陈皮(Citri Reticulatae Pericarpium, CRP)为芸香科植物橘Citrus reticulata Blanco及其栽培变种的干燥成熟果皮[1],是一种药食同源原料,不仅可作为食品添加,亦可为茶饮[2]。本品性温,味苦、辛,归脾、肺经,具有理气健脾、燥湿化痰的功效,临床广泛用于脘腹胀满、食少吐泻、咳嗽痰多等症状[3]。陈皮的主要活性成分为挥发油和黄酮类化合物,具有抗炎、抗菌、促进消化、祛痰、平喘等作用[4]。典籍记载陈皮具有辛燥之性,“陈则烈气消,无燥散之患”[5]。挥发油是陈皮辛燥之性的主要来源,其含量随陈化时间的延长而逐渐减少[6]。陈嘉谟载:“米泔水制去燥性和中”,米泔水含有少量淀粉和维生素,具有一定的吸附能力,能够去除其中的油脂成分,从而降低辛燥之性,增强其补脾和中的作用[7-8]。米在食品、发酵领域应用广泛,发酵可以显著提升大米制品的口感、质地、风味,发酵后能降解蛋白质和脂肪,减少灰分,增加游离脂肪酸,同时提高淀粉糊化特性[9-10]。在糙米发酵中,微生物激活内源酶,释放更多膳食纤维、维生素和酚类化合物,提升营养生物利用度,并改善消化和老化特性[11-12]。米泔水富含天然微生物,如乳酸菌、醋酸菌等,在发酵过程中富集益菌群[13]。米泔水漂陈皮(MGCRP)首载于《证治准绳》,“陈皮(五两,泔浸一周时,去白,取三两)…”[14]。结合米泔发酵特性对陈皮进行漂制,通过米泔漂陈皮,提高陈皮米泔的品质、口感、风味,同时降低陈皮的燥性。
目前缺乏对陈皮米泔漂制前后成分变化研究。因此本研究采用顶空固相微萃取结合气相色谱-质谱联用(headspace solid-phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry, HS-SPME-GC-MS)及电子鼻和电子舌技术对陈皮米泔漂制前后挥发性成分、气味和滋味进行研究,并运用正交偏最小二乘判别分析(orthogonal partial least squares discriminant analysis, OPLS-DA)进行分析,以期为米泔水制陈皮的鉴别及质量评价提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料
糯米(江西圣牛米业有限公司)、陈皮分别采自各种植基地(表1),经江西中医药大学吴志瑰副教授鉴定为芸香科植物橘Citrus reticulata Blanco及其栽培变种的干燥成熟果皮。
表1 陈皮样品信息
Table 1 Citri Reticulatae Pericarpium sample information
样品批号产地样品批号产地样品批号产地YX01202411江西樟树YH07202311江西樟树YJ13202411江西吉安YD02202411江西樟树YH08202411江西樟树YG14202111广东江门YD03202411江西樟树YH09202310江西樟树YG15201711广东江门YT04202411江西樟树YZ10202411浙江衢州YG16202411广东江门YT05202411江西樟树YF11202401江西抚州YS17202411四川重庆YH06202411江西樟树YJ12202411江西吉安
1.2 仪器与设备
697A顶空进样器、7890A气相色谱-5975C型质谱联用仪、Mass-hunter质谱工作站积分器,美国Agilent公司;SuperNose电子鼻,美国Isenso公司;KQ-500DE数控超声波清洗器,江苏昆山市超声仪器有限公司;TS-5000Z电子舌,日本Insent公司;纯水机J-SL20I净水系统,四川纯洁科技有限公司。
1.3 HS-SPME-GC-MS分析
1.3.1 米泔水漂陈皮的制备
米泔水的制备:将糯米打碎成米粉(过五号筛)每2 kg糯米粉兑清水100 kg,充分搅拌形成混悬液即得米泔水溶液。
米泔水漂陈皮:取陈皮生品适量,加入3倍用量的米泔水于30 ℃条件下浸漂18 h,取出陈皮,用清水漂洗陈皮表面2 h,捞出,并放入烘箱40 ℃条件下烘干,即得米泔制陈皮。
1.3.2 HS-SPME萃取条件
精密称取陈皮粉末(过四号筛)各0.2 g,于20 mL钳口顶空瓶中,丁基橡胶隔垫密封,平行3份,备用。进样条件:样品瓶加热温度120 ℃;平衡时间10 min;量环温度130 ℃;传输温度140 ℃;压力平衡时间0.5 min;进样时间0.5 min。
1.3.3 GC-MS条件
色谱柱为HP-5MS弹性石英毛细管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm);程序升温(初始温度45 ℃,4 ℃/min升至85 ℃;以1 ℃/min升至90 ℃;以5 ℃/min升至160 ℃,保持1 min;以30 ℃/min升至200 ℃,保持1 min);进样温度为220 ℃;载气为高纯度氦气(纯度>99.999%);柱前压为7.8 psi,流速1.0 mL/min;分流进样,分流比为20∶1。
质谱条件:电子轰击(electron ionization, EI)离子源;溶剂延迟3.6 min;离子源温度230 ℃;四级杆温度150 ℃;扫描范围m/z 40～450,总运行时间34 min。
1.4 数据处理
实验所得GC-MS检测结果的鉴定采用NIST20标准质谱图库检索(相似度≥85%)。通过峰面积的归一化,利用SIMCA14.1软件做OPLS-DA分析筛选变量重要性投影(variable importance projection, VIP)值>1,P<0.05的潜在差异成分。同时采用Origin 2021软件绘制Pearson相关性热图、雷达图、指纹图谱并对图表进行结果分析。
1.5 电子鼻分析
分别精确称取样品粉末(过三号筛)0.5 g,置于40 mL电子鼻样品瓶中,静置,使顶空瓶中充盈样品气体,在室温下用电子鼻检测。清洗时间为180 s,进气速度为0.6 L/min,检测时间为120 s,进样量为10 mL,平行测定3次。14个传感器性能描述见电子版增强出版附表1(https://doi.org/10.13995/j.cnki.11-1802/ts.044273,下同)。
1.6 电子舌分析
称取陈皮供试品粉末1.0 g,置于100 mL锥形瓶中,加入100 mL纯净水,超声提取30 min后,于转速3 500 r/min离心10 min,取上清液于电子舌专用样品杯中上机测试。将原始数据在电子舌自带数据处理软件中转化为味觉值后进行分析(附表2)。
2 结果与分析
2.1 HS-SPME-GC-MS对陈皮及米泔水漂陈皮成分分析
2.1.1 总体差异分析
将陈皮样品进行HS-SPME-GC-MS分析,VIP值>1,P<0.05的潜在差异成分(附表3);利用Origin 2021软件绘制指纹图谱(图1-a)。结果共检测出135种挥发性成分,其中陈皮132种,陈皮米泔131种。陈皮特有成分有4种,藏红花醛为香气成分,具有抗氧化、神经保护作用[15],2,3-二氢-3,5-二羟基-6-甲基-4H-吡喃-4-酮多具有烘烤香或甜香,常见于茶叶加工过程(如杀青、发酵),影响风味[16]、柠檬烯二醇、dehydrolinalool在茶叶加工中由芳樟醇氧化形成,与花香、果香呈普遍相关,提升茶叶香气复杂度[17]、4-甲基-2-(2-甲基丙-1-烯基)-3,6-二氢-2H-吡喃具有木香、辛香。米泔水漂陈皮特有成分有3种,苯乙醇是重要的花香成分、异丁酸橙花酯是苯乙醇的衍生物,具有抗肿瘤的活性[18-19],其中十二甲基环六硅氧烷常被应用于化妆品作为润滑剂;陈皮、米泔水漂陈皮在挥发性成分种类上无明显差异,挥发性成分的含量上存在一定差别。
a-指纹图谱;b-OPLS-DA图;c-置换检验图;d-VIP图
图1 陈皮、米泔水漂陈皮的指纹图谱、OPLS-DA图、置换检验图和VIP图
Fig.1 Fingerprint chromatograms, OPLS-DA scores, permutation test plot, and VIP plot of CRP and MGCRP
2.1.2 OPLS-DA
以135种成分为因变量,2种不同制法作为自变量,通过OPLS-DA,可以实现陈皮和米泔水漂陈皮样品有效区分。本次分析中的自变量拟合指数
为0.686,因变量拟合指数
为0.953,模型预测指数(Q2)为0.841,R2和Q2超过0.5表示模型拟合结果可接受(图1-b)。通过对陈皮、米泔水漂陈皮样品的挥发性成分进行OPLS-DA模型200次交叉置换检验,发现Q2=-0.729(负值表明该模型稳定有效,图1-c),说明模型不存在过拟合,模型验证有效,具有显著的统计学意义。样品均分布在95%置信区间内,陈皮、米泔水漂陈皮有明显的区分,说明陈皮经米泔水漂制后,其挥发性成分发生明显的变化认为该结果可用于陈皮和米泔水漂陈皮鉴别分析。
2.1.3 差异性成分筛选
采用OPLS-DA模型对陈皮米泔漂制前后挥发性成分进行分析,以VIP值>1且P<0.05为标准,筛选陈皮米泔漂制前后差异性成分,以区分陈皮、米泔水漂陈皮(图1-d)。结果显示有9种挥发性成分,β-榄香烯、β-石竹烯、月桂醛、(Z)-β-金合欢烯等烯烃、醛类差异性成分含量升高;8种成分,α-松油醇、香芹酚、4-亚甲基异佛尔酮等醇、酚、酮类差异性成分漂制后降低(附表4)。柠檬烯在微生物的作用下可转换为α-松油醇[20];烯烃、醛类在高温下容易发生氧化或降解反应,例如醛类化合物在高温下转化成醇或酸[21];或因样品经高压、发酵(米泔漂)诱导美拉德反应或脂肪酸氧化生成醇、酮类[22-23]。
2.2 电子鼻技术对陈皮及米泔水漂陈皮气味分析
如图2所示,2种陈皮在OPLS-DA得分散点图的横轴上实现了区分(图2-a)
模型200次交叉置换检验,发现Q2=-0.755(负值表明该模型稳定有效,图2-c),陈皮均匀分布在横轴的负半轴,米泔水漂陈皮均匀分布在横轴的正半轴。以陈皮、米泔水漂陈皮样品的平均响应值进行分析,绘制气味信息雷达图(图2-d)。14根传感器对样品气味响应不同,其中陈皮漂制后芳香族、萜类、挥发性有机化合物等含量降低,内酯类含量升高。差异主要体现在传感器S1、S2、S9、S10、S11、S12、S13(VIP值>1,图2-b),推测硫化物类、芳香族化合物类、呋喃类、挥发性有机化合物等成分可能是导致样品气味差异的物质基础。米泔水漂陈皮前后气味雷达图有明显的区别,主要体现在传感器S2、S9、S10、S12、S13(P<0.05)、S11(P<0.01),表明米泔水漂陈皮重复性良好,说明陈皮和米泔水漂陈皮气味存在一定区别。
a-OPLS-DA;b-VIP图;c-置换检验图;d-雷达图
图2 陈皮、米泔水漂陈皮电子鼻OPLS-DA图、VIP图、置换检验图和雷达图
Fig.2 Electronic nose OPLS-DA scores, VIP plot, permutation test plot, and radar chart of CRP and MGCRP
a-OPLS-DA图;b-VIP图;c-置换检验图;d-雷达图
图3 陈皮、米泔水漂陈皮电子舌OPLS-DA图、VIP图、置换检验图和雷达图
Fig.3 Electronic tongue OPLS-DA scores, VIP plot, permutation test plot, and radar chart of CRP and MGCRP
注:sourness:酸;bitterness:苦;astringency:涩;aftertaste-B:回味-B;aftertaste-A:回味-A;umami:鲜;richness:丰富;saltiness:咸;sweetness:甜(下同)。
2.3 电子舌分析
采用SIMCA14.1软件将陈皮、米泔水漂陈皮滋味的响应值进行OPLS-DA建模(图3-a),陈皮和米泔水漂陈皮被判在2个不同区域
均大于0.5),OPLS-DA模型200次交叉置换检验,Q2=-0.249(图3-c)说明模型拟合度、预测性良好。在陈皮、米泔水漂陈皮OPLS-DA模型中,以VIP值>1,P<0.05为筛选标准,共筛选出4个差异性滋味(图3-b),由雷达图可知(图3-d),米泔水漂陈皮sweetness(甜)和astringency(涩味)、bitterness(苦)较陈皮味强,saltiness(咸)较陈皮味弱。研究表明米泔浸泡使苦参苦味增强与本实验结果一致[24],因漂制环节复杂,导致米泔水漂陈皮苦味增强的原因尚未明确。
2.4 陈皮及米泔水漂陈皮“成分-气味-滋味”Pearson相关系数分析
通过电子鼻的结果发现S2、S9、S10、S11、S12、S13 是响应较强的传感器(VIP值>1,P<0.05)。电子舌的结果sweetness和saltiness、astringency、bitterness为差异性滋味。为了更好地了解电子鼻传感器、电子舌传感器与差异性挥发成分之间的关系,以差异性挥发成分(共17个)、电子鼻(共6个)与电子舌(共4个)进行Pearson相关分析。图中红色越深、图形越扁,表明正相关越强,蓝色越深表示负相关越强(图4)。
图4 陈皮及米泔水漂陈皮“成分-气味-滋味”Pearson相关系数分析
Fig.4 “Component-smell-taste” Pearson correlation analysis of CRP and MGCRP
注:图中CAS号代表附表3中对应化合物;*P≤0.05。
sweetness、astringency、bitterness与β-榄香烯、β-石竹烯、(E)-β-金合欢烯、4,7-dimethyl-1-propan-2-yl-1,2,3,5,6,8a-hexahydronaphthalene、十三醛、壬醛、月桂醛呈正相关,而saltiness则相反;saltiness与4-亚甲基异佛尔酮、2,3-二氢-3,5-二羟基-6-甲基-4H-吡喃-4-酮、樟醛、4-乙烯基-2-甲氧基苯酚呈正相关;S9、S10与4-亚甲基异佛尔、S10与saltiness呈正相关,S2、S9、S10、S11、S12与十三醛呈负相关;S10与壬醛、bitterness呈负相关。
由图4可知成分与滋味具有相关性,其中β-石竹烯属于丁香油脂、甜木质香料味;(E)-β-金合欢烯、β-榄香烯为甜味[25];壬醛可能因氧化特性或分子构型易关联苦味及涩味[26],十三醛、壬醛、月桂醛高浓度时会产生苦涩味[27-28]。4-乙烯基-2-甲氧基苯酚可抑制甜味感知[29];4-亚甲基异佛尔酮与氢气类(S9)、呋喃类(S10)相关,该结果与XU等[30]类似;壬醛和呋喃类均主要来源于脂质氧化,大米贮藏期间,壬醛和呋喃类物质含量均随贮藏时间延长而上升[31],在酵母提取物的美拉德反应模型中,呋喃类化合物能显著增强咸味[32]。
3 结论
本研究以陈皮、陈皮米泔为研究对象,通过米泔水漂制前后挥发性成分、气味、滋味进行分析,揭示了米泔水漂制对陈皮品质的影响。通过主成分分析方法(principal component analysis, PCA)及OPLS-DA能有效区分陈皮、米泔漂陈皮样品,造成陈皮样品显著差异性潜在标志挥发性成分有17种,乙酸橙花酯、β-石竹烯、(E)-β-金合欢烯等9种挥发性成分含量显著升高,α-松油醇、香芹酚等8种挥发性成分含量显著降低。
通过电子鼻智能感官技术,陈皮漂制后芳香族、萜类、挥发性有机化合物等气味减弱;β-榄香烯、β-石竹烯、(E)-β-金合欢烯、(Z)-β-金合欢烯为倍半萜烯类,月桂醛、壬醛、十三醛既是醛类化合物、同时也是挥发性有机化合物;乙酸橙花酯既属于萜类,又属于挥发性有机化合物,以上成分漂制后含量略升高,通过计算相应成分,烯烃类成分总量仍然为降低;2,3-二氢-3,5-二羟基-6-甲基-4H-吡喃-4-酮(吡喃酮类,在热加工或酸催化下可转化为呋喃类)、3-糠醛(呋喃类,为酮类成分的中间产物)、4-亚甲基异佛尔酮(烯烃酮类),4-乙烯基-2-甲氧基苯酚(蜜橘皮茶汤的主要挥发性成分之一)[33]、香芹酚、樟醛、(+)-α-松油醇(在一定条件下D-柠檬烯转化为α-松油醇,且(+)-α-松油醇与α-蒎烯可发生相互转换)等含量降低,以上结果与电子鼻结果具一定的相似性。其中硫化物类、芳香族化合物类、呋喃类、挥发性有机化合物类等相关成分可能是导致陈皮漂制前后气味差异的物质基础;电子鼻提供的是概率性识别,无法直接关联到分子机制,电子鼻可检测GC-MS可能遗漏或热不稳定的成分(如某些硫类化合物),但无法准确定量,因电子鼻和GC-MS的识别具有一定的差异性[34]。米泔水漂制后sweetness、astringency、bitterness增强,saltiness减弱,其中甜味为最显著性滋味,与β-石竹烯、(E)-β-金合欢烯、β-榄香烯相关。
综上,陈皮米泔漂制前后挥发性成分、气味、滋味均发生明显变化,可用于米泔制陈皮品质鉴别。该结果可能与陈皮米泔漂制过程中的发酵有关,后续将对陈皮米泔漂制过程中优势菌株的筛选及陈皮米泔漂制前后微生物作用机制进行深入研究,为其天然食品及药品的开发与应用奠定理论基础并提供科学依据。
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