大肠杆菌(Escherichia coli)作为一种广泛存在于环境和动物肠道中的革兰氏阴性菌,是食品污染的重要来源,部分血清型易引发食源性疾病[1]。热杀菌是控制食品中大肠杆菌最常用且有效的技术手段。大量食品安全事故调查显示,食用未充分加热的肉类制品(如未熟透的肉馅、汉堡等)是感染致病性大肠杆菌的主要途径之一。然而,为最大程度保留食品的营养价值与感官品质,部分食品行业也会采用温和的加热方式(45～60 ℃)[2],如五分熟牛排的中心温度约为55 ℃。值得注意的是,肉类本身pH通常呈酸性(以牛肉为例,pH值为5.4～5.8)[3]。而研究表明,经历酸性pH环境(酸适应)的大肠杆菌,其抵抗后续环境适应(包括热适应)的能力会显著增强,即产生交叉保护效应[4]。这使得在温和热处理条件下,存活于酸性食品基质中的大肠杆菌可能难以被彻底杀灭,构成潜在的食品安全风险。
鉴于消费者对化学合成防腐剂安全性的担忧,天然来源的抑菌剂正日益成为食品保鲜领域的研究与应用热点[5]。二氢槲皮素(dihydroquercetin,DHQ),也称为花旗松素、紫杉叶素,是一种天然的黄酮醇类化合物,具有抗氧化、抗菌和抗炎等多种效果[6]。研究表明DHQ对大肠杆菌、铜绿假单胞菌和肺炎克雷伯菌等多种病原菌具有体外抑制活性[7]。GONZ
LEZ等[8]筛选了1 120种美国食品药品监督管理局批准的物质,发现天然黄酮类化合物可以靶向抑制反应调节因子HsrA的体外DNA结合活性,该研究结果支持了黄酮类化合物作为新型抗菌策略的宝贵潜力。2021年,国家卫生健康委员会正式批准DHQ作为新食品原料,推荐用量为≤100 mg/d,为其在食品工业中的应用提供了保障。然而,目前关于DHQ对食源性致病菌,特别是对处于酸适应等复杂适应环境下耐热性等生理特性的影响,尚缺乏深入系统的研究。
因此,本研究以大肠杆菌为研究对象,模拟肉品加工中的酸适应环境,探究DHQ处理对大肠杆菌耐热性的影响;并进一步通过转录组测序技术,从分子水平解析DHQ干预下大肠杆菌关键通路和耐热相关基因的变化,以期为天然抑菌剂作为热杀菌增效剂的应用潜力提供重要的理论依据和科学支撑。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
DHQ(HPLC≥98%),上海融禾医药科技发展有限公司;大肠杆菌O157:H7标准菌株ATCC 700728,中国工业微生物菌种保藏管理中心。
LB肉汤、LB琼脂,北京陆桥技术股份有限公司;食品级乳酸,河南金丹乳酸科技股份有限公司;二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)、溶菌酶(100 mg/mL),北京索莱宝科技有限公司;氯化钠、乙醇,国药集团化学试剂有限公司;DEPC处理水、1×PBS(pH 7.2～7.4),北京酷来搏科技有限公司;SteadyPure通用型RNA提取试剂盒、Evo M-MLV反转录预混型试剂盒、SYBR Green Pro Taq HS预混型qPCR试剂盒,湖南艾科瑞生物工程有限公司。
1.2 仪器与设备
TH2-312台式恒温振荡器,上海精宏实验设备有限公司;SW-CJ-IF型单人双面净化工作台,苏州净化设备有限公司;FA1004电子天平,上海舜宇恒平科学仪器有限公司;EX800酶标仪,美国伯腾仪器有限公司;VORTEX 1涡旋混匀器,艾卡(广州)仪器设备有限公司;5424R离心机,德国Eppendorf公司;SPX-150B-Z生化培养箱,上海博迅实业有限公司医疗设备厂;DZW-S-4电热恒温水浴锅,北京市永光明医疗仪器有限公司;NANODROP ONE超微型紫外分光光度计,基因有限公司;GE4852T基因扩增仪,杭州柏恒科技有限公司;CFX96荧光定量PCR仪,美国BIO-RAD公司。
1.3 实验方法
1.3.1 菌株的活化
取10 μL冻存于-80 ℃的大肠杆菌接种至灭菌后的10 mL LB肉汤培养基中,在37 ℃、180 r/min条件下过夜培养18 h,将活化后的菌液用于后续实验。
1.3.2 最小抑菌浓度(minmum inhibitory concentration,MIC)测定
采用二倍稀释法测定DHQ的MIC[9]。将DHQ溶液用DMSO溶解后通过LB培养基二倍稀释,使其质量浓度分别稀释为:5 000、2 500、1 250、625、312.5 μg/mL,各取100 μL加入96孔板,并在96孔板各孔中加入100 μL浓度为105 CFU/mL的菌液,使得最终各孔中DHQ的质量浓度分别为:2 500、1 250、625、312.5、156.25 μg/mL。同时设置阴性对照和阳性对照。置于37 ℃培养24 h后观察结果,与阴性对照孔相比,无可见浑浊即为抑制。MIC为能够显著抑制细菌生长的最小浓度。该实验进行3次重复。
1.3.3 不同抑菌浓度的DHQ对大肠杆菌的酸适应处理
将装有10 mL pH值为7.0的LB肉汤培养基设为对照组,乳酸调节pH值为5.6的10 mL LB肉汤培养基设为酸适应组,并在此基础上分别添加浓度为0、0.5 MIC和MIC的DHQ。分别取10 μL活化后的菌液加入以上处理组(共计pH 7.0、pH 7.0+0.5 MIC DHQ、pH 7.0+MIC DHQ、pH 5.6、pH 5.6+0.5 MIC DHQ、pH 5.6+MIC DHQ 6个处理组),在37 ℃、180 r/min过夜培养18 h用于后续研究。该实验进行3次重复。
1.3.4 大肠杆菌耐热能力测定
耐热能力测定参考MA等[10]的方法,将1.3.3节培养后的6组菌液各取1 mL离心(4 ℃、8 500 r/min、10 min),倒掉液体。分别将菌体沉淀加入到10 mL预热至55 ℃的LB肉汤培养基中,并于55 ℃水浴锅内处理30 min,在第0、10、20、30 min分别吸取100 μL菌液梯度稀释并涂布于LB琼脂培养皿中37 ℃培养24 h,进行平板计数并计算大肠杆菌的耐热能力。用D值表示高温适应下大肠杆菌的耐热能力。D值为将热激不同时间的菌落对数值进行线性拟合后,取斜率的负倒数,单位用min表示。D值越大,表示细菌的耐热能力越强。该实验进行3次重复。
1.3.5 荧光定量PCR
1.3.5.1 RNA的提取
参照SteadyPure通用型RNA提取试剂盒说明书,提取不同处理组的RNA,菌液初始浓度约为7 lg CFU/mL。使用Evo M-MLV反转录预混型试剂盒将提取的RNA取1 000 ng进行反转录,放置-20 ℃保存备用。将反转录得到的cDNA使用SYBR Green Pro Taq HS预混型qPCR试剂盒进行荧光定量PCR,并按照两步法进行qPCR扩增。根据NCBI数据库查找大肠杆菌基因组序列,使用16S rRNA为内参基因,用2-ΔΔCt计算目的基因的相对表达量。本研究所涉及的基因有16S rRNA、rpoH、dnaK、grpE和clpB。各基因的引物序列如表1所示,均由湖南艾科瑞生物工程有限公司合成。进行定量分析之前首先测定内参基因和目的基因的标准曲线,确定其扩增效率为90%～110%,相关系数大于0.980。
表1 qRT-PCR基因及引物序列
Table 1 Genes and primer sequences for the real-time PCR
基因ID/登录号基因名称引物名称引物序列(5′-3′)MT215717.116S rRNA16S rRNA-FGAGAGCAAGCGGACCTCATAA16S rRNA-RTGGCATTCTGATCCACGATTACT915834rpoHrpoH-FTTCCGACGACGATTCCGACAGrpoH-RCTGCCTGCTCTTCCCAGTTATCAT913406dnaKdnaK-FGGTGGTGTTCTGACTGGTGACdnaK-RCTGTGCTTGGTCGGGATAGTG914812grpEgrpE-FTGCTGGATGTTGTGCGTAAGTgrpE-RCCACCATTGCGATAGCCTGAT914865clpBclpB-FAGCGGTTGATGCGGTATCTAAclpB-RCGAGGAACAGGAATGAACCAATC
1.4 数据处理与统计分析
实验数据采用SPSS 25.0软件的ANOVA法进行双因素分析,双因素分别为酸适应处理和DHQ处理。qRT-PCR基因表达的数据使用Bio-Rad CFX Manager 2.1软件进行相对定量分析。实验均进行3次重复,数据以“平均值±标准差”表示,差异显著水平为P<0.05。使用Sigmaplot 12.0软件作图。
2 结果与分析
2.1 DHQ对大肠杆菌的MIC
由表2可知,DHQ质量浓度为312.5 μg/mL时对大肠杆菌没有抑菌效果,而在质量浓度为625 μg/mL时有抑菌效果,由此确定DHQ对大肠杆菌的MIC为625 μg/mL。这与蔡瑾等[11]研究结果一致,当DHQ质量浓度为625 μg/mL时,培养基肉眼可见的清澈,没有细菌生长。选择MIC和0.5 MIC浓度的DHQ进行后续研究。
表2 DHQ对大肠杆菌MIC的测定
Table 2 Minmum inhibitory concentration of DHQ against E.coli
菌种质量浓度/(μg/mL)2 5001 250625312.5156.2578.125阴性对照阳性对照大肠杆菌O157:H7---+++-+
注：-表示有抑菌效果,+表示无抑菌效果。
2.2 DHQ对酸适应大肠杆菌耐热性的影响
由图1可知,对照组大肠杆菌经55 ℃热处理后,D值为12.75 min。相应拟合曲线如电子版增强出版附图1(https://doi.org/10.13995/j.cnki.11-1802/ts.044194,下同)所示。D值是指在特定条件下,细菌数量减少90%所用的时间,D值越大,表示耐受能力越强。经酸适应处理后,大肠杆菌D值增加(P<0.05),表明大肠杆菌耐热能力增强。酸适应可提高大肠杆菌的耐热性,先前的研究表明酸适应后大肠杆菌的耐热性D值提高,双组分调控系统phoP基因缺失后耐热性D值降低[12]。未经过适应的大肠杆菌O157:H7在58、62、65 ℃下的D值分别为10.59、1.38、0.75 min;经含1%葡萄糖的培养基酸适应后,D值分别提高为22.46、3.58、1.02 min[13]。HABERBECK等[14]学者的研究也表明,大肠杆菌和大肠杆菌O157:H7经盐酸调节pH值为5.5的培养基过夜适应后,与未适应处理组相比,在面对58 ℃时具有更强的抵抗力。而在大肠杆菌培养过程中添加0.5 MIC和MIC浓度的DHQ均可以降低大肠杆菌的D值,且浓度越高抑制效果越好。MIC浓度的DHQ可分别将对照组大肠杆菌的D值由12.75 min降至9.92 min,将酸适应处理组大肠杆菌的D值由14.27 min降至10.46 min。因此,选择添加MIC的DHQ开展后续的RNA-seq研究。
图1 不同浓度的DHQ对大肠杆菌耐热性的影响
Fig.1 Effects of varying DHQ concentrations on thermal tolerance of E.coli
注:a～c:表示同一适应条件下不同浓度DHQ之间差异显著(P<0.05);x～y:表示同一浓度条件下不同适应之间差异显著(P<0.05)(下同)。
2.3 RNA-seq样本测序数据质量汇总
用于RNA-seq的原始数据经过过滤、检查测序错误率和GC含量分布后获得用于分析使用的数据汇总如表3所示。将所有处理组的原始序列过滤后,得到的结果序列是原始序列的97.99%～98.37%,错配率为0.01%。Q20与Q30分别表示碱基错误识别率为1%和0.1%,通常选取Q30为评价碱基质量的标准,Q30的值越大,表示结果越好。此次结果质量值≥30的碱基所占比为96.30%～97.40%,GC含量为52.17%～52.40%。
表3 样本测序数据质量评估
Table 3 Quality evaluation of sample sequencing data
样本名称原始序列过滤后序列过滤后碱基数错配率/%Q20/%Q30/%GC含量/%对照组778543076376981.1 G0.0199.0796.4152.23对照组-MIC774377276177261.1 G0.0199.2697.4052.40酸适应组785859677094301.2 G0.0199.0296.3652.17酸适应组-MIC786985277112801.2 G0.0199.0396.3052.77
2.4 处理组间相关性分析
图2-a所示为不同处理组间基因表达的Pearson相关系数热图。相关系数与1越接近,表明样本之间的相似度越高。与未经适应的对照组相比,酸适应后的R2为0.926,DHQ处理后的R2为0.902;而DHQ处理后的酸适应组R2为0.809,表明基因表达模式发生了相对较大的改变,导致与原样本相关性降低,后续不同处理组间基因的相对表达量也证实了这一结果。对各处理组间的差异基因进行聚类分析,红色表示高表达基因,蓝色表示低表达基因,将表达模式相近的基因聚类在一起。由图2-b可知,经酸适应和DHQ处理的样品的低表达量基因占比较高。
a-Pearson相关系数热图;b-差异基因聚类分析
图2 不同处理组间的相关性分析
Fig.2 Correlation analysis between different treatment groups
2.5 差异表达基因的KEGG富集分析
图3为大肠杆菌经酸适应以及DHQ处理后差异表达基因(differentially expressed genes,DEGs)的富集分析图。与未经酸适应处理组相比(图3-a),经酸适应后大肠杆菌的DEGs主要富集于精氨酸等氨基酸的生物合成、阳离子抗菌肽耐药性、群体感应、氧化磷酸化以及多种氨基酸代谢。精氨酸等氨基酸的生物合成可消耗细胞内的H+,维持胞质pH稳定,是细菌应对酸适应的经典机制[15]。除氨基酸的生物合成外,氨基酸的分解代谢以及氧化磷酸化可为细菌提供能量,支持其在适应环境中的生存[16]。与此同时,群体感应是微生物通过化学信号实现相互交流的通信系统,可提高细菌在复杂环境中的适应和生存能力[17]。酸适应可能诱导细菌通过群体感应协同调控基因表达,增强群体对逆境的耐受能力。这与经酸适应后大肠杆菌耐热能力增强的结果趋势一致。
a-酸适应组vs对照组;b-对照组-MIC vs对照组;c-酸适应组-MIC vs酸适应组;d-酸适应组-MIC vs对照组-MIC
图3 差异表达基因的KEGG富集分析
Fig.3 The KEGG enrichment analysis of differentially expressed genes
对照组大肠杆菌加入DHQ后(图3-b),可影响大肠杆菌的三羧酸循环、氧化磷酸化、碳代谢、ABC转运蛋白、双组分系统和氨基酸代谢。三羧酸循环是糖类、脂类和氨基酸的最终代谢通路,也是这三大营养素关联的枢纽。碳代谢对细菌的存活至关重要,该过程可提供能量,合成前体物质,并使细菌适应不同的环境条件。ABC转运蛋白作为最大的跨膜蛋白,可以利用ATP水解产生的能量转运氨基酸和肽类等营养物质[18]。双组分系统由组氨酸激酶和反应调节蛋白构成,前者属于跨膜受体蛋白,是细菌感知外界环境信号并进行自磷酸化后调控下游基因表达的重要途经[19]。该结果表明DHQ可影响大肠杆菌的能量代谢和跨膜蛋白,如ABC转运蛋白和双组分系统。大肠杆菌中存在PhoP/PhoQ、PmrB/PmrA、EvgA/EvgS和RstA/RstB等多个双组分调控系统,DHQ对其具体的影响机制还需进一步明确。
酸适应的同时加入MIC的DHQ(图3-c)可影响大肠杆菌的ABC转运蛋白、氨基酸代谢和降解、群体感应、戊糖磷酸途径、阳离子抗菌肽耐药性和脂肪酸代谢。戊糖磷酸途径则影响细胞的生长状态,可产生生物合成所需要的还原型辅酶Ⅱ。阳离子抗菌肽可通过静电相互作用破坏膜结构,脂肪酸则是细胞膜组成的重要成分。以上结果表明,酸适应下活跃的氨基酸代谢可被DHQ干扰,并进一步破坏膜结构稳定性影响大肠杆菌在不利环境中的生存能力。研究表明,酸适应过程中加入0.5 MIC的牛至精油可通过扰乱沙门氏菌膜蛋白的信号感应系统并抑耐热等抗逆基因的表达显著降低沙门氏菌的耐热能力[20]。
经酸适应的DHQ处理组与未经酸适应的DHQ处理组相比(图3-d),DEGs主要富集于ABC转运蛋白、脂肪酸降解、氨基酸降解、氨基酸代谢、群体感应和氧化磷酸化。在酸适应和DHQ的双重压力下,酸适应需要氨基酸代谢参与pH调节,而DHQ加剧氨基酸代谢紊乱,导致大肠杆菌更需要获取能量。DHQ的加入影响了细菌应对酸适应的适应性。
以上研究结果表明,大肠杆菌可通过调节氨基酸代谢(尤其是精氨酸代谢)、阳离子抗菌肽耐药性、能量代谢和群体感应应对酸适应环境。DHQ主要通过影响能量代谢(三羧酸循环、氧化磷酸化)、碳代谢和氨基酸代谢,干扰大肠杆菌的能量供应发挥作用。在酸适应与DHQ的双重作用下,大肠杆菌的ABC转运蛋白、氨基酸代谢、脂肪酸代谢和群体感应等通路进一步被干扰,体现酸适应加剧了DHQ对细胞膜稳定性和代谢系统的影响,而DHQ则影响了细菌应对酸适应的适应性机制(如氨基酸介导的pH调节)。
2.6 耐热相关基因的相对表达量
图4结果显示,酸适应条件下与耐热相关的rpoH基因的相对表达量显著升高;dnaK、grpE和clpB的表达量降低。rpoH是热休克σ因子,可调控下游热休克蛋白的合成。热休克蛋白是一组特征明确且进化保守的蛋白质,可监测并维持蛋白质组的构象,一些热休克蛋白充当伴侣蛋白,可促进蛋白质的正确折叠,而另一些充当蛋白酶,降解未折叠的蛋白质[21]。当大肠杆菌的培养温度由30 ℃上升到42 ℃时,会产生热应激反应,诱导相关基因的表达,并大量合成热休克蛋白[22]。42 ℃以上的高温还会诱导沙门氏菌中rpoH的转录和翻译,而rpoH又可以指导30多种热休克蛋白的转录,这些蛋白可以参与变性蛋白的重新折叠并降解折叠错误的蛋白质[23]。热休克蛋白DnaK和GrpE均是提高大肠杆菌耐热性所必须的[24]。无论是在中性还是酸适应条件下,DHQ处理组的4个耐热相关基因的相对表达量均显著低于同期对照组,这与表观的DHQ处理后大肠杆菌耐热性D值降低的结果一致。该结果表明DHQ可通过降低耐热相关基因的相对表达量进一步削弱大肠杆菌的环境适应能力。热休克系统是细菌应对多重适应的核心机制,DHQ通过抑制该系统,可增强热处理对大肠杆菌的杀伤效果,这为开发联合抗菌措施(如DHQ与酸联用)提供了理论依据。
a-rpoH;b-dnaK;c-grpE;d-clpB
图4 耐热相关基因rpoH、grpE、dnaK和clpB的相对表达量
Fig.4 The relative expression levels of heat resistance-related genes rpoH, grpE, dnaK, and clpB
3 结论
酸适应可提高大肠杆菌的耐热性D值,而DHQ处理可降低其耐热能力,其中MIC的DHQ效果最显著。酸适应通过激活氨基酸代谢(如精氨酸生物合成)、群体感应、氧化磷酸化等通路增强耐热性,而DHQ主要干扰能量代谢(三羧酸循环、氧化磷酸化)、碳代谢及双组分系统,并进一步加剧酸适应条件下的氨基酸代谢紊乱和膜结构稳定性破坏。此外,DHQ可通过降低耐热相关基因rpoH、dnaK、grpE和clpB的表达量降低大肠杆菌的耐热能力。综上,DHQ的使用可削弱酸适应大肠杆菌的耐热性,为其作为天然热杀菌增效剂在食品工业中的应用提供了理论依据。
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