酒类食品作为人类饮食文化的重要组成部分,其安全性直接关系到公众健康与社会稳定[1-2]。近年来,随着食品工业的快速发展,酒类产品中添加剂的使用范围与种类日益复杂,由此引发的食品安全问题也备受关注[3-4]。从防腐剂、甜味剂到着色剂,这些添加剂在延长保质期、改善风味的同时,也可能因超范围使用、超限量添加或滥用对人体健康构成潜在威胁[5-6]。随着新版添加剂限量标准GB 2760—2024《食品安全国家标准 食品添加剂使用标准》的实施,酒类食品中可使用的添加剂种类及限量越发严格,同时随着复配添加剂的发展,在实际应用中,常常难以明确某种复配添加剂中具体成分[7-8],这对我国食品监管及检测技术提出了更高的要求。
目前我国已有诸多添加剂的检测标准和方法,但针对酒类的研究并不多。酒类产品中添加剂的检测方法有气相色谱法[9]、气相色谱-串联质谱法[10]、液相色谱法[11]、液相色谱-串联质谱法[12-14]、离子色谱法[15]等。我国现有添加剂检测标准和研究都有各自的不足之处[16-19],如前处理复杂,检测化合物有限,检测添加剂种类单一等,往往不能一次快速检测酒中多种添加剂,致使检测周期加长,极大降低酒中添加剂筛查的效率、增大了检测、监管难度。建立白酒中多种添加剂的高通量检测技术对提高危害物质筛查效率、强化食品安全检测十分必要。本研究基于超高效液相色谱-串联质谱(ultra performance liquid chromatography tandem mass spectrometry, UPLC-MS/MS)法建立了同时检测白酒中66种添加剂(包括36种防腐剂、18种甜味剂、9种着色剂、3种抗氧化剂)的高通量筛查方法。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
66种添加剂标准品,天津阿尔塔科技有限公司,基本信息见电子版增强出版附表1(https://doi.org/10.13995/j.cnki.11-1802/ts.044195,下同),质量浓度0.10～1.0 mg/mL。甲醇、乙腈、甲酸、乙酸铵、甲酸铵(均为色谱纯),德国Merck公司;甲醇(分析纯),成都市科隆化学品有限公司;本研究所使用的酒类样品,购自当地市场与网络。
表1 六十六种添加剂的线性范围、检出限和定量限
Table 1 Linear ranges, limits of detection (LODs), and limits of quantification (LOQs) and of 66 additives
化合物浓度范围/(ng/mL)检出限/(mg/L)定量限/(mg/L)化合物浓度范围/(ng/mL)检出限/(mg/L)定量限/(mg/L)苯甲酸、4-羟基苯甲酸、溴氯芬、4-羟基苯甲酸甲酯、4-羟基苯甲酸乙酯、4-羟基苯甲酸丙酯、4-羟基苯甲酸丁酯、4-羟基苯甲酸异丙酯、4-羟基苯甲酸异丁酯、2,4-二氯苯氧乙酸、苯氧乙酸、三氯生、水杨酸、布罗波尔、甲基异噻唑啉酮、甲基氯异噻唑啉酮、碘丙炔醇丁基氨甲酸酯、氯咪巴唑、苄索氯铵、十四烷基二甲基苄基氯化铵、十六烷基二甲基苄基氯化铵、4-羟基苯甲酸戊酯、劳拉氯铵、4-羟基苯甲酸苯酯、4-羟基苯甲酸苄酯、噻苯咪唑、月桂酰精氨酸乙酯盐酸盐、三氯卡班、对氯间二甲酚、苄氯酚、甜蜜素、甜菊糖苷、瑞鲍迪苷 A、柚皮苷二氢查尔酮、新橙皮苷二氢查尔酮、杜克苷A10～4000.10.2没食子酸丙酯、丁基羟基茴香醚、纽甜、阿斯巴甜、三氯蔗糖、糖精钠、安赛蜜、阿力甜、爱德万甜、甘草酸、橙皮苷、麦芽糖醇、山梨醇、木糖醇、日落黄、胭脂红、苋菜红、酸性红、诱惑红、亮蓝、赤藓红、喹啉黄、柠檬黄25～1 0000.050.1肉桂酸、对氯间甲酚20～800 0.040.1特丁基对苯二酚40～1 6000.080.15纳他霉素、山梨酸、脱氢乙酸、邻苯基苯酚50～2 0000.10.2
1.2 仪器与设备
Agilent LC 1290-6495配有电喷雾离子源的液相色谱串联三重四级杆质谱仪、Agilent Eclipse Plus C18柱(3.0 mm×150 mm,1.8 μm)、0.22 μm尼龙(nylon, PA)滤膜、0.22 μm聚丙烯(polypropylene, PP)滤膜、0.22 μm聚四氟乙烯(poly tetra fluoroethylene, PTFE)滤膜、0.22 μm聚偏氟乙烯(polyvinylidene fluoride, PVDF)滤膜,美国Agilent公司;ACQUITY UPLC BEH C18柱(3.0 mm×100 mm,1.7 μm)、Waters Acquity UPLC HSS T3柱(2.1 mm×100 mm,1.8 μm),美国Waters公司;ACE EXCEL C18柱(2.1 mm×75 mm,1.7 μm),英国ACE公司;Shim-pack GIST C18柱(2.1 mm×100 mm,2 μm),日本岛津公司;Hypersil GOLDTM C18柱(3.0 mm×100 mm,1.9 μm)、Multifuge X4R Pro冷冻高速离心机,美国赛默飞公司;Milli-Q超纯水纯化系统,美国Millipore公司;MD200-2氮吹仪,中国杭州奥盛科学仪器有限公司;MS 3漩涡振动器,德国IKA公司。
1.3 实验方法
1.3.1 混合标准工作溶液配制
根据需要分别准确移取66种添加剂的标准储备液适量,配制成质量浓度为1～5 μg/mL混合标准溶液。分别准确移取混合标准溶液10、20、50、100、200、400 μL,氮气吹至近干后,用1 mL基质匹配空白溶液溶解残渣,混匀后过0.22 μm PTFE滤膜,即得混合标准工作系列溶液,质量浓度范围为10～2 000 ng/mL。
1.3.2 样品前处理
精密吸取2.5 mL混合均匀的样品,置10 mL刻度氮吹管中,于40 ℃水浴氮吹至约1 mL,取出冷却至室温后,用稀释溶液(甲醇体积分数为20%的5 mmol/L甲酸铵水溶液)稀释并转移至5 mL容量瓶中,定容至刻度,混匀后过0.22 μm PTFE滤膜,续滤液供液相色谱-串联质谱仪分析。
取空白白酒样品,按上述方法处理即得空白基质溶液。
1.3.3 色谱和质谱条件
1.3.3.1 色谱条件
色谱柱:Agilent Eclipse Plus C18柱(150 mm×3.0 mm,1.8 μm);流动相:A为5 mmol/L乙酸铵溶液,B为甲醇-乙腈(体积比1∶1),梯度洗脱程序:0～2.2 min,10% B;2.2～6.0 min,10%～40% B;6.0～8.0 min,40%～60% B;8.0～13.5 min,60%～80% B;13.5～14.0 min,80%～95% B;14.0～15.0 min,95% B;15.0～15.2 min,90%～10% B;15.2～17.5 min,10% B;流速:350 μL/min;柱温:40 ℃;进样量:5 μL。
1.3.3.2 质谱条件
离子源:电喷雾离子源正、负离子同扫模式;毛细管电压:4 500 V(ESI+)、3 000 V(ESI-);离子源温度:280 ℃;干燥气流量:11 L/min;鞘气温度:300 ℃;鞘气流量:11 L/min;雾化气压力:45 psi;喷嘴电压:1 500 V;动态多反应离子监测模式(dynamic multiple reaction monitoring, dMRM);监测离子对信息详见电子版增强出版附表1。
2 结果与分析
2.1 质谱条件优化
对66种化合物分别在全扫描模式下进行扫描,分别确定其准分子离子。根据66种化合物的分子结构特征,大部分甜味剂在电喷雾离子源中易失去H+成为R-COO-和R-SO3-,且在负离子监测模式下准分子离子峰强度高于正离子模式,本研究比较了正离子和负离子模式下各物质的响应值,发现大部分甜味剂在负离子模式下的响应值明显优于正离子模式,爱德万甜则在正负离子模式下均有很高的响应;而合成着色剂如日落黄、赤藓红、亮蓝等,多以K+、Na+盐形式存在,在极性溶剂中,易失去H+、K+、Na+等离子,形成带负电荷的多电荷基团[M-mNa(K)]m-[16],该基团的响应较强,故在负离子模式下选择该离子作为着色剂的母离子。dMRM适合多种化合物的同时检测,不仅可显著改善多种化合物负载循环时间,还可提高灵敏度和选择性[17]。因此,本文以dMRM方式建立了66种添加剂的质谱条件,采集参数见电子版增强出版附表1,优化后各化合物采集色谱图见附图1。
a-溶剂中乙醇体积分数为52%;b-溶剂中乙醇体积分数为30%;c-溶剂中乙醇体积分数为0%
图1 溶剂中乙醇含量对添加剂色谱峰的影响(200 ng/mL)
Fig.1 The influence of ethanol content in the solvent on the peak shape of additives (200 ng/mL)
2.2 色谱柱及流动相的选择
现有国家标准及文献[11-14]报道采用液相色谱柱填料主要为C18,实验选取了ACQUITY UPLC BEH C18柱(3.0 mm×100 mm,1.7 μm)、ACE EXCEL C18柱(2.1 mm×75 mm,1.7 μm)、Shim-pack GIST C18柱(2.1 mm×100 mm,2 μm)、Hypersil GOLD柱(3.0 mm×100 mm,1.9 μm)、Agilent Eclipse Plus C18柱(3.0 mm×150 mm,1.8 μm)以及Waters Acquity UPLC HSS T3柱(2.1 mm×100 mm,1.8 μm)进行考察。流动相的组成不仅会影响目标化合物的保留时间和峰形,还会影响离子化效率,进而影响灵敏度。分别考察了水相为纯水、0.1%(体积分数)甲酸水溶液、5 mmol/L甲酸铵水溶液、乙酸铵水溶液(5、10、20 mmol/L),有机相为甲醇、乙腈、甲醇-乙腈(体积比=1∶1)的流动相体系下的各组分出峰情况。结果显示水相为纯水时,合成着色剂、防腐剂、甜味剂等部分能出峰,但峰形、峰强度等较差;水相为0.1%(体积分数)甲酸水溶液时,除PG外其余抗氧化剂均不出峰,且部分甜味剂拖尾严重;水相为5 mmol/L甲酸铵水溶液时,除BHA、TBHQ外其余添加剂均能出峰,且峰形有所改善;水相为乙酸铵水溶液时,与甲酸铵出峰情况类似,但大部分峰响应要优于甲酸铵,而5 mmol/L乙酸铵水溶液为水相时,负模式条件下的化合物响应值较10 mmol/L乙酸铵低,但正模式条件下的化合物响应较10 mmol/L乙酸铵高,继续加大乙酸铵浓度,响应值增加并不明显,反而降低了如日落黄、甜蜜素等化合物的响应。不同有机相考察结果显示,有机相为强洗脱溶剂乙腈时,组分分离较差,甲醇-乙腈(体积比=1∶1)下各化合物的峰形较纯甲醇和纯乙腈下有所改善。综合考虑化合物峰形、2种模式下各化合物的响应及分离度等,本实验选择5 mmol/L乙酸铵水溶液和甲醇-乙腈(体积比=1∶1)作为最终流动相体系。使用Waters Acquity UPLC HSS T3和Agilent ZORBAX Ecilipse Plus C18,在选择的流动相系统中分离度和峰形均较好。总离子流图见附图1。
2.3 样品前处理条件优化
2.3.1 样品制备方法的选择
酒类样品基质比较单一,以乙醇和水为主,文献报道中以直接过滤进样的前处理方式为主[13,18],但因不同样品中乙醇含量存在差别,且不同酒样中成分存在差异,乙醇的存在可能会影响部分添加剂的测定[19],实验用不同乙醇含量的酒样制备0.2 mg/L加标样品,以加标回收率为指标考察直接过滤进样法与40 ℃氮吹至近干后加溶剂复溶后进样法之间的差异,结果显示不同酒精度的样品直接过滤进样后,出峰比较靠前的化合物,如山梨糖醇、麦芽糖醇、木糖醇的峰型受影响较大,如图1所示,且离子丰度比也受到影响,易导致假阴性结果(离子丰度比见电子版增强出版附表2);而40 ℃氮吹至干后加5 mmol/L甲酸铵水溶液(含20%甲醇)复溶后再进样可显著改善上述几个化合物峰型,但糖精钠、安赛蜜、甜菊糖苷、甘草酸、橙皮苷、新橙皮二氢查耳酮等13种添加剂回收率显著低于直接过滤进样法,如图2所示。综合考虑各化合物峰型、定性结果及加标回收的影响,初步选择40 ℃氮吹后复溶的方式制备样品,并对氮吹条件和复溶溶剂进行进一步优化。
表2 六十六种添加剂的加标回收率与RSD(n=6) 单位:%
Table 2 Recovery rates and RSD of 66 additives (n=6)
化合物1倍定量限白酒1倍定量限配制酒5倍定量限白酒5倍定量限配制酒10倍定量限白酒10倍定量限配制酒回收率RSD回收率RSD回收率RSD回收率RSD回收率RSD回收率RSD苯甲酸103.1 5.8 96.8 4.7 102.4 6.2 94.5 4.0 102.2 5.5 89.9 2.7 4-羟基苯甲酸98.4 5.4 88.9 4.7 99.5 4.4 99.0 3.3 98.2 4.5 92.6 3.8 三氯卡班96.9 4.2 83.7 4.6 114.5 2.8 93.2 3.6 107.2 6.4 88.9 3.5 对氯间甲酚99.3 2.5 100.9 2.4 106.4 3.4 99.9 3.5 106.8 3.1 91.3 2.8 对氯间二甲酚101.5 2.8 96.0 1.9 105.9 3.0 96.3 6.5 109.3 4.2 80.2 3.1 邻苯基苯酚99.7 4.4 99.6 4.2 94.3 5.7 100.4 5.1 109.4 5.6 84.9 5.9 苄氯酚111.1 4.8 103.4 4.0 111.6 3.2 95.9 6.4 111.1 3.7 85.9 3.8 溴氯芬99.0 3.8 89.0 4.4 112.1 4.3 96.8 5.8 111.2 2.5 99.0 3.0 山梨酸96.6 5.3 95.5 6.1 97.0 5.4 98.6 6.0 97.3 6.7 90.7 2.9 脱氢乙酸92.7 7.0 90.6 5.8 95.3 5.1 100.4 3.5 98.0 7.2 85.8 2.7 4-羟基苯甲酸甲酯95.6 5.1 89.4 5.3 101.6 4.9 98.1 4.7 109.2 4.9 90.5 3.3 4-羟基苯甲酸乙酯92.1 3.0 84.3 2.8 102.6 4.1 101.7 5.9 102.7 3.3 86.0 2.4 4-羟基苯甲酸丙酯103.3 4.4 99.5 4.3 104.7 4.6 98.6 3.3 110.1 4.1 96.3 4.2 4-羟基苯甲酸丁酯107.0 4.4 100.4 4.5 109.4 4.2 98.6 2.6 110.1 3.3 86.7 1.9 4-羟基苯甲酸异丙酯105.6 3.4 103.0 3.7 103.9 3.6 94.1 6.2 111.1 3.8 105.7 1.5 4-羟基苯甲酸异丁酯105.2 4.6 96.3 5.0 106.8 4.0 93.6 6.8 109.0 3.5 93.0 1.0 肉桂酸102.9 4.1 98.6 3.6 98.6 6.5 98.6 4.6 100.0 3.8 96.1 1.8 2,4-二氯苯氧乙酸102.3 4.9 98.7 4.9 104.9 4.3 91.4 3.4 107.5 5.0 85.8 5.1 苯氧乙酸94.1 4.0 93.4 4.2 97.7 5.2 100.8 4.6 89.1 3.3 104.0 2.1 纽甜85.0 5.3 76.5 2.8 80.8 2.5 98.6 2.6 82.1 3.2 103.0 4.1 阿斯巴甜86.0 1.7 94.9 2.6 80.3 0.4 102.6 3.8 83.5 1.4 87.1 3.8 三氯生109.8 3.0 98.7 3.2 108.9 3.1 99.9 3.7 108.3 4.6 86.9 4.1 水杨酸104.4 2.4 93.1 5.2 92.8 4.8 98.1 4.6 95.5 4.4 93.0 3.5 布罗波尔97.5 4.1 102.0 3.6 99.9 3.2 99.5 5.5 102.7 3.4 93.6 2.7 甲基异噻唑啉酮93.0 5.0 100.4 2.6 98.0 3.2 86.4 2.8 93.9 5.6 93.7 2.8 甲基氯异噻唑啉酮98.9 3.1 96.9 5.8 104.1 2.4 98.6 4.9 104.8 4.2 99.4 2.5
续表2
化合物1倍定量限白酒1倍定量限配制酒5倍定量限白酒5倍定量限配制酒10倍定量限白酒10倍定量限配制酒回收率RSD回收率RSD回收率RSD回收率RSD回收率RSD回收率RSD碘丙炔醇丁基氨甲酸酯99.2 2.9 94.0 4.2 104.8 2.9 90.0 4.7 105.1 4.1 93.2 1.5 氯咪巴唑100.8 5.3 80.4 3.6 109.0 2.3 97.2 3.8 109.8 3.6 97.3 3.1 苄索氯铵97.4 4.4 82.9 4.4 105.5 3.4 87.8 4.7 108.7 3.8 86.1 3.9 十四烷基二甲基苄基氯化铵94.0 3.9 98.7 5.0 111.7 4.2 100.8 4.2 108.2 5.1 93.6 2.2 十六烷基二甲基苄基氯化铵88.1 4.2 85.7 5.0 107.3 6.2 98.1 4.0 109.2 4.7 86.1 2.9 纳他霉素96.4 5.9 90.6 2.3 103.0 4.1 96.8 4.2 89.6 3.8 103.5 2.7 4-羟基苯甲酸戊酯92.8 5.1 83.9 2.8 106.0 4.0 99.5 4.7 90.4 3.9 83.6 3.5 劳拉氯铵102.3 2.9 96.5 4.4 100.7 3.3 96.8 5.6 99.4 3.9 86.1 2.5 4-羟基苯甲酸苯酯95.7 3.5 96.3 7.2 105.2 3.1 95.9 4.1 111.4 4.2 87.3 3.2 4-羟基苯甲酸苄酯96.5 3.9 89.6 5.1 102.5 3.0 84.6 2.7 110.4 4.0 90.2 1.8 噻苯咪唑99.2 5.9 101.6 7.1 105.0 5.7 98.1 3.4 105.3 3.8 92.6 1.8 月桂酰精氨酸乙酯盐酸盐92.8 4.3 100.4 5.6 105.1 4.3 98.1 4.0 109.6 5.1 98.9 1.7 三氯蔗糖102.3 2.1 108.3 3.1 94.9 1.0 100.8 4.5 96.6 1.6 92.5 2.6 糖精钠97.0 1.1 107.0 4.7 107.0 1.9 99.9 4.4 91.4 1.2 101.4 3.2 甜蜜素108.1 1.7 103.1 3.4 114.6 1.9 99.0 3.4 88.1 1.8 97.1 4.2 安赛蜜95.8 2.3 95.2 5.2 84.8 1.6 100.4 5.9 82.7 1.8 88.1 4.0 没食子酸丙酯117.2 8.5 104.5 3.5 103.5 4.5 99.7 5.4 87.1 5.7 96.5 2.6 丁基羟基茴香醚94.5 2.4 108.2 2.9 86.4 0.6 93.0 4.3 82.6 2.1 100.2 2.3 特丁基对苯二酚100.4 2.1 96.4 5.9 89.8 1.2 93.0 2.9 81.5 1.2 94.6 1.7 日落黄114.7 2.6 94.8 5.0 101.6 1.7 86.1 2.1 99.2 1.0 88.4 1.8 胭脂红91.9 2.6 100.0 4.3 85.2 0.9 93.8 2.8 83.0 2.5 94.1 3.0 苋菜红108.7 1.7 100.6 4.2 101.1 1.4 90.2 3.7 96.9 1.6 91.4 2.1 酸性红102.9 3.6 103.1 4.9 91.1 1.3 104.4 4.7 83.2 1.6 85.9 3.0 诱惑红105.8 3.6 104.2 4.6 100.9 1.9 93.2 2.6 85.6 2.1 87.4 2.5 亮蓝95.7 2.0 102.1 4.5 84.2 1.0 89.5 3.9 72.3 3.1 96.1 4.9 甜菊糖苷99.9 8.2 102.7 3.9 86.5 8.5 84.5 5.7 79.6 9.3 94.3 2.1 瑞鲍迪苷A98.7 4.1 99.9 7.9 90.7 2.1 88.0 3.8 89.4 2.5 100.4 2.0 阿力甜110.2 3.9 104.1 5.2 95.3 3.0 85.1 2.5 88.0 0.7 96.0 4.3 爱德万甜89.2 2.9 98.4 5.5 80.1 1.3 96.0 3.4 80.9 1.9 102.5 3.3 杜克苷A116.0 0.9 100.5 2.4 96.5 1.3 101.8 3.0 92.3 0.2 102.5 2.1 赤藓红79.2 3.8 89.5 5.2 78.4 1.8 96.0 2.5 80.8 2.4 81.1 5.4 甘草酸84.4 0.8 97.7 3.4 88.2 1.8 99.5 3.6 86.9 0.8 83.1 5.9 橙皮苷100.9 1.7 91.4 2.2 91.6 1.0 95.7 3.3 85.1 3.0 98.6 4.2 麦芽糖醇109.6 3.1 101.3 2.4 95.6 1.2 93.9 3.6 86.2 2.1 91.5 2.2 柚皮苷二氢查尔酮109.1 5.2 100.4 3.2 87.2 4.3 86.1 3.1 89.6 3.2 100.1 2.6 新橙皮苷二氢查尔酮100.5 4.1 99.0 2.5 87.2 1.2 62.6 2.3 82.5 2.0 100.9 3.1 喹啉黄86.7 1.9 99.5 3.0 92.9 0.6 99.2 1.5 87.8 1.8 99.1 2.6 山梨醇97.3 2.8 100.4 3.6 87.8 1.0 86.9 3.2 83.5 2.4 99.1 2.0 柠檬黄93.2 1.8 97.7 6.0 87.2 1.6 82.9 2.9 84.6 1.0 86.4 1.7 木糖醇90.0 6.9 99.5 3.2 82.9 5.6 87.0 2.1 90.9 3.2 95.5 2.3
图2 不同前处理方式对添加剂回收率的影响(n=3)
Fig.2 The impact of different pretreatment methods to the recovery rate of additives (n=3)
2.3.2 复溶溶剂的选择
本研究采用酒精度52%vol的白酒制备0.2 mg/L加标样品,于40 ℃氮吹至近干后,加不同溶剂复溶后,定容至5 mL,以回收率为指标考察溶剂置换的影响。研究结合各种化合物的理化性质,分别考察了50%(体积分数)甲醇水、50%(体积分数)乙腈水、20%(体积分数)甲醇水、20%(体积分数)乙腈水、甲醇-5 mmol/L甲酸铵(体积比=1∶4)和乙腈-5 mmol/L甲酸铵(体积比=1∶4)等溶剂的复溶效果。研究结果显示,复溶溶剂中有机相比例增加,绝大部分添加剂的回收率有所提高,但保留时间较短的化合物,如木糖醇、麦芽糖醇等化合物的峰型较差,对定性定量均有影响;20%(体积分数)甲醇水复溶时,苄索氯铵、赤藓红、丁基羟基茴香醚、甜蜜素、安赛蜜、糖精钠、橙皮苷、酸性红、特丁基对苯二酚、麦芽糖醇的回收率小于70%;20%(体积分数)乙腈水溶剂条件下,十六烷基二甲基苄基氯化铵、甘草酸、三氯蔗糖、麦芽糖醇、山梨醇、苯甲酸、木糖醇、苯氧乙酸回收率低于70%;20%(体积分数)甲醇-5 mmol/L甲酸铵和20%(体积分数)乙腈-5 mmol/L甲酸铵复溶时,回收率均在60%～120%。在峰形方面,未加甲酸铵的溶剂中,苋菜红、新红、赤藓红、山梨酸、安赛蜜、甜蜜素、糖精钠进样峰形有峰分裂和拖尾现象;20%(体积分数)乙腈-5 mmol/L甲酸铵溶液中,酸性红、胭脂红、苯甲酸、三氯蔗糖、木糖醇、麦芽糖醇和山梨糖醇进样峰形有拖尾现象;20%(体积分数)甲醇-5 mmol/L甲酸铵溶液中,以上化合物进样峰形有所改善。综合考虑峰型及各化合物回收率的影响,选择20%(体积分数)甲醇-5 mmol/L甲酸铵溶液体系进行复溶。图3列举了回收率受复溶溶剂影响较大的18种化合物研究结果。
图3 复溶溶剂对添加剂回收率的影响(n=3)
Fig.3 The impact of redissolution solvent on the recovery rate of additives (n=3)
2.3.3 滤膜的影响
文献报道PA滤膜对部分着色剂有吸附作用[20-21],研究采用酒精度为52%vol的白酒制备空白基质,配制质量浓度为200 ng/mL的基质标准溶液,经不同的滤膜过滤,以回收率为指标考察了PVDF滤膜、PP滤膜、PTFE滤膜、PA滤膜对目标化合物的吸附情况。结果表明,PA滤膜对大部分合成着色剂有较为明显的吸附作用,酸性红、日落黄、胭脂红、苋菜红、亮蓝、诱惑红和赤藓红的回收率均小于10%,明显低于其他3种滤膜,且该条件下甘草酸、溴氯芬、三氯卡班3种化合物的回收率显著小于其他3种滤膜;采用PVDF滤膜,9种合成着色剂的回收率为64.6%～94.9%,采用PP滤膜,9种合成着色剂的回收率为62.7%～97.8%,采用PTFE滤膜,9种合成着色剂的回收率为80.1%～87.5%;综合考虑选择PTFE滤膜进行过滤,滤膜考察整体结果见电子版增强出版附图2;图4中例举了受滤膜影响较大的17种添加剂的回收率情况。
图4 滤膜对17种添加剂回收率的影响(n=3)
Fig.4 The impact of filter membrane on the recovery rate of 17 additives (n=3)
2.3.4 基质效应考察
分别取酒精度为52%vol的白酒和配制酒,按1.3.1节制备基质匹配标准曲线,以5 mmol/L甲酸铵水溶液(含20%甲醇)作溶剂配制相同浓度的溶剂标准曲线,以文献[17]中的斜率法考察66种添加剂在白酒、配制酒中基质效应。结果显示,绝大部分添加剂在2种食品的基质效应基本一致,配制酒中基质效应为35.7%～147.3%,其中糖精钠和纳他霉素为基质增强,安赛蜜、甜蜜素、三氯蔗糖等20种为基质抑制;白酒中基质效应为33.8%～131.6%,赤藓红为基质增强,安赛蜜、三氯蔗糖等13种为基质抑制。为了兼顾多种添加剂的同时检测,实验中采用基质匹配标准曲线以抵消基质干扰、保证结果的准确性。白酒及配制酒中基质效应考察结果见电子版增强出版附表3。
表3 白酒样品中添加剂检出情况
Table 3 Detection of additives in Baijiu samples
化合物检出批次检出率/%预包装白酒散装白酒检出批次检出率/%含量范围/(mg/L)检出批次检出率/%含量范围/(mg/L)麦芽糖醇20353.43026.60.05～1.917364.790.05～453.1山梨糖醇15039.53833.60.05～7.511241.950.05～187.5苯甲酸6717.63127.40.10～0.83613.480.09～3.8木糖醇6015.8108.90.05～4.25018.730.05～2.0纽甜5414.2///5420.220.09～1.4三氯蔗糖369.5///3613.480.06～3.2安赛蜜246.3///248.990.08～6.4阿斯巴甜287.4///2810.490.05～7.0水杨酸266.8///269.740.05～16.4糖精钠256.6///259.360.05～0.8
注：“/”表示为未检出。
2.4 方法学考察
2.4.1 特异性
分别取配制酒、白酒空白样品按照1.3.2节进行前处理,经检测得到空白样品图谱,与溶剂标准溶液的色谱峰图进行对比。结果表明基质中不存在影响定性、定量分析的物质。
2.4.2 线性关系、检出限及定量限
取空白酒样,按照前处理方法得到空白基质溶液,按1.3.1节制备基质匹配系列标准溶液,以目标组分的峰面积(y)对相应的质量浓度(x)绘制标准曲线,以考察线性范围、相关系数(r)。66种添加剂的线性范围、检出限、定量限如表1所示,检出限为0.02～0.1 mg/L,定量限为0.04～0.2 mg/L。66种添加剂在2种基质中相关系数均大于0.999,表明添加剂在设定的浓度范围内均呈良好的线性关系。
2.4.3 准确度和精密度
取配制酒、白酒空白酒样,分别添加1倍定量限、5倍定量限、10倍定量限的目标分析物,每个添加水平重复测定6次,计算平均加标回收率和相对标准偏差(relative standard deviation, RSD),验证方法准确度和精密度,其结果见表2。66种添加剂在白酒中平均回收率为72.3%～117.2%,RSD为0.2%～9.5%,配制酒中平均回收率为62.6%～108.3%,RSD为1.0%～7.9%,方法的准确度和精密度均能满足定量分析的要求。
2.5 实际样品测定
利用建立的方法检测380批白酒(113批预包装、267批散装)和20批次配制酒中66种添加剂。在283批白酒中检出至少1种添加剂,白酒中共检出10种添加剂,检出率为15.1%(10/66),其中有8种为甜味剂,占所检甜味剂的44.4%(8/18),分别为阿斯巴甜、安赛蜜、纽甜、糖精钠、三氯蔗糖、麦芽糖醇、山梨糖醇、木糖醇,检出2种防腐剂:苯甲酸、水杨酸,占所检防腐剂的5.6%(2/36),未检出着色剂和抗氧化剂。各化合物检出批次、检出率及含量范围如表3所示,其中检出率排前三的依次为麦芽糖醇、山梨糖醇和苯甲酸。白酒中检出苯甲酸含量均小于GB 5009.28—2016《食品安全国家标准 食品中苯甲酸、山梨酸和糖精钠的测定》检出限(5 mg/kg),有文献报道苯甲酸为某些植物发酵产生[22],白酒中检出少量苯甲酸可能是发酵过程中产生的酸性物质经蒸馏而出,也有可能是超范围、低剂量使用防腐剂,或者是生产过程中使用了质量不达标的辅料;一共有213批散装白酒检出甜味剂,检出率为79.8%,其中有169批样品中检出2种及以上甜味剂,占比63.3%(169/267),提示散装白酒中可能存在小剂量、多种甜味剂同时使用的情况。20批配制酒均检出了添加剂,共检出20种添加剂,检出种类均属于GB 2760—2024《食品安全国家标准 食品添加剂使用标准》中规定可以在配制酒中使用的添加剂,检出化合物及含量如表4所示。有16批配制酒检出添加剂与产品标签标识不一致,占比80.0%(16/20),其中12批次检出添加剂数量多于标签标识,3批次检出添加剂数量少于标签标识,1批次检出添加剂与标识化合物完全不同,提示配制酒中存在实际使用添加剂与标签标识不一致的情况,可能是产品标签不规范或者是企业使用的添加剂原料标签不规范等。
表4 配制酒样品中添加剂检出情况
Table 4 Detection of additives in blended liquors
添加剂检出批次检出率/%含量/(mg/L)添加剂检出批次检出率/%含量/(mg/L)甜蜜素136511.8～459.1胭脂红3156.4～16.3三氯蔗糖105021.6～216麦芽糖醇21011.8～25.1山梨酸105011.6～211日落黄2103.6～8.0杜克苷A4200.2～1.2安赛蜜15289瑞鲍迪苷4206.2～10.4橙皮苷159.3 甜菊糖苷4206.3～14.9橙皮素152.8 苋菜红4209.8～21.6亮蓝1511.9苯甲酸3158.6～19.8木糖醇1566.3柠檬黄31511.4～29.1糖精钠15121山梨糖醇315 220～1 680诱惑红1515.8
3 结论
本研究通过优化仪器条件和前处理方法,建立了同时测定酒类食品中66种添加剂的UPLC-MS/MS方法,利用基质匹配标准曲线法进行定量,有效降低了基质效应对添加剂检测的影响。66种添加剂在设定的质量浓度范围内线性关系(r均大于0.999)良好,具有较好的回收率(62.6%～117.2%)和精密度(0.2%～9.5%),满足检测要求。通过对市售白酒、配制酒的检测发现,散装白酒中存在低含量、多种甜味剂同时添加的情况,其中糖醇类甜味剂的使用情况最为显著,市售配制酒中存在标签标识与实际检出不一致的情况。本研究所建立的方法操作简单、检测化合物种类多,具有高效、快速、准确,可用于市售酒类食品中66添加剂残留量的检测。与现有检测方法相比[23-25],该方法显著提高了酒类食品中添加剂的检测效率和覆盖率,研究结果可用于酒类食品生产企业的内部质量控制,也可以为酒类食品中添加剂风险监测提供技术支撑。
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