骨质疏松是一种全身代谢性疾病,由各种原因引起,表现为骨量丢失、减少,骨组织微结构发生改变,进而导致骨骼脆性增加,使患者易发生骨折[1]。补充钙剂是治疗骨质疏松的基础措施,但仅补充钙剂对于骨质疏松的治疗是远远不够的,还需根据患者的具体情况联合使用其他药物。
目前,临床上主要使用受体调节剂或激素类药物治疗骨质疏松,这些药物能够有效的促进成骨细胞的形成,抑制破骨细胞的形成。但是,所有双膦酸盐都会影响肾功能,而且可能导致或加剧低钙血症的发生[2]。同时,双膦酸盐会导致部分患者出现吞咽困难、食管炎症、胃痛等不良反应。雌激素会增加胆结石病和静脉血栓栓塞症的发病风险[3-4]。因子κ-B配体受体致活剂(receptor activator of nuclear factor κ-B ligand,RANKL)抑制剂地舒单抗的安全性与双膦酸盐相似。所有抗骨折疗法都只能治疗但不能治愈疾病。停药后,骨骼退化迟早会恢复,多达80%～95%的患者在髋部骨折修复后出院,出院时没有抗骨折治疗或管理计划[5-7]。因此,亟需找到一种能够有效缓解骨质疏松,并且长期使用不会导致患者产生并发症以及副作用的药物或治疗方法。
维生素D是维持骨骼生理功能以及骨骼生长发育的重要元素,在维持骨骼健康和调节矿物质离子稳态方面的作用已得到充分证实。此外流行病学证据表明,维生素D水平低与多种常见疾病风险增加存在一致关联,包括肌肉骨骼、代谢、心血管、恶性肿瘤、自身免疫和传染病[8-10]。维生素D活性形式1,25二羟基维生素D[1,25-dihydroxyvitamin D,1,25(OH)2D]还可以作为直接激动剂与维生素D受体(vitamin D receptor,VDR)结合,在调节钙稳态和免疫系统方面有重要作用。儿童和老年人适当的补充维生素D对骨骼有直接的好处,比如可以改善人体的肌力,调节人体的平衡能力;对于促进人体的骨骼健康有重要作用。
骨质疏松患者通常存在维生素D代谢能力降低的情况。维生素D在体内需要经过2个关键代谢步骤才能发挥作用:首先,维生素D在肝脏中被转化成25-羟基维生素D[25-hydroxy vitamin D,25(OH)D],然后在肾脏中进一步转化成活性形式的1,25(OH)2D[11]。维生素D代谢物与胆汁酸一起分泌,并在回肠末端重新吸收;因此,回肠末端疾病、吸收不良以及其他原因造成的肠道较短可导致血清25(OH)D水平降低。骨质疏松患者可能由于多种原因导致维生素D的代谢能力降低。其中最常见的原因是年龄增长和肾功能减退。随着年龄增长,皮肤合成维生素D的能力减弱,导致维生素D储存形式25(OH)D水平下降。同时,肾脏功能衰退可能会阻碍1,25(OH)2D的生成,进一步降低维生素D的代谢能力[12]。因此老年人群以及骨质疏松患者需要通过额外摄入维生素D来弥补维生素D合成能力降低。而美国内分泌协会提出经验性补充维生素D和一般人群不需要常规筛查25(OH)D水平的建议[13]。在这个背景下,鉴于1,25(OH)2D作为维生素D发挥其生理活性功能的最主要活性形式,探讨如何提高1,25(OH)2D水平显得更为关键。同时许多研究表明,肠道微生物群改变了肠道维生素D代谢,益生菌补充剂可以影响循环维生素D水平。
因此,本研究旨在深入挖掘研究通过膳食干预提高维生素D主要生理活性物质1,25(OH)2D的水平,进一步研究其对视黄酸(retinoic acid,RA)诱导的骨质疏松小鼠的影响,从而揭示其对骨质疏松的缓解作用及其提高维生素D活性水平背后的原因。此外,随着人口老龄化发展,骨质疏松发病率不断上升,消费者对维生素D日常补充的关注也日益增加。因此,本研究为提高维生素D活性水平对抗骨质疏松提供理论依据,在制备提高维生素D生理活性功能、预防或治疗骨质疏松、骨流失的产品中,具有巨大的应用前景。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
链脲佐菌素,Sigma公司;二甲双胍,阿拉丁试剂有限公司;体积分数4%多聚甲醛固定液,上海碧云天生物技术有限公司;氯化血红素、维生素K,青岛日水生物技术有限公司;血清钙、碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,AKP)商业检测试剂盒,南京建成生物工程研究所;小鼠血清25(OH)D(货号ml038442)、血清1,25(OH)2D Mouse ELISA试剂盒(货号ml062981),上海酶联生物科技有限公司;小鼠骨钙素(osteocalcin,OCN)(货号E-EL-M0864)、Ⅰ型前胶原氨基端原肽(procollagen I N-terminal propeptide,PINP) Mouse ELISA试剂盒(货号E-EL-M0233),美国Elbscience有限公司;反转录试剂盒,货号R211-01,中国南京诺唯赞有限公司。
本所用的菌株均来自江南大学生物技术中心微生物菌种保藏中心(Culture Collection of Food Microorganisms,CCFM)。长双歧杆菌长亚种(Bifidobacterium longum subsp. longum)CCFM1448,已于2024年10月31日保藏于广东省微生物菌种保藏中心,保藏编号为GDMCC65383;青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentis)CCFM1447已于2024年10月31日保藏于广东省微生物菌种保藏中心,保藏编号为GDMCC65382。
1.2 仪器与设备
ME3002E电子天平、ME204E分析电子天平,瑞士梅特勒-托利多有限公司;MX-S涡旋混匀仪,北京大龙兴创实验仪器有限公司;Multiskan GO全波长酶标仪、MB100-2A微孔恒温振荡孵育器、thermo-994型超低温冰箱,美国赛默飞科技有限公司;SX-500高压蒸汽灭菌锅,日本Tomy公司;400TG厌氧工作站,英国Eletrotek公司;lateta LCT200 mirco-CT扫描仪,日本东京Hitachi-Aloka公司;QuantStudioTM6 Flex Real-time PCR系统,美国Applied Biosystems公司。
1.3 实验动物
选取6周龄,体质量为18～20 g的无特定病原体级C57BL/6 J雄性小鼠作为实验小鼠,小鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司。
1.4 实验方法
1.4.1 菌株悬浮液的制备
长双歧杆菌CCFM1448菌悬液的制备方法:将冻存于-80 ℃的长双歧杆菌取出后,在超净台里以4%的接种量接入含有质量分数为0.05% L-半胱氨酸的MRS液体培养基中,置于37 ℃的厌氧箱中培养18～24 h,随后平板划线并挑选单菌落至液体培养基中,液体培养一代后,进行菌种保藏和鉴定,确保鉴定无误后重新进行活化,活化2次后进行扩大培养,培养条件同上,最后将菌液在8 000 r/min下离心15 min,并用含有质量分数为0.05% L-半胱氨酸的质量分数为0.9%无菌生理盐水洗菌2次,用含有质量分数0.05% L-半胱氨酸的30%(体积分数)甘油重悬后保存于-80 ℃冰箱。灌胃前进行平板活菌计数,并使用含有质量分数为0.05% L-半胱氨酸的无菌生理盐水将菌液稀释至1×109 CFU/mL的浓度。
青春双歧杆菌CCFM1447菌悬液的制备方法:除每次接种后在37 ℃的厌氧箱中培养24～36 h外,其余步骤同上述长双歧杆菌菌悬液制备方法。
1.4.2 动物分组及喂养方法
本文所涉及的所有动物实验均经江南大学实验动物伦理委员会审查通过(伦理审查号:JN.No20231030c1360128[515])。图1为实验设计图。饲养温度为(23±2) ℃,相对湿度为(50±10)%,小鼠自由饮食进水,采用国家标准啮齿类动物饲料饲养。动物实验在江南大学动物实验中心(中国无锡)进行。每周同一时间更换饮水和笼具,每隔2～3 d更换1次饲料。
图1 动物实验设计
Fig.1 Animal experiment design
造模方法根据先前研究并进行适当修改[14-16]。适应1周后,随机选择6只小鼠作为空白组,除空白组外,其余小鼠灌胃200 μL的90 mg/kg BW/d的RA以诱导骨质疏松,持续3周。3周后将造模小鼠随机分为5组:模型组、维生素D组、混菌组、混膳组和复配组,分组信息如表1所示。从第4周开始直至第6周,空白组和模型组灌胃无菌生理盐水,维生素D组灌胃0.06 μg/kg BW/d维生素D溶液,益生菌组灌胃菌株混合液,膳食因子组灌胃膳食因子溶液,复配组灌胃对应的益生菌膳食复配组合溶液,各组每只小鼠灌胃体积均为0.2 mL。实验期间自由饮水,摄食标准饲料,在第8周结束实验。
表1 动物实验分组信息表
Table 1 Animal experiment grouping information table
序号分组灌胃溶液1空白组无菌生理盐水2模型组无菌生理盐水3维生素D组0.06 μg/kg BW/d维生素D溶液4混菌组含1×109 CFU/mL长双歧杆菌CCFM1448与1×109 CFU/mL青春双歧杆菌CCFM1447的混合溶液5混膳组浓度为150 mmol/L的姜黄素与150 mmol/L低聚半乳糖混合溶液6复配组含1×109 CFU/mL长双歧杆菌CCFM1447、1×109 CFU/mL青春双歧杆菌CCFM1449、150 mmol/L姜黄素与150 mmol/L低聚半乳糖混合溶液
参考姜黄素和益生菌对骨质疏松改善效果的荟萃分析,确定益生菌与膳食因子复配组合的剂量和制备方法[17]。灌胃溶液体积均为200 μL,将长双歧杆菌菌液与青春双歧杆菌菌液从冰箱中取出,离心去上清液后,用生理盐水重悬并混合,使其最终浓度都为1×109 CFU/mL,作为混菌组灌胃溶液;混合150 mmol/L姜黄素与150 mmol/L低聚半乳糖溶解在0.5%(质量分数)羧甲基纤维素钠溶液中,作为混膳组灌胃溶液;用0.5%(质量分数)羧甲基纤维素钠溶液重悬混合1×109 CFU/mL长双歧杆菌与1×109 CFU/mL青春双歧杆菌,并溶解150 mmol/L姜黄素和150 mmol/L低聚半乳糖,作为复配组灌胃溶液。
1.4.3 检测指标
1.4.3.1 小鼠血清及组织样品采集与处理
实验结束前,采集各组小鼠的粪便样本,并尽快保存于-80 ℃条件下。小鼠禁食12 h,用异氟烷麻醉,随后通过摘取眼球的方式采集血液,并立即通过颈椎脱臼法处死。采集眼球血后在室温下静置2 h,以3 500 r/min离心10 min,以取出上层血清,并迅速转移至-80 ℃冰箱保存。随后取出肝脏、胰腺等组织,将肝脏称重,并取部分肝脏、胰腺固定在体积分数4%多聚甲醛溶液中,剩下部分则先放入液氮,再转移至-80 ℃冰箱中备用。解剖取下小鼠的双侧股骨和胫骨,去除周围结缔组织。将左股骨和胫骨分别放入装有体积分数4%多聚甲醛的5 mL无菌不透光离心管中,用于Mirco-CT测量。右股骨和胫骨保存在-80 ℃冰箱中。
1.4.3.2 小鼠股骨结构指标的测定
将小鼠右胫骨取下固定在体积分数4%多聚甲醛溶液中,测量时吸干液体进行检测。使用mirco-CT扫描仪对样品进行扫描。将各组小鼠右侧股骨适当放置于micro-CT成像系统中进行X射线扫描成像,程序参数为:90 kV、88 μA、视野18 mm、采集时间14 min、像素大小36 μm。将每只股骨旋转360°获取数据,导入Analyze 12.0软件重建股骨3D图像进行分析。从生长板下方0.2 mm处选取厚度为1 mm的区域作为感兴趣区域进行骨参数计算,主要包括总骨密度、皮质骨密度、骨小梁骨密度、骨小梁分离度、骨小梁厚度、骨小梁数、骨小梁连接密度、骨表面积、骨体积和骨体积分数。
1.4.3.3 血清生化指标检测
从-80 ℃冰箱取出血清,在冰上待其复溶后,使用商业检测试剂盒测量血清Ca+和AKP水平;使用商业Mouse ELISA试剂盒测量小鼠血清25(OH)D、1,25(OH)2D、OCN和PINP水平。
1.4.3.4 骨代谢相关基因的逆转录聚合酶链式反应检测
小鼠股骨样本在冰浴中匀浆。用氯仿和异丙醇依次提取匀浆中的RNA,然后在4 ℃下以12 000 r/min的转速离心15 min。沉淀物用预冷的体积分数75%乙醇溶液反复洗涤,然后溶解,得到总RNA溶液。用分光光度法和琼脂糖凝胶电泳评估RNA的浓度和质量。根据生产商的说明,用反转录试剂盒将每个样本的总RNA反转录为cDNA。
在QuantStudioTM6 Flex Real-time PCR系统中使用SYBR qPCR Mix进行实时定量PCR。PCR循环程序如下:95 ℃预变性30 s,95 ℃变性10 s,60 ℃退火30 s,共40个循环。以GAPDH作为内参进行归一化处理后,目标基因的相对表达水平用目标基因的表达水平与模型组中相应基因的表达水平之比表示。VDR、Wnt10b、β-catenin、Osterix、Runx2、RANKL、OPG的引物如表2所示。引物由生工生物技术(上海)有限公司设计和合成。
表2 引物信息表
Table 2 Primer information table
基因名称类别双向引物序列(5′→3′)VDRPrimer FGAATGTGCCTCGGATCTGTGGPrimer RATGCGGCAATCTCCATTGAAGWnt10bPrimer FCTCCACTACAGCCCAGAACPrimer RCTCCCAAGAGCCTGACAAGβ-cateninPrimer FTCACGCAAGAGCAAGTAGPrimer RCTGGACATTAGTGGGATGAGOsterixPrimer FTGCCTACTTACCCATCTGACPrimer RTTGCCCACTATTGCCAACRunx2Primer FTTTGCCCTCATCCTTCACPrimer RGCTTCTGCTACCACTCTAACRANKLPrimer FATGAAACTCACAGCCCTCTCPrimer RCATCGGAATACCTCTCCCAATCOPGPrimer FAGGGCATACTTCCTGTTGPrimer RTTCCTGGGTTGTCCATTCNF-κBPrimer FCCAGCAGGGAAGCAAATCPrimer RACACGGGCATAGAGTCAGGADPHPrimer FATCACTGCCACCCAGAAGPrimer RTCCACGACGGACACATTG
1.5 数据统计及分析
数据均以“平均值±标准差”表示。多组间的差异采用ANOVA和Dunnett’s多重检验进行分析。当P<0.05时,数据有显著差异(*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001,****P<0.000 1)。使用Origin 9.5软件和R语言进行统计分析并绘图。
2 结果与分析
2.1 维生素D代谢产物水平
由图2可知,骨质疏松导致小鼠血液中维生素D代谢产物水平下降。与模型组相比,维生素D组显著提高维生素D代谢产物水平,使其恢复到正常小鼠水平。菌株干预组和膳食因子干预组显著提高小鼠25(OH)D水平,但是在1,25(OH)2D水平上没有显著差异。而益生菌膳食复配组与模型组相比,骨质疏松小鼠的维生素D代谢产物[25(OH)D和1,25(OH)2D]水平显著提高。结果表明,益生菌膳食复配与维生素D有相似的治疗效果,可以显著提高骨质疏松小鼠的维生素D代谢产物水平,且益生菌与膳食因子复配具有协同效应,能更显著提高小鼠1,25(OH)2D水平。
A-25(OH)D;B-1,25(OH)2D
图2 不同组别小鼠血清中25(OH)D和1,25(OH)2D的水平
Fig.2 The levels of 25(OH)D and 1,25(OH)2D in the serum of different groups of mice
注:*表示与模型组相比有显著差异(P<0.05),**表示与模型组相比有较大显著差异(P<0.01),***表示与模型组相比有极显著差异(P<0.001)(下同)。
2.2 血清骨指标
由图3可知,骨质疏松模型小鼠血清Ca2+和血清AKP水平显著高于空白组小鼠,OCN和PINP水平显著低于正常组小鼠,这说明RA诱导骨质疏松模型小鼠成功建立。维生素D组较模型组降低血清钙和AKP水平,提高小鼠血清OCN水平和PINP水平。菌株干预组和膳食因子干预组能显著改善AKP和OCN水平,但菌株干预对血清Ca2+水平没有显著改善,且二者单独干预都无法改善PINP水平。益生菌膳食复配组较之模型组,骨质疏松小鼠血清Ca2+和AKP水平显著降低,血清OCN和PINP水平显著提高,达到与空白组相当的水平,且与维生素D治疗效果相当,说明益生菌膳食复配能够综合二者的优点,对4个指标都有显著改善效果,从而起到了与维生素D治疗效果相似的提高造骨细胞合成能力,促进新骨形成,修复骨骼损伤和改善骨质疏松的作用。
A-血清Ca2+;B-AKP;C-OCN;D-PINP
图3 不同组别小鼠血清中Ca2+、AKP、OCN和PINP的水平
Fig.3 The levels of calcium ions, AKP, OCN, and PINP in the serum of different groups of mice
2.3 骨强度和骨结构
由图4可知,与空白组相比,骨质疏松小鼠的总骨密度、骨小梁骨密度、骨表面积、骨体积和骨体积分数显著降低。使用维生素D治疗后,显著改善了小鼠骨小梁骨密度,也提高了总骨密度和皮质骨密度,但效果并不显著。与模型组相比,复配组合干预后小鼠的总骨密度、皮质骨密度、骨小梁骨密度、骨体积和骨体积分数都有显著改善效果,且恢复到正常小鼠水平。
A-总骨密度;B-皮质骨密度;C-骨小梁骨密度;D-骨表面积;E-骨体积;F-骨体积分数
图4 益生菌与膳食因子复配组合干预对骨质疏松小鼠骨密度和骨体积的影响
Fig.4 Effect of the combination of probiotics and dietary factors intervention on bone density and volume in osteoporotic mice
由图5可知,与空白组相比,骨质疏松小鼠的骨小梁数和骨小梁连接度显著降低,骨小梁分离度则显著升高。使用维生素D治疗后,显著降低了小鼠的骨小梁分离度并提高了骨小梁数。而与模型组相比,益生菌膳食复配组合干预后,同样起到了显著降低了小鼠的骨小梁分离度并提高了骨小梁数的治疗效果。
A-每mm骨小梁数;B-骨小梁厚度;C-骨小梁分离度;D-每mm3骨小梁连接度
图5 益生菌与膳食因子复配组合干预对骨质疏松小鼠骨小梁的影响
Fig.5 The effect of combined intervention of probiotics and dietary factors on bone trabeculae in osteoporotic mice
由此可见,益生菌膳食复配组合可显著提高骨质疏松小鼠的总骨密度、皮质骨密度、股骨远端骨小梁骨密度、骨小梁厚度、骨小梁数量、骨小梁连接度、骨表面积、骨体积和骨体积分数骨体积分数,同时,显著降低骨质疏松小鼠的骨小梁分离度。结果表明,益生菌膳食复配组合干预具有与维生素D相同的缓解骨质疏松的功效,且效果更好。
2.4 骨代谢相关基因
由图6可知,与空白组相比,骨质疏松小鼠的RANKL和NF-κB通路表达水平显著提高,说明骨质疏松小鼠的骨代谢活动更加活跃,且骨骼附近存在炎症反应。使用维生素D治疗后,显著降低了小鼠RANKL和NF-κB通路表达水平。而与模型组相比,益生菌膳食复配组合干预同样显著降低了小鼠的RANKL和NF-κB通路表达水平。
A-GADPH;B-RANKL;C-NF-κB
图6 益生菌与膳食因子复配组合干预对骨质疏松小鼠内参基因、骨代谢基因和炎症反应基因表达水平的影响
Fig.6 The effect of a combination of probiotics and dietary factors intervention on the expression levels of internal reference genes, bone metabolism genes, and inflammatory response genes in osteoporotic mice
由图7可知,与空白组相比,骨质疏松小鼠的骨生成基因通路(VDR、Wnt10b、OPG、β-catenin、Osterix和Runx2)表达水平显著降低,包括维生素D受体基因、骨钙素基因等,说明骨质疏松小鼠的骨生成相关活动受到抑制。使用维生素D治疗后,显著提高了小鼠VDR、Wnt10b、OPG、β-catenin和Runx2通路表达水平,这可能是因为维生素D补充后直接激动了VDR,导致后续一系列的转录调控。而与模型组相比,益生菌膳食复配组合干预同样显著提高了小鼠的Wnt10b、β-catenin和Runx2通路表达水平,VDR、OPG和Osterix通路表达水平也有所提高,但并不显著。
A-VDR;B-OPG;C-Osterix;D-β-catenin;E-Wnt10b;F-Runx2
图7 益生菌与膳食因子复配组合干预对骨质疏松小鼠骨生成基因通路表达水平的影响
Fig.7 The effect of combination intervention of probiotics and dietary factors on the expression level of osteogenesis gene pathway in osteoporosis mice
总体看来,益生菌膳食复配组合起到了提高骨生成相关基因表达(VDR、Wnt10b、OPG、Osterix、β-catenin和Runx2),降低骨代谢基因表达(RANKL),并抑制炎症反应(NF-κB)的作用,且治疗效果与维生素D相当。这在一定程度上解释了益生菌膳食复配组合提高维生素D生理活性功能并缓解骨质疏松的作用机制。
3 结论与讨论
RA是一种维生素A的衍生物,它可以抑制骨形成并促进骨吸收。通过给予小鼠一定剂量的RA,可以模拟骨质疏松的病理过程,导致骨密度降低和骨组织改变。该模型已经在许多研究中得到广泛应用,具有较高的可重复性和稳定性。当模型组小鼠的血清钙、磷、AKP水平显著高于空白组时,则证明骨流失严重,骨质疏松模型造模成功。血清Ca2+水平异常增多说明骨骼储钙能力下降,钙流失严重,骨骼健康状况不佳,骨代谢增多,是骨质疏松的标志。骨骼疾病如佝偻病、软骨病、骨恶性肿瘤、恶性肿瘤骨转移等会导致AKP水平异常升高。OCN又名骨-羟基谷氨酸蛋白,是骨非胶原型蛋白的主要成分,是骨组织的特异性蛋白,是成骨细胞产生和分泌的一种激素样多肽。目前认为血清中的OCN是反映成骨细胞功能的生化标志物,成骨细胞合成的骨钙素大约有20%释放入血,血清OCN和骨组织OCN呈正相关,因此,血中的OCN测定可以反映成骨细胞的功能状态。PINP的表达水平反映了新骨的形成,当造骨细胞合成减少时,反映新合成的Ⅰ型胶原蛋白变化的PINP水平就下降。
本实验设计了一种由青春双歧杆菌、长双歧杆菌、姜黄素和低聚半乳糖组成的益生菌膳食复配组合,其具有提高维生素D代谢产物水平的能力和缓解骨质疏松症状的潜力。通过RA建立骨质疏松小鼠模型。从骨密度、骨小梁分离度和骨体积分数等骨结构指标和血清AKP和血清Ca2+等血清骨生化指标,探讨了益生菌膳食复配组合对小鼠骨质疏松症状的改善作用。并通过检测小鼠血清中维生素D代谢产物水平和骨生成代谢相关通路基因表达对益生菌膳食复配组合的作用机制进行了初步探索。结果发现益生菌膳食复配组合能够显著提高骨质疏松小鼠的总骨密度、皮质骨密度、股骨远端骨小梁骨密度、骨小梁厚度、骨小梁数量、骨小梁连接度、骨表面积、骨体积和骨体积分数,同时,显著降低骨质疏松小鼠的骨小梁分离度。提高骨质疏松小鼠血清中维生素D代谢产物25(OH)D和1,25(OH)2D的含量,降低骨质疏松小鼠血清中血清Ca2+和AKP的含量,提高血清中OCN和PINP的水平。以上结果表明,此益生菌膳食复配组合起到了缓解骨钙流失,维持骨骼健康,修复骨骼损伤,增加成骨细胞,降低骨质疏松程度的作用。
对于益生菌膳食复配组合对RA诱导的骨质疏松小鼠的缓解作用,本研究认为主要有以下原因。首先,维生素D对骨骼和钙质吸收有重要的作用,能帮助人们将肠道中的钙吸收到血液中,同时引导血液中的钙到骨骼中。尤其对于缺钙的儿童和中老年患者有更好的作用,维生素D可以防止成骨细胞中的钙过度流失,避免骨质疏松的发生以及儿童骨骼生长发育障碍。许多研究表明,肠道微生物群改变了肠道维生素D代谢,益生菌补充剂可以影响循环维生素D水平[18]。这些发现具有重大的临床意义,因为多项大型流行病学研究表明,血清维生素D水平低的人患多种不良健康后果的风险增加,包括骨质疏松症、肥胖、炎症性肠病、糖尿病、心血管疾病、癌症和自身免疫性疾病。然而,迄今为止最大的针对25 000名成年人随机临床试验表明,服用维生素D补充剂对健康结果没有影响,包括心脏病、癌症、跌倒风险甚至骨骼健康[19-22]。研究发现,个体对维生素D3补充剂的反应程度不同,可区分为高、中、低反应者。在维生素D靶基因调控和其他维生素D触发的分子参数水平上,约25%的受访群体显示为低反应者[23-26]。这一发现意味着,低反应者每日所需维生素D3补充剂剂量要高于基于人群的建议和指南所建议的剂量。与补充维生素D相比,身体将其代谢成活性形式的能力同样重要。
益生菌膳食复配组合提高了维生素D的代谢产物25(OH)D和1,25(OH)2D水平。在临床上,评估维生素D是否缺乏的指标是血液中25(OH)D水平,包括25羟基维生素D3和25羟基维生素D2的水平[27-29]。维生素D的活化率由1,25(OH)2D、25(OH)D决定,可用来计算维生素D的代谢通量和活化水平。临床通过测定1,25(OH)2D的水平来了解代谢性骨病时活性维生素D的水平。人体特定肠道微生物具有代谢维生素D的能力,血液中维生素D活性形式1,25(OH)2D水平与特定的肠道微生物,如卵形布劳特氏菌、瘤胃球菌等相关[30]。因此,肠道菌群可能决定了维生素D的生物利用率。这些研究表明肠道细菌在人体维生素D的生物利用率方面起到重要的作用,提示可以通过调节患者体内的肠道菌群以达到提高维生素D生理活性以维持骨骼健康的目的。
维生素D活性形式1,25(OH)2D是VDR的直接激动剂,而VDR广泛存在于人体的各个器官部位,使得1,25(OH)2D具有多方面重要的作用。当维生素D代谢产物1,25(OH)2D进入细胞后,它会结合到VDR上,形成1,25(OH)2D-VDR复合物。这个复合物可以进入细胞核,结合到维生素D反应元件上,从而调控一系列基因的转录[31]。1,25(OH)2D-VDR复合物可以激活多个基因,如调节NFE2L2基因减轻氧化应激、钙离子通道基因(如TRPV6)、钙结合蛋白基因(如calbindin-D28k)、甲状旁腺激素和成纤维细胞生长因子23等。这些基因的激活促进肠道对钙和磷的吸收,增加体内钙和磷的可利用性,提高活性维生素D水平,有助于骨骼健康。1,25(OH)2D-VDR复合物也可以激活多个与骨形成相关的基因,如骨钙素基因和骨细胞素基因[32]。这些基因的激活促进骨形成细胞的活动和骨基质的合成,从而增加骨骼的密度和强度。同时,1,25(OH)2D-VDR复合物还可以抑制骨吸收相关基因的表达,如破骨细胞分化因子基因和破骨细胞生成素基因。这些基因的抑制减少了破骨细胞的形成和活化,从而降低了骨骼中的骨质破坏。1,25(OH)2D-VDR复合物还可以调节细胞凋亡和炎症相关基因的表达,如Bcl-2、NF-κB等[33],1,25(OH)2D的抗炎作用可能有助于减轻炎症对骨骼的损害,并减少骨质疏松症状的发展。
1,25(OH)2D不仅是维持骨骼健康的重要活性维生素,近年来还发现其对细胞的增殖、分化以及对免疫系统都有重要的作用[34],已开始作为一种新的免疫调节激素应用于临床。因为1,25(OH)2D同样是免疫调节的重要激素,所以与VDR在全身多个部位的表达相同,活化维生素D并产生1,25(OH)2D的1α羟化酶(CYP27B1)也在除了肾脏之外的多个部位被发现。已证实胎盘、单核细胞、巨噬细胞、肿瘤细胞上清液、结节病患者淋巴结和角朊细胞均存在1α羟化酶而能产生钙三醇[35-36]。结肠上皮细胞中同样检测到CYP27B1的表达。考虑到1,25(OH)2D在骨骼健康、免疫调节和细胞分化等多方面的作用和CYP27B1以及VDR在结肠部位的表达,肠道屏障与维生素D生理活性功能或许有着更深层次的联系。这解释了复配组合可能是通过影响肠道菌群从肠道提高维生素D代谢产物水平。
总体来说,本研究表明由青春双歧杆菌、长双歧杆菌、姜黄素和低聚半乳糖组成的益生菌膳食复配组合综合了益生菌和膳食因子的优点,可通过提高宿主体内维生素D代谢产物水平,以发挥维生素D生理活性功能并缓解RA诱导的小鼠骨质疏松症。益生菌和膳食因子协同复配后,其在小鼠的骨密度、骨小梁、骨体积、血清Ca2+、AKP、OCN、PINP、骨生成基因、骨代谢基因和炎症反应等指标上都有更全面和显著的改善效果,且与维生素D治疗效果相当。以上结果表明,此益生菌膳食复配组合起到了缓解骨钙流失,维持骨骼健康,修复骨骼损伤,增加成骨细胞,降低骨质疏松程度的作用,为开发预防骨质疏松的有效膳食干预方案提供了新的思路。
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