微生物合成谷氨酸及其衍生物的研究进展

谷氨酸(化学名:α-氨基戊二酸,分子式:C5H9NO4)是一种酸性氨基酸,形态为白色或无色鳞片状晶体,微酸性,无臭但具特殊酸味,熔点160 ℃,224～225 ℃分解,密度1.538 g/cm3。微溶于水,几乎不溶于乙醇、乙醚、丙酮等有机溶剂。含2个羧基(—COOH),为两性电解质,在中性pH下以两性离子形式存在,缓冲范围为pH 2.0～4.5及pH 9.5～11.0。谷氨酸作为自然界最丰富的氨基酸之一,不仅是构成生命体蛋白质的基本单元,更是代谢网络的核心节点物质[1]。但是谷氨酸属于低值大宗氨基酸,其产量大,附加值低,节能减排压力大。通过对谷氨酸高附加值衍生产品的开发和谷氨酸合成途径的改造来延伸谷氨酸的产业链[如谷胱甘肽(glutathione,GSH),L-茶氨酸,γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid,GABA),谷氨酰胺(glutamine, L-GLN)和γ-聚谷氨酸(polyglutamic acid,PGA)],这是提高中国谷氨酸产业国际竞争力的有效手段(图1)。目前,谷氨酸及衍生物市场呈现双轨增长:传统谷氨酸在受食品、医药刚性需求支撑下稳步扩张,衍生物凭借附加属性在农业、化妆品、水处理等其他领域高速增长。因此,本文将主要综述国内外生物合成谷氨酸及其衍生物的重要研究进展,旨在为相关领域的科研与产业化提供参考。

1 生物合成谷氨酸

1.1 谷氨酸的代谢途径

自1866年德国化学家Rittershausen从小麦面筋中首次发现谷氨酸以来,这一氨基酸及其衍生物已在食品、医药、化工和材料领域展现出巨大价值。不同于高能耗、高污染的以丙烯腈为原料,经高压(20 MPa)、高温(120 ℃)反应生成DL-谷氨酸,再拆分得L-谷氨酸的化学法,生物合成法凭借环境友好、成本可控和产物纯度高等优势,逐步取代化学合成法,成为了谷氨酸及其衍生物的主要生产方法。谷氨酸的生物合成是由微生物代谢途径完成,主要包括糖酵解(embden-meyerhof-parnas pathway, EMP)、三羧酸循环(tricarboxylic acid cycle,TCA)和谷氨酸特有的合成途径。首先葡萄糖经过EMP途径被分解成丙酮酸,丙酮酸再进入TCA循环被转变为乙酰辅酶A,进而形成α酮戊二酸;接下来谷氨酸脱氢酶(glutamate dehydrogenase, GDH)催化下α酮戊二酸与氨缩合得到谷氨酸[2](图2)。另外,转氨作用可以将谷氨酸与酮酸发生氨基转换生成其它氨基酸;同样地,谷氨酸也可以通过反应生成工业上应用广泛的各种衍生产品。谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)成为工业化生产谷氨酸及其衍生物的明星底盘细胞,不仅因为发酵过程中会有一定量的谷氨酸产出,更因为其为公认安全(generally recognized as safe,GRAS)认证的安全菌株。经过三十多年的发展,中国谷氨酸产业已达到产能世界第一的位置,产量占世界总量的70%以上。

1.2 发酵法合成谷氨酸

化学合成谷氨酸存在高污染和需要手性拆分等缺点;酶催化也有底物昂贵等缺陷,发酵法合成谷氨酸是目前较为理想的策略。但是目前发酵法生产L-谷氨酸存在以下问题:国内的发酵原料以玉米淀粉糖为主,相比于国外的甘蔗糖浆成本偏高;菌种产酸水平低、转化率低;发酵控制精度差,污染排放量大;由于菌种依赖传统诱变育种,所以遗传背景复杂,改造难度大;培养基成分复杂,导致发酵不稳定、提取困难。

我国L-谷氨酸产业正处于关键转型期,面临发展瓶颈与国际竞争的双重压力,企业提升菌种及核心技术的需求迫切。在此背景下,加速推进L-谷氨酸等传统氨基酸的高效绿色生产技术(尤其是集成创新)的研发与应用,是突破产业困境、响应国家重大战略需求的必然路径。

1.2.1 通道蛋白的改造和温度因子的发掘

通道蛋白的改造和温度因子的发掘是研究发酵法合成谷氨酸的重点。谷氨酸棒杆菌最初需在生物素或青霉素等条件下(通过改变细胞表面结构、提高膜通透性)才能高效生产L-谷氨酸,但是生物素等的添加会削弱菌体活力,限制性能发挥。近年来,温度敏感型菌株及工艺得到应用。其关键基因突变使高温下细胞壁合成受限、膜刚性降低,抑制细菌生长,促进L-谷氨酸分泌,突破了传统工艺限制。同时,发酵后期升温不仅最大化释放菌株性能,还利于节能减排。因此,温度敏感型技术革新了L-谷氨酸生产,推动了清洁工艺研究。

2019年陈宁等阐明了谷氨酸棒杆菌中murA和murB缺失与温度敏感性谷氨酸分泌之间的机制。通过肽聚糖分析显示,murA和murB的缺失抑制了肽聚糖合成。通过比较代谢组学分析表明,细胞壁结构的变化导致整体细胞代谢降低,但谷氨酸合成的碳流量增加[3]。2020年陈宁等将随机突变筛选的一株可以在39 ℃高产L-谷氨酸的谷氨酸棒杆菌进行全基因组测序,然后与谷氨酸棒杆菌13032模式菌株基因组进行比较,筛选了与细胞膜合成相关的突变基因。对带有突变基因的改造菌株的发酵结果进行研究,发现参与细胞膜合成的基因突变可引起温度敏感,促进L-谷氨酸生成,且不影响谷氨酸梭菌的细胞形态[4]。

2025年左兴涛等[5]发现CmpLs转运系统的改造可以促进L-谷氨酸外排,进而强化L-谷氨酸合成和转运的代谢通量。通过对敲除菌株发酵液胞内和胞外的代谢物组分析,发现CmpL1敲除菌株胞内TCA中间代谢物α-酮戊二酸和L-谷氨酸下游代谢物L-脯氨酸的积累量明显减少,而敲除CmpL4则使这两种代谢物的积累量增加。敲除菌株中,表现优异的CmpL1敲除菌株温敏发酵后L-谷氨酸产量提高69.2%,糖酸转化率提高了55.3%。回补CmpL4可恢复关键脂质平衡,回补CmpL1则增加外膜磷脂酰肌醇甘露糖苷含量。CmpL1与CmpL4功能的互补性为工业菌株改造提供了理想靶点。由此可知转运系统也是提高工业菌株产率和稳定性的关键靶点。

1.2.2 常压室温等离子体(atmospheric and room temperature plasma, ARTP)筛选

ARTP诱变系统可在常压、25～40 ℃下产生高活性粒子浓度的等离子体射流,通过造成微生物细胞DNA多样性损伤实现高效诱变。该系统具有操作简便、设备简单、条件温和、安全性高、诱变快速、突变多样性大等显著优势,已广泛应用于氨基酸菌株选育。2023年梁玲等[6]通过优化原生质体制备和ARTP处理条件,并结合高效筛选策略,获得了L-谷氨酸产量和糖酸转化率显著提高且遗传稳定的优良突变株YAG117。其在50 L发酵罐中展现出216.6 g/L的高产酸水平和68.87%的高转化率。

1.2.3 代谢工程改造筛选

在谷氨酸棒杆菌中,L-谷氨酸主要由谷氨酸脱氢酶(NADPH为辅酶)催化α-酮戊二酸与铵离子合成。其代谢调控涉及糖酵解、TCA循环及下游途径代谢流分配。在生物素亚适量等诱导条件下,α-酮戊二酸脱氢酶(oxoglutarate dehydrogenase complex,OGDC)活性显著下降,促使代谢流向L-谷氨酸合成,使其成为代谢工程改造的关键靶点。L-谷氨酸大量合成会降低TCA循环通量,四碳的回补途径对维持高效合成也很重要。谷氨酸作为很多必需氨基酸的前体,影响着菌株的生长与下游产物合成的平衡。

2025年刘佳峰等[7]以高产L-谷氨酸的谷氨酸棒杆菌G01为出发菌株,通过理性代谢工程和蛋白工程相互结合策略提升L-谷氨酸产量和糖酸转化率。首先通过敲除丙氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase,alaT)编码基因alaT,减少副产物积累,其次通过RBS序列优化(核糖体结合位点)降低α-酮戊二酸脱氢酶活性,弱化竞争途径,使碳代谢流向谷氨酸合成,再者过表达磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(phosphoenolpyruvate carboxykinase,ppc)编码基因ppc,磷酸果糖激酶(phosphofructokinase,pfk)编码基因pfk和丙酮酸激酶(pyruvate kinase,pyk)编码基因pyk,和筛选高效谷氨酸脱氢酶(glutamate dehydrogenase,gdh)的gdh,增强前体供应,强化谷氨酸合成代谢流,最后利用Alphafold2预测MscCG蛋白结构找到关键突变位点,提升谷氨酸外排能力。改造菌株在5 L 发酵罐积累了136 g/L L-谷氨酸,糖酸转化率为55.8%,展现了工业化潜力,为高产L-谷氨酸菌株的构建提供了新思路。

1.2.4 发酵优化筛选

培养液的成分和补料的时机影响着最终的产率。2021年刘景阳等[8]为了解决谷氨酸发酵后期菌体活力不足、产酸能力下降的问题,在发酵过程中补充含碳源、氮源、无机盐和维生素的复合培养基(非单一成分流加),以平衡营养消耗。全营养流加策略维持营养供给并避免底物抑制。在优化的条件下进行发酵,生物量得到了提升,菌体转型时间提前了2 h,L-谷氨酸产量为168.0 g/L,提高了22.6%,乳酸含量为3.1 g/L,降低了13.8%,丙氨酸含量为2.1 g/L,降低了17.6%,糖酸转化率为63%。综上所述,全营养流加发酵法对于加快菌体转型,提高菌体活力、谷氨酸产量及糖酸转化率均有积极作用,发酵工艺的优化也是谷氨酸高产机制的关键靶点。

近年来,L-谷氨酸生物合成进入“多尺度协同优化”的时代,定向改造CmpLs提升通量;兼顾高效节能的温敏发酵和好氧发酵;实现废液资源化利用以及将AI模型应用于L-谷氨酸生产领域推进实现循环经济、智能制造。继续攻关解决“高产-高耗能”矛盾,绿色制造L-谷氨酸,推动L-谷氨酸绿色新进程,引领高附加值衍生物的开发研究。

2 生物合成GSH

2.1 GSH的作用

GSH是由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸以γ-谷氨酰键连接而成的三肽,主要作用为:a)氧化还原枢纽:作为细胞内除蛋白质以外含量最高的非蛋白硫醇(1～10 mmol/L),参与维持细胞内氧化还原平衡,清除体内活性氧(reactive oxygen species, ROS);b)解毒:GSH-S-转移酶(glutathione S-transferase,GST)能将GSH与毒物共价结合成低毒物如卤代苯乙酮(glutathione-conjugated halogenated acetophenone, GS-HAP),并促进毒物(重金属铅、镉等)从细胞中排出体外。另外,研究表明,在GST催化下GSH能够和粮食污染物脱氧雪腐镰刀菌烯醇(deoxynivalenol, DON)结合生成低毒产物DON-10-GSH[10],将2 mg/mL GST与DON混合,于pH值6.5、4 ℃下反应,在此条件下GST与DON的结合率为86%,大大减少了细胞的毒性。这是一种粮食污染物解毒的有效新方法,在临床应用中,被广泛应用于肝病治疗,肿瘤辅助治疗和神经保护[11]。GSH是赋予食品更长时间保质期的有效成分,日本Gabaron茶每克含2.90 mg GSH(约为常规茶70倍),有显著降压效果[12]。

2023年全球GSH产量为1 500～1 600 t,中国占全球产量的比例为56.11%,日本占比为37.28%,主要生产商包括:金城生物(中国)、Kyowa Hakko Bio(日本)、KOHJINLife Sciences(日本)。23年GSH基准价约为800元/kg,2024年3月因日本协和发酵禁止进口,市场出现短缺的情况,其价格大幅上升至1 200元/kg(增长了50%),还有可能会达到最高值2 000元/kg[13]。驱动因素主要是:抗衰老产品、肝病产品以及功能性食品的需求;传统的化学合成路线是以L-谷氨酸作为原料,经酯化、酰化后引入半胱氨酸和甘氨酸得到产物DL-消旋体,再经手性拆分得到目的产物,该方法的产率小于50%。

2.2 酶法合成GSH

生物合成GSH主要是微生物发酵生产和酶法合成。GSH的生物合成受γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-glutamyl systeine synthetase,GSH1)的活性、细胞内GSH浓度及硫氨基酸代谢的调控。硫同化途径(硫酸盐转化为半胱氨酸)是关键限速步骤。不同于发酵法的低得率,2024年刘秋林等[14]通过AlphaFold2对嗜热链球菌来源的GSH双功能合成酶(glutathione bifunctional synthetase,GshF)进行半理性设计,通过组合突变筛选获得突变体GshFL136K/V498C,比酶活性较野生型提高了86.8%。经过条件优化后,催化3 h,GSH浓度可以达到7.42 g/L,底物L-半胱氨酸的转化率约为96.68%。该突变体催化效率的提高为规模化生产奠定基础。2024年宋世萍等[15]开发了基于GshF的酶法合成体系,结合多聚磷酸盐激酶(polyphosphate kinase,PPK)构建ATP循环系统,利用六偏磷酸盐再生ATP,减少外源ATP添加,降低生产成本,最终GSH产量达17.36 g/L,产率94.22%。江南大学研究发现采用无细胞催化生产GSH,优化无细胞催化体系的缓冲液、裂解液菌体量、补料时间后,无细胞体系可产生(13.89±0.55)g/L的GSH,底物L-半胱氨酸的转化率达到90.4%[16]。

2.3 发酵合成GSH

微生物发酵因其利用廉价碳源,过程绿色环保以及成本低廉等优势成为研究热点。酿酒酵母和谷氨酸棒杆菌株因其具有安全认证、培养成本低和GSH积累能力强成为主要生产菌株。同时,因大肠杆菌的遗传背景清晰,且拥有成熟的遗传操作体系,也被应用于研究生产GSH。

2009年研究报道以产朊假丝酵母为材料,在细胞高密度培养的基础上研究半胱氨酸添加、溶氧控制及低pH胁迫对GSH合成的影响。当细胞高密度培养45 h时,一次性添加50 mmol/L半胱氨酸,在培养60 h时GSH产量达到1.53 g/L;半胱氨酸添加后的最初3 h内将溶氧控制为5%左右,而后12 h将溶氧提高到20%,则可减少13%半胱氨酸添加量,但GSH产量提高了13%。30 mmol/L半胱氨酸分两次加入,与pH胁迫和溶氧控制组合使用,发酵结束时(78 h),GSH终产量可达到1.94 g/L[17]。2024年华天药业提出在酵母菌株发酵中期添加1～30 mmol/L 3-磷酸甘油酸以及1～10 mg/L辅酶Q10来促进丝氨酸合成(半胱氨酸前体),并且减少氧化应激,从而增加GSH产量,且不会像传统的半胱氨酸底物一样出现不稳定的现象[18]。

2.3.2 谷氨酸棒杆菌

作为GRAS安全认证菌株,谷氨酸棒杆菌株同样也被应用于研究生产GSH的可行性。2025年GAO等[19]研究了GSH在谷氨酸棒杆菌中作为抗氧化剂的代谢机制,并通过代谢工程和发酵优化策略,构建了高效的GSH生产菌株。通过计算机辅助设计平台Pross对GshF进行改造,获得了具有更高催化活性和稳定性的突变体GshFE11P-H366Y-A398E,显著提高了GSH的合成效率。研究发现aecD介导的L-半胱氨酸产生的高水平硫化氢影响细胞生长和细胞氧化稳态,减少抗氧化剂GSH的产生;同时,GSH降解基因ggt与氧化型GSH相互作用,影响抗氧化水平的波动,进一步提高了胞内ROS水平。结合aecD和ggt敲除,并引入GSH还原酶增强细胞还原能力,促进氧化型GSH还原,可显著增加GSH的产生,有效降低发酵中的ROS水平,维持氧化还原稳态。在维持细胞氧化还原稳态的基础上,利用5 L生物反应器中发酵生产GSH,结果显示,高溶氧促进氧化型GSH的产生和ROS的积累。结合ATP再生和运输系统,优化底物投料时间、pH、温度和溶解氧条件后,最终发酵法生产还原型GSH产量可达(25.07±0.41) g/L,葡萄糖得率为163.86 mg/g,产率为417.83 mg/(L·h)。该研究展示了谷氨酸棒杆菌在工业生产GSH中的潜力,还为解决细胞发酵过程中的氧化应激问题提供了有效的策略(表2)。

不论是酵母还是谷氨酸棒杆菌株发酵合成GSH,都需要添加半胱氨酸,这就导致发酵成本大大增加。2024年日本研究人员开发了无需添加半胱氨酸的大肠杆菌发酵工艺,实现GSH高效胞外生产。首先过表达GSH合成酶基因gshA和耐热型gshB,实现大肠杆菌中无半胱氨酸添加的GSH生产,且超过90%产物分泌至胞外。随后通过基因改造逐步优化:敲除γ-谷氨酰转肽酶编码基因ggt抑制降解,敲除谷胱甘肽还原酶编码基因gor阻断还原,途径敲除ABC转运蛋白基因yliABCD减少胞内重吸收,插入强启动子过表达cysE(丝氨酸乙酰转移酶,serine acetyltransferase)增强半胱氨酸合成[20]。甘氨酸的补料速度对GSH合成至关重要,以硫代硫酸钠(Na2S2O2)替代硫酸钠,减少NADPH消耗,可以缓解半胱氨酸合成瓶颈。研究人员发现中间产物O-乙酰丝氨酸(O-acetylserine, OAS)和其异构体N-乙酰丝氨酸(N-acetyl-L-serine, NAS)大量积累,证实OAS转化为半胱氨酸为限速步骤。该方法利用廉价葡萄糖和无机盐培养基,避免昂贵半胱氨酸添加;胞外分泌特性简化纯化流程,适用于大规模生产;有望取代当前酵母发酵工艺,推动GSH产业化升级。

GSH合成技术已从传统萃取法演进至合成生物学驱动的智能制造时代。酶催化法凭借高纯度(大于99%)与短周期(24 h)成为产业化主流。全球GSH产业正经历“技术升级→产能替代→应用拓展”的链条式跃迁,中国企业凭借合成生物学创新逐步掌握定价权,正推动GSH产业向绿色化、高值化、精准化跃迁,但需持续突破高纯度医药级产品的国际认证壁垒。

3 生物合成L-茶氨酸

3.1 L-茶氨酸的作用

L-茶氨酸(N-乙基-γ-谷氨酰胺)是茶叶的特征氨基酸,占茶叶游离氨基酸总量的50%以上,被广泛认为对“精神健康”有益,具有多重生理功能:增强脑波(强度提升40%),缓解焦虑并改善认知功能;通过调节菌群-短链脂肪酸-GPR43/PI3K/AKT通路修复肠道屏障,缓解溃疡性结肠炎;增强化疗药物靶向性,降低毒副作用[22]。L-茶氨酸最显著的功能之一是促进放松,而不引起嗜睡[23]。除了具有镇静作用外,L-茶氨酸还有助于提高注意力和集中力,尤其是在与咖啡因搭配使用时[24]。一项小型研究发现,L-茶氨酸和咖啡因的组合可以帮助年轻人更好地应对高要求的任务。早在1964年,日本就通过了对茶氨酸的认证,美国的食品和药物管理局也在1985年对其进行了认证,认为它是GRAS,并且对使用量没有限制。2014年,我国也批准茶氨酸为新食品原料。由于茶叶中茶氨酸含量仅1%～2%,直接提取成本高昂,开发高效合成技术对医药与功能食品应用至关重要[25]。

化学合成法是指通过化学反应将几种不同的物质整合直接得到茶氨酸的一种技术,其反应操作过程相较于直接提取法而言更为简单便捷,且成本更低。以L-谷氨酸为前体,通过酯化、酰化或酸酐化引入乙胺基,生成L-茶氨酸,但是化学合成法的缺陷也是十分明显,天然的茶氨酸构型为L型,在化学合成时由于构型的不可控,往往会同时合成D型以及L型,分离两种构型的茶氨酸又会进一步增加成本,不利于工业化生产,且使用有毒试剂对后期制备食品添加剂有限制[26]。

3.2 酶法合成L-茶氨酸

国内外的研究表明共有5种微生物来源的酶可以催化茶氨酸的合成,包括γ-谷氨酰转肽酶(GGT)、L-谷氨酰胺酶、谷氨酰胺合成酶(glutamine synthetase,GS)、γ-谷氨酰甲胺合成酶(γ-glutamylmethideamine synthase,GMAS)以及GMAS。GGT和L-谷氨酰胺酶可以直接催化γ-谷氨酰基的转移反应,无需消耗ATP;GS,GMAS和L-谷氨酰胺酶能够以谷氨酸为底物合成茶氨酸,但需要消耗ATP。考虑到效率和成本,目前研究最多的便是GGT和GMAS。

GGT催化γ-谷氨酰基部分从γ-谷氨酰基化合物变成氨基酸。由于细菌的GGT具有十分广泛的底物特异性,因此GGT的转肽作用吸引了学者的目光。研究表明来自大肠杆菌K-12的GGT能将γ-谷氨酰转移到乙胺上,形成L-茶氨酸,转化率为60%[27]。在藻酸钙卡拉凝胶珠中固定化大肠杆菌来源的GGT,用于L-茶氨酸的生物合成,底物为25 mmol/L L-谷氨酰胺和40 mmol/L乙胺,反应12 h后,谷氨酰胺的转化率达到27%,热稳定性和可重复使用性显著提高[28]。

GMAS表现出更高的γ-谷氨酰基与乙胺连接活性。在乙胺催化方面,GMAS具有极高的活性,其对乙胺的催化速率远高于对氨的催化速率[29]。研究发现,在大肠杆菌中过表达PPK和GMAS酶可使全细胞催化合成L-茶氨酸,因而大大降低了底物的成本[30]。因此,在大肠杆菌中高表达GMAS酶可以为工业上生产L-茶氨酸提供大量的低成本原料。

3.3 发酵法合成L-茶氨酸

考虑到酶法合成L-茶氨酸,反应过程中需要添加许多ATP,酶的制备也提高了生产成本,并且由于日本、韩国、欧美等国家的研究成果逐渐丰富,包括茶氨酸合成酶基因的克隆、表达以及相关微生物发酵生产技术的改进等方面,推动直接发酵法成为当下合成L-茶氨酸的热门方法。天津科技大学陈宁教授团队研究发现,GMAS在谷氨酸棒杆菌GDK-9中过表达,同时在GDK-9细胞中的L-谷氨酸外排蛋白编码基因ncgl1221被删除,L-茶氨酸产量显著升高,培养基中的L-谷氨酸几乎消失,优化设计该菌株在5 L发酵罐中产生241.27 mmoL/L L-茶氨酸,达到19.6%的收益率[31]。2023年研究人员用蛋白质工程和代谢工程相结合的方法,通过筛选不同来源的GMAS和计算机辅助药物设计(computer aided drug design, CADD)提高GMAS的稳定性及催化活力,随后敲除ggt基因缓解了L-茶氨酸的降解,敲除参与L-丙氨酸合成的基因alaT和编码谷氨酸输出蛋白的基因旨在增加L-茶氨酸生成的碳通量,过表达ppk基因增强细胞内ATP的产生,获得一株高效生产L-茶氨酸的谷氨酸棒杆菌。最后将该菌株用于5 L发酵罐进行放大实验,L-茶氨酸产量为44.1 g/L,糖酸转化率为57.1%[32]。天津科技大学陈宁教授团队对野生型大肠杆菌进行基因编辑,引入外来基因,切断自身代谢途径,以提高L-茶氨酸的产量,在优化发酵条件后,重组菌株在5 L生物反应器中产生L-茶氨酸70.6 g/L[33](表3)。

经过几十年的发展,从最早诞生于20世纪40年代的化学消旋合成发展到如今依靠酶-微生物联合作用实现绿化的新型合成手段。未来研究需要围绕高效酶的设计及闭环分离工序展开,将“实验室克级”推进到“工厂吨级”,为大健康、功能性食品生产提质升级开辟道路。

4 生物合成GABA

4.1 GABA的作用

GABA是一个四碳非蛋白质氨基酸,具有活性氨基和羧基,水溶性大,不能透过血脑屏障,这些特点决定了其药用价值;而GABA是哺乳动物中枢神经系统中最主要的抑制性神经递质,参与了大约40 %的抑制性神经传导,并且可以通过结合GABA受体有效地降低神经元的兴奋性,使人体产生镇静、抗焦虑的作用。最近GABA被发现具有多种新的生理作用,包括调节RAS系统降低血压;激活肝脏尿素循环,促进氨解毒以改善肝功能;修复肠屏障[35]。本文综合和分析目前的GABA制造技术、市场动态和发展前景,深入研究了GABA的生产和功能方面的特性,还探讨了提高GABA产量的策略。

在肿瘤微环境(tumor microenvironments, TMEs)中,GABA双刃剑作用于乳腺癌转移,经Ca2+/NFAT1信号轴起正向作用,但是代谢重编程会促进胶质瘤中免疫细胞的功能。而且TAM分泌的GABA能促进单核细胞向M2型巨噬细胞分化以抑制T细胞的活性形成免疫抑制性小环境。这些新功能的发现极大拓展了GABA的应用前景,预计到2025年,GABA相关产品市场空间将超过30亿元,其中功能性食品占比最多,占比达64%左右,其次是神经类用药和抗肿瘤免疫调节药等其他用途产品[36]。

4.2 化学合成GABA

化学合成法是最早实现GABA大规模生产的工艺路线,主要为吡咯烷酮开环法。以2-吡咯烷酮为起始原料,在高温高压(120 ℃,20 MPa)和强碱的条件下开环形成GABA,产品为DL消旋体,需要经复杂的手性拆分过程获得有生物活性的L型GABA,收率偏低(小于50%);改进后的固体碱催化法收率稍有提高,但是仍然存在使用毒性极大的丙烯腈作为中间体,反应后产生大量废水导致污染严重、手性拆分方法复杂以及价格高,设备投资远大于生物法等问题;另外化学合成GABA存在较大安全隐患,已被美国FDA和中国卫生部明确禁止应用于食品、医药领域中,严重影响其产业化发展[37]。植物富集法提高了原料的营养价值并且环保。然而,其产量小且难以纯化。所以也不适用于大规模生产GABA。

4.3 GABA的代谢

GABA主要由谷氨酸经谷氨酸脱羧酶(glutamate decarboxylase,GAD)催化脱羧生成,需维生素B6衍生物磷酸吡哆醛(pyridoxal phosphate, PLP)作为辅因子。谷氨酰胺酶和GS也参与维持大脑谷氨酸/谷氨酰胺稳态,与GABA合成相关。将TCA循环中的α-酮戊二酸通过谷氨酸、GABA、琥珀酸半醛(Succinaldehydic acid, SSA)转化为琥珀酸,重新进入TCA循环。这是主要的GABA代谢途径,该途径广泛存在于原核和真核生物中。GABA也可通过多胺(腐胺、亚精胺)降解或在氧化胁迫下由脯氨酸非酶促反应生成。

4.4 酶法合成GABA

利用游离酶或者固定化细胞催化谷氨酸转化成GABA,该方法具有反应条件较为温和、转化率高、产物容易纯化等优点,为该合成过程的关键,该酶在酸性条件下能够催化谷氨酸发生不可逆脱羧作用。谷氨酸脱羧酶的高效表达和高酶活是全细胞催化生产GABA的关键。2023年肖杰文[38]针对植物乳植杆菌谷氨酸脱羧酶进行半理性改造,催化pH范围的改变,终高效转化生产γ-氨基丁酸,达到402.8 g/L。目前研究人员通过促进地衣芽胞杆菌二硫键的形成来提高含二硫键蛋白的谷氨酸脱脱羧酶表达活性的新策略,通过优化表达元件和强化半胱氨酸合成途径,挖掘并鉴定了地衣芽胞杆菌内源二硫键异构酶编码基因StoA和二硫键氧化还原酶编码基因BdbCD并进行强化表达,然后引入来源于大肠杆菌DH5α的二硫键氧化还原酶和毕赤酵母GS115的二硫键异构酶,在最佳催化条件下,GABA产量最高达到560 g/L,菌体重复使用3次后转化率仍然保持100%[39]。相较于传统发酵法,生物转化法具备显著优势:生产周期缩短50%以上;分离纯化成本降低60%～70%;原料利用率显著提高。经济分析显示,该技术使GABA综合生产成本降至2.2万元/t,按市场价格6万元/t计算,500 t级生产线年利润可达1 900万元,为国内过剩谷氨酸产能提供了高值化转化路径[40]。

4.5 发酵合成GABA

生物合成GABA分为两类:微生物直接发酵和生物酶法转化。微生物发酵法是利用天然菌株的代谢能力合成GABA,已成为当前主流生产技术。目前发酵法主要采用乳酸菌(如植物乳植杆菌、发酵粘液乳杆菌),大肠杆菌,谷氨酸棒杆菌为生产菌株。近年来,许多研究人员对GABA分子在植物、动物和微生物等各种生物体中的结构、功能和重要性进行了全面的研究。

2019年研究报道,应用微生物即乳酸菌在微生物发酵过程中自发产生GABA,这是食品产品将谷氨酸转化为GABA的过程[41]。2020年中国林业科学研究院林业研究所研究了应用盐处理调节食品环境中的渗透压。通过激活某些酶,特别是在发酵食品中或由微生物本身产生的酶,以促进GABA的产生[42]。2018年来自中国的团队研究表明,温度的突然波动可能引发细胞应激反应,进而导致GABA合成的自然增加[43]。

2020年天津大学的一项近期研究发现,乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)F44中gadB1和gadC1的表达产生了9.12 g/L的GABA,但在乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)NZ9000上共表达产生了更高的GABA,为25.61 g/L,生产强度为0.71 g/(L·h)[44-45]。

由于短乳杆菌在35 ℃和pH值为5时表现出最大繁殖力。研究人员提出的两步发酵工艺在合成GABA方面展示了卓越的功效。该方法利用微生物的复杂代谢控制,通过改变培养条件和营养可用性来优化GABA生产。在第一阶段的前32小时内,在35 ℃和pH值5.0下维持细胞生长的最佳条件。随后,将条件调整为40 ℃和pH 4.5,这些因素刺激GABA的合成。通过实施这种策略性的修改,GABA浓度在72 h内大幅增加至475 mmol/L[46]。发酵中的“时序调控”是实现产量突破的关键。

2024年中国的研究人员于分离获得的植物乳植杆菌LAG-1003(CGMCC No.30699)以复合碳源(葡萄糖∶丁二酸钠=2∶1)及复合氮源(牛肉膏∶土豆淀粉=2∶1)培养基,经过优化种子液OD600值为9～11时发酵以提高GABA产量,此菌株具有较强的耐环境能力,能适合工业化发酵。另外辽宁农科院采取响应面法优化培养基,提高GABA产率[47]。综上所述培养基中的优化,也是生物合成GABA的限制因素。

GABA作为连接神经科学、代谢工程和材料科学的关键生物分子,其合成技术已从传统的化学法、植物提取法演进至多学科交叉的智能生物制造时代。微生物合成法凭借高产率和绿色工艺成为主流,而生物转化法在产物纯度与生产效率方面展现出独特优势。但是菌株耐受性、路径调控复杂性、规模化生产成本仍然是目前瓶颈。技术创新正从3个维度重塑产业格局:在酶工程层面,酶定向进化与固定化技术突破传统催化限制;在代谢工程层面,葡萄糖从头合成途径开辟非依赖新路线,揭示生产菌株补料发酵过程GABA代谢调控机制,以提高GABA的产量和生产效率;在过程工程层面,探索使用非传统原料,如农业副产品和木质纤维素等物质,作为可再生资源进行GABA生产,以降低成本。

未来的突破在于AI驱动的酶智能设计与合成微生物群落的构建和无细胞合成系统的协同创新下,把GABA的生产方式推进到“低碳-智能-高值”范式的高度;未来肿瘤免疫调节、神经退行性疾病的治疗等新的应用场景也将开启千亿规模的市场,并由原来的“实验室克级探索”转变为“工厂吨级生产”,成为健康中国、绿色制造的重要驱动力之一。

5 生物合成PGA

5.1 PGA的作用

PGA分为α型(化学合成)、γ型(微生物合成),二者的性质都是生物可降解性、水溶性以及低毒性的特点,不过它们键合的方式不同,其中γ-PGA是以γ-酰胺键相连,多由芽孢杆菌属形成,分子质量为100～1 000 kDa,是纳豆黏丝、生物絮凝剂的主要成分;α-PGA是以α-酰胺键相连,由化学方法合成,具有规整的α-螺旋结构,利于药物载体的设计。γ-PGA的市场规模达15亿美金以上,应用到农业增效剂、药物载体、环保材料等诸多方面,并且其绿色合成的特性也是当前生物制造最热的技术之一(表4)。

在生物制造中,芽孢杆菌因其安全性最常用于生产γ-PGA。微生物产生γ-PGA的原因尚不完全清楚,但其被赋予的功能包括:防止抗体和噬菌体攻击细胞;防御抗菌肽和其他不利环境因素;以及在饥饿时期作为碳源和氮源。

5.2 发酵合成PGA

产生γ-PGA的芽孢杆菌菌株可分为2种类型:一种需要外部供应L-谷氨酸来制造γ-PGA,另一种可以在没有外部供应的谷氨酸的情况下产生该聚合物。L-谷氨酸依赖性菌株引起了广泛关注,因为它们通常是更好的菌株。这些细菌将外部供应的L-谷氨酸转化为L/D-谷氨酸以制造γ-PGA。如果提供更多的L-谷氨酸,聚合物的产量会提高,但这会显著增加生产成本。因此,L-谷氨酸非依赖性的γ-PGA菌株具有潜在的价值。

枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌是商业化生产γ-PGA的高效菌株。2011年研究人员采用谷氨酸依赖型菌株枯草芽孢杆菌ZJU-7通过补料分批发酵达到101.1 g/L的最高γ-PGA产量,生产强度2.19 g/(L·h)[48]。非谷氨酸依赖型菌株地衣芽孢杆菌TISTR1010的γ-PGA产量为39.9 g/L,生产强度为0.926 g/(L·h)[49-50]。

5.3 发酵过程控制

通过调整发酵的控制策略,如溶解氧和pH,高黏度发酵液需强化供氧(如机械搅拌、氧载体)。枯草芽孢杆菌IFO3335适宜pH值为7.0,两阶段调控(pH值先为7.0后降至6.5)可进一步优化[51]。枯草芽孢杆菌ZJU-7在10L发酵罐中,以酵母提取物(40 g/L)和谷氨酸(30 g/L)为初始培养基,通过葡萄糖补料分批工艺实现101.1 g/L γ-PGA,并成功放大至100 L规模[52]。

5.4 发酵培养基优化

研究发现发酵的培养基成分影响着γ-PGA的合成。如柠檬酸(如贝莱斯芽孢杆菌NRRL-23189和枯草芽孢杆菌C10所用)通过提升TCA循环中的α-酮戊二酸水平,促进谷氨酸合成[53];无机氮源[如(NH4)2SO4、NH4Cl]成本低于酵母提取物。如地衣芽孢杆菌WX-02添加50 mmol/L硝酸盐可通过还原反应再生NAD(P)H,γ-PGA产量可提升2.3倍[54]。葡萄糖是生长和代谢的主要能量来源。因此,高初始葡萄糖浓度导致生物量过多,但γ-PGA产量增加甚微,且相当一部分初始L-谷氨酸残留在培养基中。为了解决这个问题,枯草芽孢杆菌NX-2发酵中采用了补料分批操作策略,仅补加葡萄糖使其浓度保持较低水平,γ-PGA产量提升至42 g/L[55]。目前,葡萄糖是最佳碳源,经糖酵解和TCA循环生成γ-PGA前体(如丙酮酸)。但考虑碳氮源的成本和环保问题,也可以用甘蔗糖蜜、谷氨酸发酵废液(含残留谷氨酸)替代葡萄糖生成γ-PGA。

γ-PGA合成技术已形成微生物发酵与化学合成双轨并进格局。通过优化搅拌转速(250 r/min)和补料策略(糖质量浓度低于20 g/L时补加高浓度糖化液),枯草芽孢杆菌合成γ-PGA产量从11.30 g/L提升至50.2 g/L[56]。2023年研究报道swrA、rocA和putM基因的过表达可极大提高细胞合成γ-PGA能力,rocA和putM基因的表达量越高,则越有利于胞内谷氨酸的堆积,从而促进聚谷氨酸的生成[57]。研究表明地衣芽胞杆菌γ-PGA水解代谢相关的基因对γ-PGA合成的影响,D/L-肽链内切酶cwlO缺失菌株WX-02-ΔcwlO,在3L发酵罐中以L-谷氨酰胺和L-谷氨酸为前体进行培养,其γ-PGA产量达到36.3 g/L[58]。PGA从最初用于农业保水剂以来发展到如今可应用于肿瘤靶向载体、电离辐射抗辐照剂、重金属离子絮凝剂以及药物缓释(缓释效率可达60%)等应用领域,市场规模庞大。多学科交叉融合推进PGA制造向“低碳-智能-高值”范式跃迁,助推生物经济与绿色材料革命。

6 生物合成L-GLN

6.1 L-GLN的作用

L-GLN作为哺乳动物体内含量最丰富的游离氨基酸,是人体重要的生理代谢底物。正常人体血浆GLN浓度维持在0.6～0.9 mmol/L,而肌肉细胞中高达20 mmol/L,是血液浓度的30倍左右。此种氨基酸占人全身游离氨基酸总量的50 %以上,且L-GLN的含量变化直接关系到机体总氨基酸平衡。正常情况下人体依靠骨骼肌合成足够的GLN供应自身需要,但当受到创伤、感染、肿瘤等高代谢状态时,内源性合成无法满足机体需要,必须由外界补给。GLN的生理功能作用多样:为快速增殖细胞(如肠黏膜上皮细胞、淋巴细胞及血管内皮细胞)提供能量;合成关键生物分子,包括嘌呤、嘧啶核苷酸、氨基糖、GSH;作为氮载体,在肾产生氨、在肝合成尿素。在病理条件下(创伤、感染、癌症等),人体对GLN的需求急剧增加,造成血液和组织中的GLN缺乏,因此相应的临床应用也将会进一步刺激市场需求。随着行业应用范围进一步扩大,全球GLN市场总体规模不断增加,根据预测,2025年中国GLN市场规模可达42.5亿元左右,相较上年预测值调高约1.9个百分点,年复合增长率约17.3%,增长主要源于医药、功能食品、肿瘤靶向治疗等领域的传统化学合成方法。由于受高温高压化学转化影响,存在能耗高、手性纯度低以及污染大等问题,而生物合成技术反应条件温和、立体选择性高和环境友好等特点已成为近年的研究热点,即利用微生物细胞工厂或者酶催化系统来完成GLN的绿色生产[67]。

6.2 发酵法合成L-GLN

L-GLN的生物合成主要是在GS催化下发生的一系列反应:谷氨酸+ATP+NH3→L-谷氨酰胺+ADP+Pi,在微生物和高等生物体中均能发生该反应,为生物体固定氨的最主要方式之一。而且在微生物细胞工厂中GS活性会受到严格的调控,在转录水平、翻译后修饰(腺苷酰化)以及与代谢物之间均有涉及。

GS的优化是提高催化效率的关键。山东大学团队通过单因素试验、响应面实验和正交试验系统研究了GS胞外催化反应的条件优化,研究发现反应混合物中ATP浓度显著影响催化效率,当ATP浓度维持在40～50 mmol/L时,催化作用达到峰值。同时,酶量对反应也有较大影响,合理控制酶浓度可平衡反应速率与成本效益。酶固定化技术解决了GS稳定性问题。新型酶资源开发拓展了生物催化工具箱。研究者从吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)中克隆谷氨酰胺转胺酶基因,重组菌经乳糖诱导产生融合蛋白,在优化条件下表现出高效催化活性。

微生物发酵法以谷氨酸棒杆菌为生产菌株,通过代谢工程方法对其进行改造实现高产目的;用代谢流重排技术提高其合成效率;利用强葡萄糖-谷氨酸代谢通路、解除GLN反馈抑制、优化ATP提供体系等措施将更多的碳流引向GLN合成;2022年研究人员采用前期构建的L-GLN生产菌株CGQ03为出发菌株,通过强化谷氨酸脱氢酶表达及辅因子NADPH供应促进前体L-谷氨酸合成、增强辅因子ATP胞内含量、提高细胞携氧能力、增强关键酶GS催化活性及发酵工艺优化等策略提高了L-GLN产量。最终的基因工程菌发酵66 h,L-GLN的产量最高达(94.5±1.8) g/L,糖酸转化率为34.8%[68]。2023年刘畅等[69]通过响应面法优化了发酵培养基中葡萄糖、(NH4)2SO4和玉米浆含量,采用两阶段控制pH策略,发酵周期缩短至52 h,L-GLN产量达68.01 g/L,糖酸转化率达33.93%。刘云鹏等[66]针对发酵后期产酸效率下降,菌体衰亡老化的问题,设计了全营养流加发酵工艺并探究了流加甜菜碱和氯化胆碱对GLN发酵影响。使用最佳的全营养流加策略,GLN产量96.3 g/L,糖酸转化率提高了0.7%,达到41.6%[67]。这些研究通过代谢工程技术和发酵工程技术提高谷氨酸棒杆菌发酵产L-GLN产量、糖酸转化率、生产强度等技术指标,对促进L-GLN的工业化生产具有重要参考价值。

生物制造谷氨酰胺的未来集中于酶理性设计和途径优化提高合成效率,人工智能将会加速菌株设计与优化。同时传统发酵法正向合成生物学驱动的精准制造转型。

7 展望

技术创新、应用拓展和可持续发展是未来的发展方向,利用基因工程、代谢工程、合成生物学等先进科学技术手段提高谷氨酸及其衍生物的产量与应用范围;利用绿色生产工艺和产业化进程助力谷氨酸行业发展;由谷氨酸棒杆菌辅以人工染色体载体、蛋白定向进化形成的多样化工程菌株取代传统发酵菌株,成为综合型多功能细胞工厂;以突破基因组注释空白、设计动态代谢开关、建立非粮原料-产物链耦合,实现生物制造向“预测-编程-实现”跳跃式创新为目标。其主要发展方向为:用优异性能的高效工业菌种发酵谷氨酸衍生物新产品,拓宽新用途领域;进一步提高谷氨酸及衍生物生产效率、开发低成本、短周期培育高效菌株技术和优质天然谷氨酸生产集成技术;推动下游产业化发展;实现源头上可控的绿色环保目标。谷氨酸及其衍生物未来可能会更加广泛的应用于医药、食品、环保和材料等行业,从而为人类健康、可持续发展贡献力量。但是,生物合成高效低成本化技术尚未完全成熟、衍生物安全性评价、标准化研究有待加强等问题仍是当前面临的技术难题。跨学科协同创新推动谷氨酸与衍生物在人类健康、环境保护、绿色制造领域的应用。

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