肠道屏障稳态与人体健康息息相关,高脂饮食导致肠道屏障损伤,从而使细菌脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)移位引发炎症被认为是造成多种疾病病程加重、加速发展的重要因素[1-2]。自“肠-X轴”理论提出以来,肠道屏障功能在多种疾病发病机制作用的相关研究日益增多[3-4],靶向肠道屏障稳态的诊断及治疗方法也逐渐引起研究者们注意。由于益生菌安全性高、对机体副作用小,使用益生菌实现对肠道屏障功能的改善成为一种有效的治疗策略,具备良好发展趋势及治疗前景[5-6]。
最初研究者们直接使用益生菌菌体进行干预来明确其通过改善肠屏障功能对疾病的缓解作用,比如:戊糖乳植杆菌通过维持肠道通透性来减弱饮食诱导的胰岛素抵抗,进而抑制非酒精性脂肪肝的病程发展[7];植物乳植杆菌通过改善小鼠肠道菌群组成结构及肠道屏障完整性,从而减轻炎症[8]等。近年来研究者们逐渐将目光聚焦在益生菌代谢产物上,越来越多证据表明益生菌产生的代谢产物具备调节肠道屏障的治疗特性,比如植物乳植杆菌产生的胞外囊泡可以抑制肠上皮细胞凋亡,促进肠屏障修复[9];鼠李糖乳酪杆菌的发酵上清液可以修复肠上皮细胞单层屏障损伤[10]等。
作为乳酸菌次级代谢产物,胞外多糖(exopolysaccharides,EPS)通常具有优秀物化特性及生理活性[11]。多项研究证实了益生菌EPS具有缓解细胞氧化应激损伤、减少细胞凋亡等有益健康的作用[12-13]。前期研究从保加利亚自制发酵乳中分离到鼠李糖乳酪杆菌B6[14],得到了纯组分、结构明确的鼠李糖乳酪杆菌B6胞外多糖(B6-EPS),并报道其具备免疫调节能力[15]。本研究以LPS诱导的人结肠腺癌Caco-2细胞单层损伤模拟肠屏障受损现象,以B6-EPS为研究对象,通过与B6上清的干预效果对比,从Caco-2细胞活力、炎症因子水平、紧密连接蛋白表达及肠屏障电阻和通透性多方面明确作为代谢产物B6-EPS对LPS诱导肠屏障损伤的改善作用,为乳酸菌胞外多糖改善人体肠屏障损伤提供靶点及科学依据。
1 材料与方法
1.1 菌株与试剂
鼠李糖乳酪杆菌(Lacticaseibacillus rhamnosus)B6(CGMCC 13310)由乳业生物技术国家重点实验室提供;人结直肠腺癌Caco-2细胞株由中国科学院细胞资源中心提供。
De Man, Rogosa, and Sharpe medium(MRS)培养基,青岛海博生物科技有限公司;脱脂乳粉,新西兰恒天然集团;Dulbecco改良eagle培养基(DMEM)、minimum essential medium培养基(MEM),上海康宁有限公司;胎牛血清(foetal bovine serum,FBS),Hyclone公司;EDTA溶液、抗生素(青霉素-链霉素,PS),美国Thermo Fisher公司;LPS、异硫氰酸荧光素-右旋糖苷(fluorescein isothiocyanate-Dextran,FITC-Dextran),美国Sigma公司;Cell Counting Kit-8(CCK-8)试剂盒、BCA蛋白定量试剂盒(bicinchoninic acid kit),上海碧云天生物技术有限公司;细菌总RNA提取试剂盒MiniBEST Universal RNA Extraction Kit、TB Green Premix Ex Taq实时荧光定量PCR试剂,大连TaKaRa生物工程有限公司;Fast King一步法除基因组cDNA第一链合成预混试剂,北京天根生化科技有限公司;IL-8、IL-10、IL-18酶联免疫吸附测定法(enzyme linked immunosorbent assay,Elisa)试剂盒,上海江莱生物科技有限公司;Claudin 3抗体(货号16456-1-AP)、GAPDH抗体(货号60004-1-Ig),美国Proteintech公司;羊抗鼠HRP标记二抗(货号ZB-2305)、羊抗兔HRP标记二抗(AB-2301),北京中杉金桥生物技术有限公司;引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。
1.2 仪器与设备
Transwell细胞小室,德国Greiner bioone公司;QuantStudio 3实时荧光定量PCR仪,美国Thermo Fisher公司;CE7250紫外分光光度计,英国Bioaquarius公司;DeNovix-DS-11超微量分光光度计,美国DeNovix公司;Milli-cell ERS-2细胞电阻仪,德国Merck公司;Mini protean 3 cell垂直电泳仪,美国BIO-RAD公司;SYNERGYH1酶标检测仪,美国BioTek公司;6300化学发光仪,上海天能Tanon。
1.3 实验方法
1.3.1 B6-EPS及发酵上清液的制备
鼠李糖乳酪杆菌B6胞外多糖的制备方法采用HAN等[15]的方法,将得到的单组分鼠李糖乳酪杆菌B6多糖称之为B6-EPS。鼠李糖乳酪杆菌B6发酵上清液的制备方法如下:首先将鼠李糖乳酪杆菌B6以1%接种量接种至MRS液体培养基中,在37 ℃下培养18 h,之后以9 000 r/min,4 ℃条件离心10 min,弃沉淀后于超净工作台中用0.22 μm微孔滤膜将上清液过滤,将过滤液充分混匀并使用超微量分光光度计检测上清液中蛋白浓度,之后放置在-20 ℃条件下贮存备用。
1.3.2 Caco-2细胞培养及活力测定
使用含20%(体积分数)FBS及1%(体积分数)PS抗生素的MEM培养基,37 ℃、5% CO2、95%空气及饱和湿度的培养条件来培养Caco-2细胞,待生长密度达到80%～90%后,通过酶消化法消化并进行传代。关于B6-EPS对细胞活力的影响,首先以1×104细胞/孔的浓度将细胞接种至96孔板中培养24 h,之后去除旧培养基并使用质量浓度为6.25～200 μg/mL的B6-EPS处理细胞6 h,最后按照CCK-8试剂盒说明书,加入10 μL的CCK-8溶液,培养箱孵育2 h后测定470 nm波长下的吸光度值。
1.3.3 Caco-2细胞单层跨上皮电阻检测
以6×104细胞/孔的浓度将Caco-2细胞接种在12孔Transwell小室,使用DMEM完全培养基,37 ℃、5% CO2的培养条件培养21 d,每2 d更换一次培养基。使用Milli-cell电阻仪测量细胞单层的跨膜电阻值(transepithelial electrical resistance,TEER),TEER计算公式可参考於文慧等[11]的方法。待TEER值达到约600 Ω·cm2时,细胞单层达到稳定状态。在使用PBS洗涤后,分别用含1 μg/mL LPS、200 μg/mL B6-EPS +1 μg/mL LPS及含蛋白质量浓度为200 μg/mL的B6上清+1 μg/mL LPS的无血清培养基处理24 h并检测不同组别细胞单层的TEER值。
1.3.4 Caco-2细胞单层通透性检测
Caco-2细胞单层制备方式同1.3.3节,稳定后分别在小室测加入100 μL含0.2 mg/mL的FITC-Dextran,基底测加入DMEM培养液,孵育24 h后吸取100 μL基底测培养液于激发波长485 nm,发射波长538 nm下检测吸光度,并根据於文慧等[11]提到的方法计算各组表观渗透系数(Papp)。
1.3.5 Caco-2细胞炎性因子检测
以5×105细胞/孔的浓度将Caco-2细胞接种于12孔板中,使用MEM完全培养基,于37 ℃、5% CO2、95%空气及饱和湿度的培养条件下培养24 h,吸取上清液弃掉后,每孔加入MEM无血清培养基(阴性对照组)、1 μg/mL LPS(LPS模型组)、200 μg/mL B6-EPS+1 μg/mL LPS(LPS+B6多糖组)及含蛋白质量浓度为200 μg/mL的B6上清+1 μg/mL LPS(LPS+B6上清组)与无血清培养基,共孵育24 h。之后吸取细胞培养基,并于4 ℃ 1 000 r/min 离心5 min,使用Elisa试剂盒根据说明书来检测Caco-2细胞炎性因子IL-8、IL-10及IL-18的含量。
1.3.6 转录组测序及实时荧光定量PCR
分组及培养方式同1.3.5节,共孵育9 h后,使用PBS洗涤2次,通过RNA提取试剂盒提取细胞总RNA,送至上海美吉生物医药科技有限公司进行转录组文库构建及测序。对提取的细胞总RNA进行反转录,并以合成的cDNA为模板,进行实时荧光定量PCR,引物信息如表1所示,并通过2-ΔΔCt法对各组mRNA相对表达量进行计算。
表1 实时荧光PCR所用引物
Table 1 The primer sequences using in RT-qPCR
基因上游引物序列(5′-3′)下游引物序列(5′-3′)ZO-1GAATGATGGTTGGTATGGTGCG TCAGAAGTGTGTCTACTGTCCGOccludinACTTCAGGCAGCCTCGTTACCCTGATCCAGTCCTCCTCCACldn1GCAGATCCAGTGCAAAGTCT CATACACTTCATGCCAACGGCldn3CTGCTCTGCTGCTCGTGTC CGTAGTCCTTGCGGTCGTAGGAPDHACCCACTCCTCCACCTTTGACCCACCACCCTGTTGCTGTAG
1.3.7 紧密连接蛋白CLDN3检测
分组及培养方式同1.3.5节,收集处理9 h后各组的细胞,加入RIPA(radio-immunoprecipitation assay)裂解液冰上裂解30 min,在4 ℃、12 000 r/min条件下离心15 min,收集上清液并进行蛋白定量检测。制备PAGE胶,根据蛋白定量结果计算每孔上样量并于蛋白上样缓冲液混合,沸水浴10 min后,以25 μg各样品总蛋白量电泳,转膜,使用质量分数5%脱脂奶粉封闭1～2 h。根据说明书以稀释倍数1∶30 000(体积比)稀释一抗,4 ℃孵育过夜,根据稀释倍数1∶5 000(体积比)稀释二抗,与膜37 ℃孵育2 h。使用ECL化学发光法进行显色并放入成像系统进行扫描,并使用Image J 1.52a软件确定条带灰度值。
1.4 数据处理及统计学分析
本实验中转录组数据分析通过美吉云平台完成,其余数据统计分析及绘图制作均通过GraphPad Prism 9软件完成。多组比较采用单因素方差分析,并在各组间进行Tukey’s多重比较。差异性分析中*、**、***、****分别代表P<0.05、P<0.01、P<0.001、P<0.000 1,ns代表无显著差异。
2 结果与分析
2.1 B6-EPS对Caco-2细胞活力影响
在明确B6-EPS对LPS诱导Caco-2细胞损伤的影响前,首先通过CCK-8的方法检测B6-EPS对Caco-2细胞活力的影响,来确定适合后续实验的B6-EPS浓度。结果如表2所示,当B6-EPS的质量浓度在较低范围内(6.25～100 μg/mL)时,细胞活力与对照组没有显著差异,当B6-EPS的质量浓度达到200 μg/mL时,与对照组相比细胞活力得到显著提升(P<0.05),说明该浓度可以促进肠上皮细胞增殖,这与前期使用B6-EPS干预巨噬细胞结果类似。因此,在6.25～200 μg/mL范围内,B6-EPS对Caco-2细胞无毒性,选取200 μg/mL作为后续B6-EPS的干预质量浓度。
表2 B6-EPS对Caco-2细胞活力的影响
Table 2 The effect of B6-EPS on the viability of Caco-2 cells
实验组别B6多糖质量浓度/(μg/mL)细胞活力/%与对照组比较P值对照组0.00 98.510399.3—实验组6.2595.81081041.00 12.591.597.399.30.9925.0 10210996.61.0050.0 1111061020.951001271061140.222001261081320.04
注：—表示无数据(下同)。
2.2 B6-EPS及上清对Caco-2细胞炎症因子的影响
如图1所示,与阴性对照组相比较,LPS模型组的抑炎因子IL-10的含量显著降低(P<0.01),促炎因子IL-8的含量显著升高(P<0.05),说明LPS刺激会引发Caco-2细胞的炎性反应。与LPS模型组相比,使用B6-EPS可以显著提升抑炎因子IL-10的水平(P<0.01),虽然使用B6上清也可以提升IL-10水平,但与LPS模型组相比提升水平并不显著。尽管B6-EPS和B6-上清均能使促炎因子IL-8水平下降,但与LPS模型组对照未能体现出显著性(图1-c)。此外,研究结果显示LPS模型组显著增加了炎性因子IL-18的含量,而B6-EPS和B6上清均能显著降低IL-18的含量,使其接近阴性对照组的水平。以上结果表明,B6-EPS能通过提升IL-10、降低IL-18的水平来缓解LPS诱导的细胞炎症反应,B6上清也可以保护Caco-2细胞,降低LPS导致的炎性状况,但效果略逊于B6-EPS。
a-IL-10含量;b-IL-18含量;c-IL-8含量
图1 B6-EPS对LPS刺激下Caco-2细胞中IL-10、IL-18及IL-8含量的影响
Fig.1 The effect of B6-EPS on the contents of IL-10, IL-18, and IL-8 in Caco-2 cells stimulated by LPS
注:*,**,***,****分别代表P<0.05,P<0.01,P<0.001及P<0.000 1, ns代表无显著差异(下同)。
2.3 B6-EPS及上清对Caco-2细胞单层电阻和通透性的影响
B6-EPS及B6上清对LPS诱导Caco-2细胞单层电阻值的影响结果如图2所示,在连续培养21 d后细胞单层TEER达到600 Ω·cm2,满足后续实验标准(图2-a)。按照各组干预条件干预24 h后,LPS模型组的TEER值显著低于阴性对照组(图2-b),TEER变化波动最大(图2-c),说明LPS刺激会导致Caco-2细胞单层电阻值降低。而B6-EPS和B6上清干预均可以显著提升单层TEER值,显著减少24 h TEER的变化量,且两者效果差异不大。B6-EPS及B6上清对LPS诱导Caco-2细胞单层通透性的影响结果如图3所示,LPS诱导显著增加了细胞单层通透性(P<0.001),而经B6-EPS和B6上清干预后,能缓解LPS造成的通透性增加的情况,并使该值与阴性对照组无显著差异。综合上述电阻值及通透性实验结果,表明B6-EPS和B6上清可以缓解LPS刺激导致Caco-2细胞单层模拟的肠屏障受损现象,具体体现在可显著提升细胞单层的电阻值,降低单层的通透性,进而起到对肠道屏障功能的保护作用。
a-0 h各组TEER值;b-24 h各组TEER值;c-各组TEER变化值
图2 不同时间各组Caco-2细胞单层TEER值及变化值
Fig.2 The TEER/ΔTEER of Caco-2 cells monolayer in each group with different time
图3 各组Caco-2细胞单层荧光透过率
Fig.3 The fluorescence transmittance of Caco-2 cells monolayer
2.4 B6-EPS对细胞紧密连接蛋白CLDN3的影响
为了进一步确定B6-EPS干预后显著调节的基因,在干预9 h时对LPS模型组和LPS+B6多糖组2组进行转录组测序,对转录组结果显著差异基因分析如表3显示,2组中共有20个基因有注释信息并且表现出差异性,有5个基因可以关联到KEGG通路,并且有一定程度的富集,分别是紧密连接的cldn3基因、Wnt信号通路的notum基因、细胞因子及受体相互作用的gdf15基因、胆固醇代谢的tspo基因、氧化磷酸化的ndufs7基因,且这些基因均在LPS+B6多糖组中更高(图4-a)。对差异基因进行GO功能富集分析并对显著性水平P值前5的基因本体化术语(GO term)进行展示,结果如图4-b所示,B6-EPS干预对紧密连接cldn3基因关联的细胞间黏附GO term的富集程度相对较高,KEGG富集分析也表明B6-EPS干预对cldn3基因关联的紧密连接、细胞黏附分子及白细胞跨内皮迁移通路均有一定程度的富集效果(表3)。由于紧密连接蛋白与肠屏障作用关系密切,且cldn3的差异倍数较高(log2FC=-1.528),因此对该基因进行基因及蛋白水平上的进一步验证,与转录组数据结果一致,相较于LPS模型组,B6-EPS干预能显著提升cldn3基因的转录水平(图4-c)及紧密连接蛋白CLDN3的表达量(图4-d)。此外,对包括ZO-1、Occludin及cldn1在内的其他关键紧密连接蛋白的mRNA转录水平进行了验证,结果显示与LPS模型组对比,B6-EPS和B6上清可以显著提升Occludin基因的转录水平,但B6-EPS和B6上清对ZO-1及cldn1基因的转录水平没有显著影响(图5)。以上结果表明,B6-EPS主要通过提升紧密连接蛋白CLDN3的表达量,维持Caco-2细胞单层的致密性,进而缓解LPS诱导造成的肠屏障受损现象。
a-基于转录组测序数据的差异基因火山图;b-cldn3基因的RT-qPCR检测结果;c-基于转录组测序数据的GO功能富集分析;d-CLDN3蛋白的WB结果
图4 CLDN3在LPS+B6多糖组与LPS模型组的显著差异
Fig.4 The significant differences of CLDN3 between LPS+B6-EPS and LPS group
a-ZO-1基因的RT-qPCR检测结果;b-Occludin基因的RT-qPCR检测结果;c-cldn1基因的RT-qPCR检测结果
图5 不同组别其他关键紧密连接蛋白的mRNA转录水平差异
Fig.5 Transcription level of other key tight junction proteins in different groups
表3 LPS+B6多糖组与LPS模型组注释到的差异基因表
Table 3 The differential expression analysis of annotated genes between LPS+B6-EPS and LPS group
基因ID基因名称基因描述KEGG通路描述log2 FC(LPS/LPS+B6-EPS)调整后P值KEGG富集因子ENSG00000214892Usp8p1泛素特异性蛋白酶8假基因1—-2.262 0.000ENSG00000165215Cldn3紧密连接蛋白3紧密连接/细胞黏附分子/白细胞跨内皮迁移-1.528 0.000 0.006 1/0.006 9/0.009 3ENSG00000152082Mzt2b有丝分裂纺锤体组装蛋白2B—-1.464 0.000ENSG00000040608Rtn4r网状蛋白4受体—-1.439 0.005ENSG00000173621Lrfn4富含亮氨酸重复序列和Ⅲ型纤连蛋白结构域蛋白4—-1.406 0.000ENSG00000240972Mif巨噬细胞迁移抑制因子—-1.348 0.000ENSG00000177045Six5SIX同源框蛋白5—-1.274 0.000ENSG00000205746Pkd1p4多囊蛋白1、瞬时受体电位通道相互作用假基因4—-1.234 0.000ENSG00000166126Amn羊膜相关跨膜蛋白—-1.216 0.000ENSG00000181649Phlda2普列克底物蛋白同源样结构域家族A成员2—-1.215 0.002ENSG00000185269Notum诺图姆蛋白、棕榈油酰蛋白羧酸酯酶Wnt信号通路-1.212 0.005 0.006 2ENSG00000165644Comtd1含儿茶酚-O-甲基转移酶结构域蛋白1—-1.199 0.016ENSG00000204316Mrpl38线粒体核糖体蛋白L38—-1.179 0.000ENSG00000253797Utp14cUTP14C小亚基加工体组件—-1.153 0.006ENSG00000212864Rnf208环指蛋白208—-1.148 0.047ENSG00000130513Gdf15生长分化因子15细胞因子-细胞因子受体相互作用-1.147 0.000 0.003 5ENSG00000100300Tspo转位蛋白胆固醇代谢/神经活性配体-受体相互作用-1.036 0.000 0.020 4/0.003 0ENSG00000115286Ndufs7NADH:泛醌氧化还原酶核心亚基S7氧化磷酸化/化学致癌作用-活性氧/非酒精性脂肪肝-1.027 0.000 0.007 6/0.004 6/0.006 7ENSG00000169583Clic3细胞内氯离子通道蛋白3—-1.023 0.006ENSG00000132967Hmgb1p5高迁移率族蛋白B1假基因5—1.198 0.001
3 结论与讨论
肠道屏障损伤导致细菌脂多糖移位从而引发低度炎症是造成炎症性肠病及代谢相关疾病的重要因素,虽然文献已报道了益生菌调节肠道菌群、改善肠屏障功能等对肠道健康的保护作用,但却未明确真正起作用的功效分子。前期通过对鼠李糖乳酪杆菌B6代谢产物分离纯化得到了单一成分的胞外多糖,并对其结构进行了明确解析[15]。本研究通过使用LPS刺激Caco-2细胞单层来模拟肠屏障损伤现象,结合与B6上清的效果对比,突出作为代谢产物,B6-EPS从炎症反应、肠道通透性、紧密连接蛋白表达等多方面对LPS诱导肠屏障损伤的显著改善作用。
炎性因子在LPS诱导肠上皮屏障损伤中起重要作用,本研究通过对Caco-2细胞炎性因子的检测发现B6-EPS能够显著降低抑炎因子IL-10的水平(图1-a),改善肠屏障功能,这与前期文献报道的IL-10可以减轻肠黏膜损伤,修复肠屏障功能相一致[16]。尽管LPS可以通过诱导产生促炎因子IL-8引发肠道炎症反应,造成肠上皮屏障功能异常[17],本研究也观察到这一现象,但B6-EPS对IL-8的抑制效果并未体现出显著性(图1-b)。至于炎性因子IL-18,文献报道其在维持肠屏障稳态时具有两面性,既通过促进肠上皮细胞增殖和减少肠上皮细胞炎症来维持肠屏障稳态[18],又会通过抑制杯状细胞成熟的方式促进肠黏膜损伤[19]。本研究结果显示与LPS模型组相比,B6-EPS显著降低了IL-18的水平,B6-EPS调节IL-18进而维持肠屏障功能稳态的具体机制需要后续实验进一步挖掘。此外,相比较与B6-EPS,B6上清无法显著提升抑炎因子IL-10的表达,对IL-18的抑制水平也低于B6-EPS,由此可见B6代谢产物中,B6-EPS可能在对LPS诱导肠上皮屏障损伤中炎性因子的调控中起到主要作用。
紧密连接蛋白(claudins, CLDNs)可促进肠上皮细胞紧密连接的形成,是调节紧密连接细胞旁通透性的决定因素[20]。本研究通过转录组、实时荧光定量PCR结合WB的方式从基因转录到蛋白表达多方面证实了B6-EPS能够显著提升CLDN3水平(图3)。作为CLDNs中的一员,CLDN3在维持肠上皮细胞间物理屏障功能和参与分子细胞间传递方面发挥重要作用,对肠屏障和CLDN3的相关性研究显示在肠道屏障受损导致的炎性疾病中CLDN3的表达量显著下降,当肠道通透性增加时cldn3基因表达也会受到一定程度的抑制[21-22]。尽管B6-EPS显著提升CLDN3水平,但由于目前对于Caco-2细胞中cldn3基因表达信号通路的相关研究较少,后续需要通过更多实验来进一步探究B6-EPS通过调控CLDN3信号通路提升肠屏障完整性的具体作用机制。此外,其他关键紧密连接蛋白的qPCR结果显示B6-EPS和B6上清均可显著提升Occludin基因的转录水平(图5),结合对Caco-2细胞单层电阻和通透性的影响,说明他们可能通过促进Occludin基因与肌动蛋白细胞骨架的连接进而改善肠道屏障功能。
除紧密连接蛋白外,B6-EPS还显著促进基因gdf15、tspo及ndufs7的表达(表3)。其中GDF15参与糖脂代谢和免疫应答等多种生理过程,能抑制炎症、氧化应激和细胞凋亡[23]。TSPO除参与转运胆固醇外,还参与抗炎反应和细胞凋亡的调控,在炎症条件下,TSPO表达增加可帮助细胞应对应激[24]。NDUFS7通过参与线粒体呼吸链电子传递,影响活性氧产生进而调节细胞凋亡信号通路,此外还会影响细胞的氧化应激反应和代谢调控[25]。说明B6-EPS在调节细胞炎症、氧化应激状态上具备潜在能力,后续研究可以上述基因涉及通路进一步展开。
总体而言,本研究结果证明了作为益生菌代谢产物,相较于B6上清,B6-EPS通过增加紧密连接蛋白CLDN3表达,提升Caco-2细胞单层的电阻及致密性,并通过促进抑炎因子IL-10表达,保护LPS诱导引起的Caco-2细胞炎症反应及屏障损伤。此外,本研究选取单一成分结构明确的益生菌胞外多糖,既为益生菌功效分子保护LPS诱导肠屏障损伤作用提供支持,又为后续以CLDN3为靶点调控肠屏障功能的深层机制探索提供依据及便利。未来可以通过构建基因敲减细胞系证实CLDN3在B6-EPS保护肠屏障功能中的重要作用,并根据多糖结构对其进行标记,结合动物实验来明确B6-EPS体内改善肠屏障的作用效果及具体机制。
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