Screening of proteases based on the degree of hydrolysis and the selection of the optimal compound ratio
注:不同字母表示显著差异(P<0.05)(下同)。
2.2 添加3种酵母蛋白水解物对酱油理化指标的影响
氨基酸态氮、总氮、总酸、可溶性无盐固形物和还原糖是酱油发酵过程的重要指标[2]。由图2可知,添加3种水解物的酱油样品中总氮和氨基酸态氮积累速率明显高于对照组,发酵结束时与对照组相比,Y1、Y2、Y3中的总氮分别提升了10.14%、9.28%、13.38%。氨基酸态氮分别提升了10.68%、10.72%、13.83%,这是由于水解物中的全氮等水溶性营养物质在酱油发酵中被完全释放出来,而酱油中氨基酸态氮含量的高低也决定了酱油的品质,氨基酸态氮含量越高标志着酱油的感官评分与滋味更佳[15]。与对照组相比,添加水解物加速了可溶性无盐固形物积累速率,其中Y3增幅最为明显,发酵结束时比对照组增加了2.68 g/100 mL,这是由于双酶酶解可使水解物中的活性肽被充分释放,酱油中的优势菌可吸收其中的促生长肽[16]从而加速对大分子物质的分解,从而提高其可溶性无盐固形物的积累。酱油中的酸类物质主要是由乳酸菌产生,包括乳酸、苹果酸、柠檬酸等,这些酸类物质可有效抑制腐败菌的生长繁殖并为酱油提供酸味[1]。发酵结束时,添加水解物的样品总酸含量均比对照组有所提升,分别达到1.72、1.81、1.90 g/100 mL,可见3种酵母蛋白水解物的添加促进了酱油总酸、氨基酸态氮及可溶性无盐固形物的积累,进而提升了酱油的酸味及鲜味。酸类物质的积累使酱油中的pH呈现先下降后平稳的趋势,发酵结束时4组样品pH值为4.8～4.91,这一范围既能保证适当的风味,又有利于酱油的防腐及稳定性。酱油中的还原糖主要包括葡萄糖、半乳糖等[17],在发酵开始前20 d,还原糖含量迅速提升,这是由于发酵初期真菌淀粉酶活性高,将淀粉迅速分解为还原糖,而在发酵20 d后还原糖含量逐渐下降,这是由于在高盐的环境抑制了酶的活性。各组的还原糖含量为2.74～2.92 g/100 mL,处于相对稳定的范围,无显著性差异(P>0.05)。
a-总酸含量;b-氨基酸态氮含量;c-总氮含量;d-可溶性无盐固形物含量;e-还原糖含量;f-pH值
图2 酱油中总酸、氨基酸态氮、总氮、可溶性无盐固形物、还原糖、pH随发酵时间的变化
Fig.2 Changes of total acid, amino acid nitrogen, total nitrogen, soluble salt-free solids, reducing sugar, and pH in soy sauce with fermentation time
2.3 酱油中游离氨基酸的对比
游离氨基酸不仅是酱油的营养物质,还是其滋味的重要来源[15]。酱油中蛋白质分解生成的游离氨基酸在酱油独特风味的形成中起着重要作用,还可以通过美拉德反应和Strecker降解反应生成醛、酮和吡嗪等挥发性风味化合物,有助于形成酱油独特的风味[18]。由表2可知,发酵结束时,添加3种酵母蛋白水解物的酱油中游离氨基酸含量分别比对照组提升了10.74%、10.93%、14.07%,这与样品中氨基酸态氮的增加基本一致。天冬氨酸和谷氨酸是2种重要的鲜味氨基酸,鲜味氨基酸的种类虽然只有2种,但其味觉强度最高,味觉阈值远低于甜味氨基酸及苦味氨基酸[19]。酵母蛋白水解物的添加显著增大了酱油中鲜味氨基酸的占比,与对照组相比分别提升了16.65%、16.43%、22.23%。研究表明甜味氨基酸对鲜味表现出协同作用[20],张佳男[21]发现甜味氨基酸对鲜味的促进作用明显,能提升鲜味的厚重感。其中Y3中鲜味氨基酸的含量增高最为显著,与对照组相比提升了16.48%,且甜味氨基酸含量较多。总体而言,添加酵母蛋白水解物提升了酱油中游离氨基酸的含量,且对鲜味氨基酸的提升最为明显。
表2 酱油中游离氨基酸含量的对比
Table 2 Comparison of free amino acid content in soy sauce
氨基酸名称呈味特性阈值/(g/L)含量/(g/L)CY1Y2Y3天冬氨酸 鲜味1.003.61±0.09c4.21±0.10b4.25±0.05b4.47±0.09a谷氨酸 鲜味0.305.52±0.06c6.44±0.04b6.38±0.03b6.69±0.09a丝氨酸 甜味1.502.46±0.03c2.61±0.07b2.72±0.04b2.87±0.11a甘氨酸甜味1.301.31±0.13b1.52±0.06a1.54±0.01a1.56±0.04a苏氨酸 甜味2.601.92±0.03a1.99±0.04a1.96±0.09a2.01±0.09a脯氨酸甜味3.001.23±0.02a1.27±0.06a1.23±0.05a1.31±0.05a丙氨酸 甜味0.602.23±0.03b2.51±0.05a2.62±0.05a2.60±0.03a组氨酸 苦味0.200.82±0.07b1.13±0.12a1.08±0.03a1.14±0.05a精氨酸 苦味0.503.41±0.14b3.63±0.06a3.61±0.08a3.72±0.08a酪氨酸 苦味—0.81±0.01b0.94±0.02a0.91±0.03a0.91±0.04a缬氨酸 苦味0.402.32±0.02ab2.29±0.08b2.37±0.04ab2.41±0.05a蛋氨酸 苦味0.300.61±0.02a0.63±0.01a0.58±0.07a0.63±0.03a苯丙氨酸 苦味0.902.03±0.04b2.35±0.03a2.34±0.02a2.41±0.04a异亮氨酸 苦味0.902.31±0.14b2.57±0.04a2.52±0.09a2.58±0.08a亮氨酸 苦味1.903.68±0.06b3.95±0.13a3.99±0.13a3.93±0.08a赖氨酸 苦味0.503.52±0.04b3.81±0.07a3.82±0.11a3.87±0.06a总计——37.79±0.93b41.85±0.98a41.92±0.94a43.11±1.01a
注：同一列中的不同字母表示数据之间存在显著差异(P<0.05);—表示无数据。
2.4 酱油中挥发性风味物质的分析
为分析酵母蛋白水解物的添加对酿造酱油香气的影响,使用GC-MS技术解析发酵结束后酱油中挥发性风味物质的含量和种类。由表3可知,所有样品中共鉴定出68种挥发性风味物质,添加水解物Y1、Y2、Y3发酵的酱油,其检测出的风味物质种类分别是57种、59种和61种,较对照组分别增加了5种、7种和9种。挥发性风味物质总含量分别为3 364.76、3 370.10、3 836.08 μg/L,相比对照组分别提升了22.26%、22.45%、39.39%,可见添加水解物显著提高了酱油风味物质的含量及其丰富度。
酯类和醇类物质是贡献酱油中果香和花香的重要化合物,同时也是酱油的主体香味物质[22]。由电子版增强出版附表1(https://doi.org/10.13995/j.cnki.11-1802/ts.044055,下同)可知,添加酵母蛋白水解物Y1、Y2、Y3发酵的酱油中分别共检测出12种、13种和13种酯类物质,相比对照组增加了2种、3种和3种,其含量相比对照组提高了24.77%、20.00%、25.81%。醇类物质的种类和数量上与对照组无显著差异,但含量相比对照组有明显提升,分别是922.19、890.63、1 040.83 μg/L,较对照组分别提高了22.56%、18.36%、38.32%,这说明添加水解物可以促进酱油中酯类物质和醇类物质的生成和积累。醛类和酮类物质主要来自氨基酸的分解以及醇类物质的氧化,使得酱油香气得以和谐化[23]。从所有样品中共检测出11种醛类物质和17种酮类物质,添加水解物的组别含量均比对照组高,其中Y3提升最为明显,可促进戊醛(甜味)、苯乙醛(果香味)、2-甲基巴豆醛(花香味)、羟基丙酮(芳香味)、2-丁酮(甜味)等的积累。酚类和杂环类物质是构成酱油特征香气的重要物质,其中4-乙基愈创木酚与4-乙基苯酚是赋予酱油独特的烟熏味的特征物质,二者主要来源于原料中的糖配体和木质素被曲霉酶降解后生成的阿魏酸及香豆酸等化合物被球拟酵母利用后产生[24]。值得注意的是,4-乙基苯酚在对照组中未被检出,而在添加水解物的组别中均被检出,这可能与水解物所含的寡肽、氨基酸等营养成分有关,这些物质在发酵阶段为酵母菌提供了额外的营养底物,促进了其代谢活性,从而有利于挥发性风味物质的合成。从4组酱油样品检测出的酸类物质较少且无明显差异,其中乙酸为酱油中主要的酸类物质,在赋予了酱油绵柔酸味的同时也抑制了腐败菌的生长繁殖[25]。
综上分析,添加酵母蛋白水解物的酱油样品中的醇类、醛类和酮类香气物质含量及种类均比对照组有所提升,这赋予了酱油额外的甜香味、果香味及芳香味等风味,使得香气更为突出、饱满。值得注意的是,酚类物质中4-乙基苯酚仅在添加水解物的样品中被检出,这赋予了酱油独特的烟熏香。由此可见在酱油发酵过程中添加酵母蛋白水解物能够显著促进酱油中挥发性风味物质的合成,进而丰富了酱油的风味。
2.5 酱油的感官评价
感官评价作为衡量酱油质量的核心指标之一,能直观体现其风味特征与整体质量。对发酵结束后的4组酱油样品进行感官评价。由图3可知,相较于对照组添加3种水解物的酱油在香气与滋味的得分均有所提升。其中Y3发酵的改善效果最为突出,在香气与滋味的得分上较对照组增幅分别为31.57%和24.14%,其香气特点是拥有更为浓厚的果香和甜香,这与乙酸乙酯(果香味)和2-丁酮(甜味)、菊苣酮(焦糖香)等酯类和酮类物质的提升相关。酚类物质4-乙基愈创木酚的提升及4-乙基苯酚的生成赋予了酱油独特的烟熏香,使得酱油的前香层次更加丰富、饱满,这与酱油中挥发性风味物质的分析结论一致,滋味感受表现为酸鲜适中,口感清爽。在色泽和体态上4组样品则无明显差异。感官评分结果表明,酵母蛋白水解物的添加,尤其是Y3,可显著增强酱油的香气、滋味及整体品质,在酱油酿造中有着较大的应用潜力。
图3 添加3种酵母蛋白水解物酱油的感官评分
Fig.3 Sensory scores of soy sauce with three yeast protein hydrolysates
2.6 不同发酵阶段酱油的菌群结构演替
酱油的酿造是一个复杂的微生物发酵过程,此过程中涉及的微生物生长和代谢会直接影响酿造酱油的品质。利用Illumina HiSeq平台研究酱油发酵过程中微生物群落的动态变化,对发酵第1天、第30天和第60天的样品进行分析。Shannon指数与微生物群落的物种多样性呈正相关,可表征群落多样性水平;Chao1指数则与物种丰富度呈正相关,用于评估群落丰富度特征[26]。由图4可知,所有样品的细菌多样性及丰富度均随发酵进程呈递减趋势,这是由于酱油中含盐量过高,不利于非耐盐微生物的生长。而真菌的多样性呈现先上升后下降的趋势,而其丰富度则逐渐增大。发酵结束时,酵母蛋白水解物的添加导致样品中细菌多样性及真菌丰富度发生改变。其潜在机制可能与水解物的氨基酸组成有关,据报道精氨酸和谷氨酸在提升发酵食品优势菌耐受能力、抑制腐败菌生长方面表现出关键作用:精氨酸可以被乳酸菌利用,通过精氨酸脱亚胺酶途径产氨(中和酸),维持有益菌耐酸性,而腐败菌则无法利用,导致胞内持续酸化进而死亡;谷氨酸可以通过代谢干扰反馈抑制腐败菌的氮代谢,并可以利用H+生成γ-氨基丁酸,这对维持pH的稳态发挥了积极作用[27]。
a-细菌Shannon指数;b-细菌Chao1指数;c-真菌Shannon指数;d-真菌Chao1指数
图4 酱油发酵过程中细菌Shannon指数、Chao1指数和真菌Shannon指数、Chao1指数的变化
Fig.4 Changes of bacterial Shannon index, Chao1 index, fungal Shannon index, and Chao1 during soy sauce fermentation
对酱油过程中由16 srDNA和ITS测序的OTU读数进行注释,按属水平分类的结果如图5所示,葡萄球菌属(Staphylococcus)和魏斯氏菌属(Weissella)是所有样品的优势细菌属,发酵初期二者占比为58.13%,随着发酵时间的延长,丰度呈现先增大后稳定的趋势。发酵结束时添加酵母蛋白水解物的样品组二者占比达68.01%～76.58%,其中样品Y3占比最大,与对照组相比提升了10.04%,说明水解物的添加提升了葡萄球菌和魏斯氏菌的竞争优势。据报道,葡萄球菌在高盐或高酒精环境中具有很强的抗高渗能力,然后逐渐成为各种发酵食品中的优势细菌,如酱油[28]。葡萄球菌具有丰富的蛋白酶和脂酶活性,能降解蛋白质释放出游离氨基酸,这些氨基酸(如谷氨酸)既是鲜味的直接来源,也是Strecker降解反应的前体物,可进一步与羰基化合物反应生成醛类(如苯乙醛),赋予酱油花香、麦芽香等香气[18],因此样品Y1、Y2和Y3与对照组相比,苯乙醛的含量分别提升了27.74%、36.72%、50.64%,这可能是由于葡萄球菌丰度的增加导致的。葡萄球菌中的脂酶能水解油脂释放出游离脂肪酸,这些脂肪酸既是酸味成分,也可作为底物通过酯化反应生成更多种类的酯,因此在样品Y1、Y2、Y3中共检测出12种、13种和13种酯类物质,相比对照组分别增加了2种、3种和3种,从而丰富了酱油的香气层次[28]。魏斯氏菌在整个酱油发酵过程中都是优势细菌,其代谢活动与酯类香气的形成密切相关。魏斯氏菌能够利用碳源产生代谢中间体乙酰乳酸,该物质可经非酶促氧化脱羧反应生成2-丁酮,在风味形成和生物活性功能中发挥重要作用[29]。此外,部分魏斯氏菌还具有酯酶活性,可能参与短链脂肪酸乙酯例如乙酸乙酯的合成[30],因此样品Y1、Y2和Y3与对照组相比,乙酸乙酯的含量分别提升了48.27%、34.01%、53.46%,这可能是由于魏斯氏菌丰度的增加导致的,并进一步丰富了酱油的酯香及果香味。曲霉菌是所有样品中最丰富的真菌,随着发酵的进行念球菌属和接合酵母菌属占比有所提升,研究表明这2种菌属可促进挥发性酯类和醇类物质产生,有助于提升酱油的香气[31],发酵结束时添加水解物的样品中念球菌及接合酵母菌相比对照组均有小幅度提升,但无显著性差异(P>0.05)。因此,在酱油发酵过程中添加酵母蛋白水解物能够改变酱油中细菌菌落的组成,提升酱油优势菌占比,优化了菌群结构。
a-细菌;b-真菌
图5 酱油发酵过程中细菌和真菌在属水平上的变化
Fig.5 Changes of bacteria and fungi at the genus level during soy sauce fermentation
3 结论
本研究使用干酵母粉酶解制备酵母蛋白水解物,并将酶解效果较佳的3种酵母蛋白水解物分别应用于高盐稀态酱油发酵,解析其对酱油品质的影响。结果表明,酵母蛋白水解物的添加显著提升了酱油的理化指标,其中样品Y3氨基酸态氮相比对照组提升了13.83%,鲜味氨基酸提升了22.23%。微生物群落结构在水解物的作用下发生了变化,其中对风味和生物活性起着重要作用的魏斯氏菌和葡萄球菌占比有所增大,从而间接影响了酱油的风味成分。3组处理组的样品比对照组的挥发性风味物质的种类及其含量均有所提升,其含量相比对照组分别提升了22.26%、22.45%、39.39%。此外,感官评分的结果也表明添加水解物对酱油的香气及其滋味均有增益作用。综上,3种酵母蛋白水解物的添加对酱油发酵的理化品质及风味成分均有着不同程度的增益效果,其中水解物Y3增益效果最佳,在酱油的酿造有着较大的应用潜力。本研究旨在为新型促发酵剂的开发与高盐稀态酱油的发酵工艺优化及品质提升提供理论支撑。
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