吡咯里西啶类生物碱(pyrrolizidine alkaloids,PAs)作为菊科、紫草科、豆科等植物在长期进化过程中为抵御植食性昆虫及病原微生物侵害产生的次生代谢产物,广泛分布于药用植物及开花植物[1]。近年来PAs作为茶叶中的代表性新污染物受到广泛关注,茶树本身不能合成PAs,生长采摘过程通过直接或间接途径被污染。茶园中伴生杂草(如菊科千里光属、藿香蓟等)的根系分泌物通过"杂草-土壤/水系-茶树"跨介质迁移入茶叶;误采摘含有PAs的杂草间接污染茶叶原料, 或加工过程环境中PAs污染茶叶[2-4]。茶叶中PAs污染来源复杂且分布不均,精准检测技术门槛高,在日常抽检中易漏检,茶叶中PAs高效检测方法的建立,保障茶叶的食用安全。
研究发现PAs及PAs氮氧化物(PAs N-oxides,PANOs) 可随饮食进入人体,经肝细胞色素P450酶代谢活化,生成具有强亲电子性的脱氢吡咯代谢产物(dehydropyrrolizidine alkaloids,DHPAs),与胞内亲核性物质结合形成加合物引发脏器损伤,对人体的肺、肝脏、肾脏及胚胎具有显著毒性,长期饮食暴露可导致肝窦阻塞综合征和肝癌[5-7]。许多国家和组织对食品中PAs的污染予以高度关注。PAs污染不仅会带来食品安全风险,还会对茶叶产业构成威胁,欧盟2023年颁布的(EU)2023/915法规中明确规定了植物制剂、茶及代用茶、花粉制品的最高限量,其中茶及代用茶中21种PAs/PANOs总限量不得超过150 μg/kg。我国作为全球最大茶叶生产与消费国,茶叶年产量超过百万吨[8],出口量约占全球茶叶市场的40%[9]。目前我国尚无茶叶中PAs明确的检测标准和限量要求[10-11],即无法对市售茶叶中PAs污染进行有效的监测。欧盟、澳大利亚等国家严格执行PAs限量标准,致使我国茶叶出口受到一定影响。建立茶叶中PAs检测技术可以有效监测茶叶PAs的污染水平,评估其风险,保护消费者健康,打破进出口贸易技术壁垒。
食品中PAs污染的检测方法有分光光度法、毛细管电泳法、免疫学方法以及色谱分析法[12-14]。分光光度法、毛细管电泳法缺点是检出限较高,无法满足茶叶中PAs痕量污染的检测需求。免疫学方法检测速度快但准确度差,假阳(阴)性率高,很难准确定量不同种类PAs污染。采用液相色谱分析法检测PAs及PANOs时,由于其无特征的紫外吸收光谱,存在理化性质接近的同分异构体[15-16],导致色谱分离度差、检测灵敏度较低、无法准确痕量检测。随着检测技术的发展,液相色谱-串联质谱法成为茶叶中PAs残留检测的主流方法[17],朱雷[18]利用超高效液相色谱串联质谱结合固相萃取建立了茶园体系中15种PAs的检测方法,评估安徽省六大茶叶主产区的茶园体系中PAs的污染风险。万静宜等[19]基于高效液相色谱-串联质谱采用浸提过夜的前处理提取方式,建立了茶叶中21种PAs的分析方法。
随着多国在茶叶及相关制品中检出PAs种类的增加,提示茶叶中PAs污染风险不断增高,如何突破痕量检测与标准化体系建设的技术难关成为亟需解决的问题。本研究基于目前茶叶中PAs污染现状引发的食品安全风险,以欧盟监测的21种PAs及PANOs为中心,扩大现有的检测范围以期覆盖更广泛的PAs污染种类,通过优化前处理方法结合基质匹配标准曲线法,采用超高效液相色谱-串联质谱法建立了茶叶中31种PAs的检测方法,为茶叶中PAs污染来源、污染水平监测提供方法学依据和技术支撑,建立我国自主PAs检测标准体系,提升茶叶产业在国际贸易中的竞争力。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
甲醇、乙腈、甲酸(色谱纯),购自德国Merck公司;其他试剂均为分析纯,购自成都市科隆化学品有限公司;0.22 μm尼龙滤膜,购自天津津腾实验设备有限公司;DiKMA ProElut PXC(Phase Extraction Cartridges)固相萃取小柱(60 mg/3 mL),购自迪马科技有限公司;50 mL、15 mL离心管,购自生工生物工程(上海)股份有限公司。
31种PAs标准品,上海甄准生物科技有限公司与成都德思特生物技术有限公司,详细信息见表1。
表1 PAs标准品名称及CAS号
Table 1 Names and CAS numbers of PAs standards
名称英文缩写CAS号名称英文缩写CAS号野百合碱Mct315-22-0千里光非灵碱Sep480-81-9芝麻菜叶千里光碱Eru40158-95-0天芥菜碱Hel303-33-3野百合碱氮氧化物MctNO35337-98-57-乙酰促黑激素7-Ace74243-01-9芝麻菜叶千里光碱氮氧化物EruNO123864-94-8千里光非灵碱氮氧化物SepNO38710-26-8千里光碱Jac6870-67-37-乙酰促黑激素氮氧化物7-AceNO685132-59-6欧天芥菜碱Eur570-19-4天芥菜碱氮氧化物HelNO6209-65-0促黑激素Int10285-06-0春千里光碱Sec72755-25-0石松胺Lyc10285-07-1千里光宁碱Sen130-01-8千里光碱氮氧化物JacNO38710-25-7春千里光碱氮氧化物SecNO101687-28-9倒千里光碱氮氧化物RetNO15503-86-3千里光宁碱氮氧化物SenNO13268-67-2瑞氏千里光碱Rid23246-96-0蓝蓟定Ech520-68-3欧天芥菜碱氮氧化物EurNO65582-53-8蓝蓟定氮氧化物EchNO41093-89-4促黑激素氮氧化物IntNO95462-14-9克氏千里光碱Sek2318-18-5石松胺氮氧化物LycNO95462-15-0毛果天芥菜碱Las303-34-4倒千里光碱Ret480-54-6毛果天芥菜碱氮氧化物LasNO127-30-0毛束草碱Tri548-90-3
1.2 仪器与设备
Agilent 1290 InfinityⅡ高效液相色谱仪-串联Agilent 6470三重四级杆质谱仪,美国Agilent公司;Milli-Q型超纯水系统,美国Millipore公司;5810R高速冷冻离心机、电子移液器,德国Eppendorf公司;KH-500DE型数控超声波清洗器,昆山禾创超声仪器有限公司;BP211D型分析天平,德国Sartorius公司;MPEva Ⅱ平行氮吹浓缩液,睿莱博仪器(广州)有限公司;XW-80A型涡旋混合仪,上海驰唐实业有限公司。
1.3 实验方法
1.3.1 标准溶液的配制
依次称取31种PAs的标准品(精度0.1 mg),甲醇为溶剂,制得10 mg/mL得混合标准母液,贮藏在-20 ℃;准确吸取100 μL混合标准储备母液,于10 mL容量瓶中,甲醇稀释定容,配制为质量浓度为100 ng/mL的混合标准工作液,-20 ℃保存。
茶叶基质匹配标准曲线:采用1.3.2节样品前处理方法制备茶叶空白样品溶液,通过稀释混合标准工作液配制一系列基质匹配标准曲线溶液。
1.3.2 茶叶样品前处理
1.3.2.1 样品提取
将干茶样品粉碎、过60目药典筛,称取1 g(精确至0.1 g)样品于50 mL离心管,加入10 mL 95%(体积分数)乙醇溶液[含0.1%(体积分数)甲酸],40 Hz超声提取30 min;离心5 min(8 500 r/min),收集上清液,残渣按相同方法复提1次,离心后合并上清液,40 ℃氮吹浓缩至5 mL,用0.1%甲酸水定容至10 mL,离心5 min(8 500 r/min)获得上清液。
1.3.2.2 样品净化
ProElut PXC固相萃取小柱依次经3 mL甲醇和3 mL 0.1%甲酸水活化;准确移取5 mL待测上清液过柱;先后以3 mL去离子水、3 mL甲醇淋洗杂质;5 mL 5%(体积分数)氨水甲醇溶液洗脱目标物,洗脱液经40 ℃氮气吹干浓缩;残留物用50%(体积分数)甲醇水溶液(含0.1%甲酸)定容至1 mL,涡旋振荡30 s联合超声处理10 s复溶,最终经0.22 μm有机相尼龙滤膜,待上机分析。
1.3.3 色谱条件
色谱柱:Agilent Eclipse Plus C18(3.0 mm×150 mm,1.8 μm);柱温:40 ℃;流动相:A为含5 mmol/L甲酸铵的0.1%甲酸水溶液,B为甲醇,C为乙腈;流速:0.3 mL/min;进样量:2 μL。梯度洗脱程序:0～2 min,95%～90%流动相A,5%～10%流动相B;2.0～5.0 min,90%～80%流动相A,10%～20%流动相B;5.0～10.0 min,80%流动相A,20%流动相B;10.0～16.0 min,80%～60%流动相A,20%～40%流动相B;16.0～18.0 min,60%～50%流动相A,40%～50%流动相B;18.0～22.0 min,50%流动相A,50%流动相B;22.0～25.0 min,50%～5%流动相A,50%～0流动相B,0～95%流动相C;25.0～28.0 min,5%流动相A,95%流动相C;28.0～28.1 min,5%～95%流动相A,0～5%流动相B,95%～0流动相C;28.1～35.0 min,95%流动相A,5%流动相B。
1.3.4 质谱条件
离子源:电喷雾离子源,正离子扫描模式;毛细管电压:3 500 V;鞘气温度:350 ℃,流速:12 L/min;干燥气温度:350 ℃,流速:12 L/min;雾化气压力:241.3 kPa(35 psi);检测方式:多反应监测(multi-reaction monitoring,MRM)。各化合物的质谱参数见表3。
表3 PAs的质谱参数
Table 3 Mass spectrometry parameters of the PAs
化合物名称保留时间/min母离子m/z子离子m/z碎裂电压/V碰撞能量/eVMct7.603326.394∗;12013555∗; 42Eru8.501350.2120∗; 9414030∗; 45MctNO9.48342.2137∗; 9414030∗; 55EruNO9.697366.194∗; 13613552∗; 32Jac9.852352.2120∗; 155.113532∗; 27Eur10.135330.2138∗; 9411522∗; 50Int10.183300.294∗; 13813027∗; 17Lyc10.606300.394∗; 67.112027∗; 60JacNO10.848368.2120; 296.2∗14025; 42∗RetNO10.848368.294.1; 120∗14055; 42∗Rid10.91350.2120; 94∗13042; 30∗EurNO11.267346.2172.1∗; 11113032∗; 50IntNO12.265316.2111∗; 9414045∗; 47LycNO12.942316.2111∗; 94.113545∗; 47Ret14.183352.394; 120∗14042; 30∗Tri14.753354.394∗; 12013560∗; 45Sep15.673334.394∗; 12013537∗; 27Hel16.077314.3138.1∗; 9412520∗; 407-Ace16.246342.2120∗; 180.113525∗; 15SepNO16.702350.294∗; 12013552∗; 377-AceNO16.735358.3180.1∗; 137.113530∗; 32HelNO17.337330.2172∗; 11013527∗; 60Sec17.91336.394∗; 12013045∗; 32Sen18.175336.394∗; 12013037∗; 30SecNO18.474352.294∗; 12013552∗; 42SenNO18.839352.294∗; 11813055∗; 32Ech20.094398.3120∗; 82.912525∗; 27EchNO20.147414.2254.1∗; 8314032∗; 50Sek20.577366.370.1; 168∗13555; 30∗Las22.142412.3120∗; 220.112521∗; 35LasNO23.521428.3254.1∗; 9414050∗; 32
注：子离子*代表定量离子,碰撞能量*对应定量离子的碰撞能量。
1.3.5 方法验证
1.3.5.1 线性范围、检出限与定量限验证
采用阴性茶叶样品按照前处理步骤制备成标准稀释液,配制成不同质量浓度的基质匹配标准曲线,采用建立的方法进行测定。以定量离子的峰面积为纵坐标,响应的质量浓度为横坐标绘制标准工作曲线,以6次平均信噪比(S/N)大于3确定PAs的检出限(limit of detection,LOD),信噪比(S/N)大于10确定PAs的定量限(limit of quantitation,LOQ)。
1.3.5.2 准确度与精密度验证
为了验证本方法检测茶叶中PAs的可行性,以阴性茶叶样品为基质,进行低、中、高质量浓度(2、5、10 μg/kg)3个水平的加标回收实验,按照1.3.2节、1.3.3节及1.3.4节的方法进行样品前处理,考察方法的准确度和精密度。
1.3.5.3 基质效应的考察
茶叶基质含有多糖、氨基酸、茶多酚等大量生物活性成分,在检测分析过程中易引发显著的基质效应干扰质谱信号,为进一步提高检测方法的准确性,需评估检测过程中的基质效应(matrix effect,ME)。称取数份阴性茶叶样品,按照1.3.2节茶叶样品前处理步骤制备空白基质溶液,分别以空白基质溶液与50%甲醇水溶液(含0.1%甲酸)为溶剂将混合标准工作液稀释配制成质量浓度为0.5、1、2、2.5、5、7.5、10 ng/mL的2条标准曲线工作液。以曲线斜率计算基质效应[20],具体计算如公式(1)所示:
(1)
式中:k1为基质匹配标准曲线斜率;k2为溶剂标准曲线斜率。
1.4 数据处理
采用Excel 2021软件进行数据统计和处理,方法优化实验数据重复3次,方法验证实验数据重复6次,最终结果取平均值,根据相对标准偏差分析数据结果,采用Graphpad Prism 9.5软件绘图。
2 结果与分析
2.1 质谱条件的优化
对31种目标物单一标准溶液依次进行全扫描确定31种化合物在正离子模式下[M+H]+母离子具有最佳响应,选择离子监测模式(selected ion monitoring,SIM)下进行子离子扫描分别确定2个最佳子离子,建立MRM,完成碎裂电压和碰撞能量优化。在接入液相色谱流动相后以峰面积响应值为参考进一步优化离子源温度、毛细管电压等其余质谱条件,优化结果见1.3.4节。
2.2 色谱条件的优化
2.2.1 色谱柱选择
基于PAs的化学结构与性质,考虑到PAs分子中普遍含有的氨基、羟基等极性基团,这些基团易与色谱柱填料表面未封闭的硅羟基(Si—OH)产生氢键或离子交换作用,导致峰拖尾、保留时间漂移等问题。而双封端技术能够低硅羟基残留量,减少此类非特异性吸附,从而提升目标化合物的峰形对称性和分离效率。对比封端与不封端的4种色谱柱[Agilent RRHD SB-C18(2.1 mm×100 mm,1.8 μm)、XSELECTTM HSS T3(3.0 mm×100 mm,2.5 μm)、Agilent SB-Phenly RRHD(2.1 mm×100 mm,1.8 μm)以及Agilent Eclipse Plus C18(3.0 mm×150 mm,1.8 μm)]对各待测目标化合物分离和响应的影响。结果表明,4种色谱柱都能实现不同种类的PAs的初步分离。如图1所示,在同分异构体的分离表现中,Eclipse Plus C18色谱柱对Int与Lyc、IntNO与LycNO、Sec与Sen以及SecNO与SenNO四对同分异构体的分离效果最佳。因此,后续选用Agilent Eclipse Plus C18(3.0 mm×150 mm,1.8 μm)色谱柱进行检测分析。
A-Int和Lyc的MRM图;B-IntNO和LycNO的MRM图;C-Sen和Sec的MRM图;D-SenNO和SecNO的MRM图
图1 八种PAs同分异构体
Fig.1 Structural isomers of the eight PAs
2.2.2 流动相的优化
目标化合物的峰面积响应强度受到多个因素的影响,包括流动相组成、pH值、流速等,为提高方法准确性与灵敏度,考察甲醇与乙腈分别作为有机相时目标化合物的分离情况、峰面积大小与峰型。结果表明,当甲醇作为有机相时,能显著提升大部分目标物响应强度,31种目标化合物之间的分离度更高,选取甲醇-水作为流动相,水相中添加0.1%甲酸,利用其提高离子化效率的特性优化目标物检测。随后比较流动相中缓冲盐——甲酸铵浓度对目标物色谱分离度和响应值的影响,最终选用0.1%甲酸水(含5 mmol/L甲酸铵)-甲醇体系作为流动相,在洗脱程序25 min后引入了乙腈以消除长时间连续检测时目标物残留对仪器精密度的影响。优化后的31种PAs总离子流色谱图见图2。
图2 PAs的总离子流
Fig.2 Total ion current of the PAs
注:1:Mct;2:Eru;3:MctNO;4:EruNO;5:Jac;6:Eur;7:Int;8:Lyc;9:JacNO;10:RetNO;11:Rid;12:EurNO;13:IntNO;14:LycNO;15:Ret;16:Tri;17:Sep;18:Hel;19:7-Ace;20:SepNO;21:7-AceNO;22:HelNO;23:Sec;24:Sen;25:SecNO;26:SenNO;27:Ech;28:EchNO;29:Sek;30:Las;31:LasNO。
2.3 样品前处理条件的优化
2.3.1 提取溶剂的考察
PAs在pH值较低时常以离子形式存在,酸溶液的加入能够增强化合物的离子化效率从而提高萃取效率。选用阴性茶叶作为基质,以各待测目标物在5 μg/kg添加水平时的平均回收率为指标,考察0.05 mol/L H2SO4、95%乙醇(含0.1%甲酸)及95%乙醇(含0.05 mol/L H2SO4)对待测目标物提取效率的影响。如图3所示,在95%乙醇(含0.1%甲酸)中31种化合物的回收率均在60%以上,其他2种溶剂中均有2个化合物回收率低于60%,进一步比较毒性较强的Sen、Mct、Ret、Hel、Eur、Las 6种PAs,得出95%乙醇(含0.1%甲酸)的提取效率最高,回收率达72.7%～101%。最终选择95%乙醇(含0.1%甲酸)作为茶叶的提取溶剂。另外,为了提高前处理过程的提取回收率,促使样品均匀并充分提取,在制样时添加过筛程序(60目)以及提取过程增加超声波辅助提取。
图3 不同提取溶剂提取效率比较
Fig.3 Comparative study on extraction efficiency of different solvents
注:*P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001,ns代表无显著性差异(下同)。
2.3.2 样品净化条件的优化
茶叶基质成分复杂,对提取液进行净化以减少杂质对目标化合物的质谱信号干扰。研究采用固相萃取的方式对样品提取液进行净化,对比了HLB(Hydrophilic-Lipophilic Balance)、PXC及MCX(Mixed-Mode Cation-Exchange)固相萃取小柱对茶叶基质的净化效果。以阴性茶叶为基质,各待测目标物在5 μg/kg添加水平时的平均回收率为指标,考察了Waters Oasis MCX小柱(60 mg/3 mL)、DiKMA ProElut PXC小柱(60 mg/3 mL)和Waters Oasis HLB小柱(60 mg/3 mL)对茶叶基质中各干扰物质的净化效果,对比HLB、PXC及MCX固相萃取小柱对茶叶基质的净化效果。如图4所示,上述3种小柱对茶叶中PAs萃取净化的回收率分别为56.4%～125%、60.3%～122.1%、0%～105.3%,HLB小柱对近10种PAs都不保留,尤其是PANOs,可能是由于HLB是反相吸附,主要依靠疏水作用保留非极性或弱极性化合物,而对高极性化合物的保留能力有限,说明HLB小柱不适合用于食品中多种PAs及PANOs同时检测的净化手段。MCX小柱与PXC小柱净化结果回收率总体相近且能够满足要求。实验过程中发现使用PXC小柱的实验效率高于MCX小柱,并且实验使用的PXC小柱成本低于MCX小柱,所以本研究采用PXC固相萃取小柱作为样品净化小柱。
图4 不同SPE小柱的净化效率
Fig.4 Cleanup efficiency of different SPE columns
2.3.3 基质效应考察
基质效应的强弱会直接影响目标物检测结果的准确性与重复性,根据前文方法计算茶叶的基质效应。如图5所示,茶叶复杂的基质成分对PAs的检测造成了不可忽视的基质效应,大部分PAs/PANOs存在比较明显的基质抑制效应,尤其是SepNO、Eru、Rid均在-60%以上,说明不同种类PAs在检测过程中受基质干扰的程度不同。因此,为提高多种PAs同时检测方法结果的准确性,采用固相萃取净化结合空白基质匹配标准曲线法进行31种PAs的定量分析。优化后的固相萃取净化过程能除去茶叶样品提取液中大部分色素、氨基酸和茶多酚等干扰物质,还能延长色谱柱和离子源的使用寿命。采用不含目标化合物的空白茶叶基质制备标准曲线,使其与待测样品基质背景高度一致,在目标化合物离子化过程中可有效补偿产生的基质抑制或增强效应,从根本上校正定量误差。2种优化策略相结合能够降低基质效应带来的影响,提高定量分析的准确性。该方法能有效应对不同种类、不同复杂程度的茶叶基质,在不同实验室间应用均有良好的可操作性与重现性。
图5 PAs的基质效应
Fig.5 Matrix effects of PAs
2.4 方法学评价
2.4.1 线性范围、检出限与定量限
不同化合物的线性范围和相关系数结果见表4,31种PAs在对应的质量浓度范围内线性关系较好,相关系数(r2)均大于0.997;方法LOQ为0.2～2 μg/kg,LOD为0.06～0.66 μg/kg。
表4 茶叶中PAs的线性方程、检出限和定量限
Table 4 Linear equations, LOD, and LOQ for PAs in tea
化合物回归方程r2线性范围/(μg/L)LOD/(μg/kg)LOQ/(μg/kg)Mcty=761.809 955x+66.344 7200.999 10.25～50 0.160.5Eruy=730.886 451x+4.907 9690.999 51～2000.662MctNOy=867.459 214x+100.172 1170.999 20.1～20 0.060.2EruNOy=1 066.085 040x+37.352 4440.999 30.25～50 0.160.5Jacy=953.504 575x+126.772 6320.998 40.25～50 0.160.5Eury=3 233.854 813x+128.585 6370.999 60.25～50 0.160.5Inty=8 554.933 598x+240.131 5550.999 80.25～50 0.160.5Lycy=6 757.383 570x+384.331 3340.999 50.25～50 0.160.5JacNOy=1 409.820 191x+17.333 1580.999 41～2000.662RetNOy=1 460.087 441x+91.161 6410.999 51～2000.662Ridy=666.983 636x+3.488 3000.999 60.25～50 0.160.5EurNOy=3 042.852 626x+108.584 5930.999 20.25～50 0.160.5IntNOy=2 500.515 507x+79.234 1830.999 71～2000.662LycNOy=2 289.824 231x+105.102 3240.999 61～2000.662Rety=953.100 241x+126.951 8260.998 40.25～50 0.160.5Triy=866.853 884x-13.536 2940.996 61～2000.662
续表4
化合物回归方程r2线性范围/(μg/L)LOD/(μg/kg)LOQ/(μg/kg)Sepy=678.452 309x-122.887 5910.997 31～2000.662Hely=5 419.208 491x+410.935 5500.999 80.25～50 0.160.57-Acey=4 859.308 766x+64.657 3810.999 70.1～20 0.060.2SepNOy=1 209.713 910x+13.010 2470.999 20.25～50 0.160.57-AceNOy=893.043 148x-132.898 2860.998 61～2000.662HelNOy=4 362.461 247x+12.936 2600.999 80.1～20 0.060.2Secy=911.877 591x-7.205 1350.999 61～2000.662Seny=1 891.774 646x-48.631 0760.999 61～2000.662SecNOy=2 384.579 889x+15.924 9760.999 71～2000.662SenNOy=2 397.023 400x+18.207 4290.998 50.25～50 0.160.5Echy=3 667.481 324x+138.094 3780.999 70.1～20 0.060.2EchNOy=2 704.196 319x+69.887 9870.999 60.25～50 0.160.5Seky=2 390.843 973x+17.534 1250.999 60.1～20 0.060.2Lasy=5 526.475 159x+41.378 8830.999 80.1～20 0.060.2LasNOy=1 672.043 689x+55.971 5190.999 70.25～50 0.160.5
2.4.2 准确度与精密度
如表5所示,31种PAs在茶叶基质中3个浓度水平的回收率为60.4%～101.6%,相对标准偏差(relative standard deliation,RSD)为0.1%～6.0%,该方法验证结果显示良好的准确度与精密度性能,能够满足目标化合物的分析要求。
表5 PAs的平均回收率与相对标准偏差
Table 5 Average recovery and RSD of PAs
化合物名称2 μg/kg5 μg/kg10 μg/kg回收率/%RSD/%回收率/%RSD/%回收率/%RSD/%Mct87.52.580.5178.11.9Eru83.13.575.31.276.72.2MctNO90.63.883285.12.9EruNO87.33.182.41.883.34.8Jac821.675.91.4773.23.6Eur86.70.7822.381.22.3Int91.60.884.90.7844.4Lyc87.92.982.92.384.22.8JacNO89.50.681.40.981.54.3RetNO77.42.8791.679.75.1Rid70.63.967.4669.61.5EurNO86.80.987.30.885.53.1IntNO101.62100.30.299.15.5LycNO88.11.487.61.687.63.9Ret71.14.567.52.166.60.63Tri78.73762.274.90.5Sep72.64.969.54.669.44.3Hel86.31.981.20.781.73.37-Ace841.980.10.180.12.7SepNO82.43.680477.52.47-AceNO74.25.268.3271.34.7HelNO86.80.885.32.685.33.9Sec80.44.475.63.574.32.2Sen80.62.5733.876.81.3SecNO81278.8578.34.8SenNO831.379.6179.45.8Ech81.71.278.6377.62.1EchNO84.30.783.82.783.92.8Sek78.81.776.6376.23.2Las77.91.477.14.176.52.2LasNO75.80.876.54.576.12.3
2.5 实际样品测定
将市面购买的茶叶样品按顺序编号为01～40,并选择3份样品以5 μg/kg添加水平进行加标检测,编号为41～43。按照1.3.2节、1.3.3节及1.3.4节”进行样品前处理和检测。结果显示,Lyc及LycNO的检出率最高。6份样品检出PAs/PANOs,其中5份样品检出Lyc及LycNO;3份样品检出RetNO;4份样品检出JacNO;2份样品检出Sek,总含量为2.4～13.3 μg/kg,低于欧盟限量标准的总含量150 μg/kg,具体结果见表6。
表6 样品中PAs检出情况 单位:μg/kg
Table 6 The detection situations of PAs in the samples
化合物样品编号040809151821Lyc1.3——0.82.21.0LycNO1.2—2.41.25.10.8RetNO—2.4—0.61.0—JacNO—3.2—2.73.81.1Sek1.6———1.2—Sum contents4.15.62.45.313.32.9
注：—表示无数据。
3 结论与讨论
针对茶叶中PAs污染对全球食品安全和国际贸易构成的严峻挑战,本研究建立了基于超高效液相色谱-串联质谱技术的多组分同步检测体系。通过酸化乙醇溶剂体系提高提取效率,结合PXC固相萃取柱的选择性净化,克服茶叶基质中多酚、色素及其他生物碱的干扰,解决化学结构相似的同分异构体的分离问题,实现了茶叶中31种PAs及PANOs的同步检测与准确定量。进一步将方法应用于实际样品检测,发现PAs检出率较低,可能是因为不同品种茶叶采摘部位及标准要求不同,PAs污染茶叶存在地区性和种间差异。采摘生产过程严格管控在一定程度上避免PAs污染,采收期较早且采摘部位离地面越高,混入杂草的风险越低,在茶园周边含PAs杂草开花结籽前进行采收也可避免污染。本研究的方法学验证结果表明,该方法在灵敏度、选择性和重现性方面表现优异,能够满足茶叶中痕量PAs的检测需求,可应用于茶叶生产全产业链的质量控制,从原料验收、生产监控到上市前检验,尤其可为大型出口企业提供技术支持。在横向研究中同时验证了本方法在玉米、大米等食品中的应用,研究结果表明了该方法的应用广泛性,证实其在实际监管场景中的适用性,为突破国际贸易技术壁垒、保障消费者健康提供了关键技术支撑,也为我国食品安全标准的动态完善及风险防控策略的制定奠定基础。该技术方法在推广中面临仪器成本高、专业操作性强和各国限量标准不一等挑战,未来研究可进一步拓展该方法在草药、代用茶等复杂基质中的应用,在方法优化上继续开发低成本、高通量、高灵敏度、抗基质干扰能力更强的检测方法。以预防为主的原则深入探究PAs在茶叶加工链中的迁移转化规律,结合茶园生态环境,研究茶叶中PAs污染程度与周边杂草种类及密度的相关性,从而构建全产业链风险管控体系。
[1] HAN H L, JIANG C L, WANG C, et al. Development, optimization, validation and application of ultra high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry for the analysis of pyrrolizidine alkaloids and pyrrolizidine alkaloid N-oxides in teas and weeds[J]. Food Control, 2022, 132:108518.
[2] 焦艳娜, 彭梦香, 梁香, 等. 茶叶中吡咯里西啶生物碱残留量检测方法及研究现状[J]. 中国茶叶, 2024, 46(3):12-20.JIAO Y N, PENG M X, LIANG X, et al. Research progress on detection methods and current status of residual pyrrolizidine alkaloids in tea[J]. China Tea, 2024, 46(3):12-20.
[3] LU Y T, HAN H L, YI Y X, et al. Insight into the sorption and desorption pattern of pyrrolizidine alkaloids and their N-oxides in acidic tea (Camellia sinensis) plantation soils[J]. Journal of Environmental Sciences, 2025, 148:350-363.
[4] RIZZO S, CELANO R, PICCINELLI A L, et al. Target screening method for the quantitative determination of 118 pyrrolizidine alkaloids in food supplements, herbal infusions, honey and teas by liquid chromatography coupled to quadrupole orbitrap mass spectrometry[J]. Food Chemistry, 2023, 423:136306.
[5] 孙潇翔, 向娥, 邱帅凯, 等. 吡咯里西啶生物碱毒性作用研究进展[J]. 中国药物警戒, 2019, 16(2):76-80.SUN X X, XIANG E, QIU S K, et al. Research progress on toxicity of pyrrolizidine alkaloids[J]. Chinese Journal of Pharmacovigilance, 2019, 16(2):76-80.
[6] LONG Y, WANG Y W, SONG Z J, et al. Repair of retrorsine-induced DNA damage in rat livers: Insights gained from transcriptomic and proteomic studies[J]. Toxins, 2024, 16(12):538.
[7] 李慧茹, 谢新, 华玉美多, 等. 用野百合碱诱导的肺动脉高压雄性大鼠的右心室结构与功能变化[J]. 中国高原医学与生物学杂志, 2024, 45(2):83-89.LI H R, XIE X, HUA Y, et al. Structural and functional changes of right ventricle in male rats with monocrotaline-induced pulmonary arterial hypertension[J]. Chinese High Altitude Medicine and Biology, 2024, 45(2):83-89.
[8] 国家统计局. 中华人民共和国2024年国民经济和社会发展统计公报[J]. 中国统计, 2025(3): 4-21.National Bureau of Statistics of China. Statistical communiqué on national economic and social development of people’s republic of China (PRC) in 2024[J]. China Statistics, 2025(3):4-21.
[9] 杨兴锐, 孙婉琪, 杨雪, 等. 中国茶叶出口面临的绿色贸易壁垒及应对策略[J]. 中国茶叶加工, 2025(1):63-69.YANG X R, SUN W Q, YANG X, et al. Green trade barriers to China’s tea exports and response strategies[J]. China Tea Processing, 2025(1):63-69.
[10] 韩浩蕾, 姜长岭, 王晨, 等. 茶叶中吡咯里西啶生物碱检测技术、污染水平及健康风险研究进展[J]. 食品科学, 2021, 42(17):255-266.HAN H L, JIANG C L, WANG C, et al. Pyrrolizidine alkaloids in tea: A review of analytical methods, contamination levels and health risk[J]. Food Science, 2021, 42(17):255-266.
[11] 刘慧, 穆同娜, 林立, 等. 食物源吡咯里西啶类生物碱污染水平、检测技术及加工影响的研究现状[J]. 食品工业科技, 2023, 44(24):392-403.LIU H, MU T N, LIN L, et al. Research progress on contamination levels, analytical methods and processing effects of pyrrolizidine alkaloids in food[J]. Science and Technology of Food Industry, 2023, 44(24):392-403.
[12] GARC
A-JUAN A, LE
N N, ARMENTA S, et al. Development and validation of an analytical method for the simultaneous determination of 12 ergot, 2 tropane, and 28 pyrrolizidine alkaloids in cereal-based food by LC-MS/MS[J]. Food Research International, 2023, 174:113614.
[13] 姜冰, 丁涛, 曹崇江, 等. HPLC-MS/MS法同时测定动物源性食品中9种吡咯里西啶类生物碱的含量[J]. 分析测试学报, 2020, 39(4):473-478.JIANG B, DING T, CAO C J, et al. Determination of 9 pyrrolizidine alkaloids in animal-derived foods by HPLC-MS/MS[J]. Journal of Instrumental Analysis, 2020, 39(4):473-478.
[14] ROLLO E, CATELLANI D, DALL’ASTA C, et al. QuEChERS method combined to liquid chromatography high-resolution mass spectrometry for the accurate and sensitive simultaneous determination of pyrrolizidine and tropane alkaloids in cereals and spices[J]. Journal of Mass Spectrometry, 2023, 58(10): e4969.
[15] 姚蕾珺, 陈燕秋, 林浩, 等. 一体化QuEChERS净化-超高效液相色谱-串联质谱法测定茶叶中27种吡咯里西啶类生物碱[J]. 茶叶科学, 2024, 44(5):831-842.YAO L J, CHEN Y Q, LIN H, et al. Simultaneous determination of 27 pyrrolizidine alkaloids in tea by ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry with integrated QuEChERS purification[J]. Journal of Tea Science, 2024, 44(5):831-842.
[16] 夏珍珍, 彭茂民, 郑丹, 等. 湖北省茶叶中吡咯里西啶生物碱污染概况及健康风险评估[J]. 农产品质量与安全, 2021(4):23-29.XIA Z Z, PENG M M, ZHENG D, et al. Spatial variation and risk assessment of pyrrolizidine alkaloids(PAs) in tea in Hubei province[J]. Quality and Safety of Agro-Products, 2021(4):23-29.
[17] KWON Y, KOO Y, JEONG Y. Determination of pyrrolizidine alkaloids in teas using liquid chromatography-tandem mass spectrometry combined with rapid-easy extraction[J]. Foods, 2021, 10(10):2250.
[18] 朱雷. 吡咯里西啶生物碱在茶叶中的污染来源及风险评估[D]. 合肥: 安徽农业大学, 2021.ZHU L. Contamination source and risk assessment of pyrrolizidine alkaloids in tea[D]. Anhui: Anhui Agricultural University, 2021.
[19] 万静宜, 冯超, 陈宇航, 等. 茶叶中21种吡咯里西啶生物碱检测方法研究[J]. 分析测试学报, 2023, 42(10):1351-1356. WAN J Y, FENG C, CHEN Y H, et al. Simultaneous determination of 21 pyrrolizidine alkaloids in tea[J]. Journal of Instrumental Analysis, 2023, 42(10):1351-1356.
[20] 吴微, 管驰, 王顾希, 等. 固相萃取-高效液相色谱-串联质谱法测定尿液中8种双酚类物质[J]. 中国测试, 2023, 49(8):75-80.WU W, GUAN C, WANG G X, et al. Determination of 8 kinds of bisphenols in urine by solid phase extraction combined with high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry[J]. China Measurement &Test, 2023, 49(8):75-80.