鼠李糖脂(rhamnolipid,RLs)是一种糖脂类生物表面活性剂,其分子结构包含1～2个鼠李糖残基亲水端和不同链长的羟基脂肪酸链组成的疏水端。RLs的类型主要分为Rhl-Cx、Rhl-Cx-Cy、Rhl-Rhl-Cx以及Rhl-Rhl-Cx-Cy等几类(Rhl代表鼠李糖残基,x和y通常为8～14的碳原子数)[1]。与大多数表面活性剂相似,RLs表现出极强的界面活性,结构种类丰富多样,并且具备环境友好、易生物降解等优势特性。其主要功能包括显著降低油-水或气-液界面张力、强效去污、乳化与絮凝等。此外,其生物降解性好且无明显毒性,在石油工业、化妆品生产以及环境污染修复领域具有广阔的应用前景。
RLs的合成主要包括化学合成、酶法合成和生物合成。化学合成法通过多步有机反应构建糖苷键和酯键,虽能精确控制结构,但步骤繁琐、收率低(<5%)、成本高且环保性差,难以规模化。酶法合成利用糖基转移酶或脂肪酶催化反应,条件温和、选择性高,可避免化学合成的毒性问题,但依赖昂贵的辅因子(如TDP-鼠李糖),酶稳定性不足,目前仅适用于实验室小规模制备。生物合成法通过微生物发酵直接生产,成本低、易规模化且绿色环保,是工业主流方法。因此,利用生物合成法工业化生产RLs受到了广泛关注。
天然状态下,RLs主要由铜绿假单胞杆菌(Pseudomonas aeruginosa)合成,常见的结构类型包括Rha-Rha-C10-C10、Rha-Rha-C10、Rha-C10-C10以及Rha-C10,其中Rha-Rha-C10-C10最为普遍[1-2]。目前,RLs的已知结构有60多种,其主要原因可能是鼠李糖基转移酶(rhamnosyltransferase,RhlA)的作用,如图1所示,通过影响rhlA基因的转录水平,可以直接影响到RLs的结构。
图1 RLs的合成路径
Fig.1 The synthetic pathway of RLs
P.aeruginosa的条件致病性极大限制了RLs在食品和化妆品等高安全性要求领域的应用。目前也利用了常用的异源宿主如大肠杆菌(Escherichia coli)和恶臭假单胞菌属(Pseudomonas putida)进行异源生物合成RLs[3],RLs的合成产量分别为0.64 g/L和0.94～14.2 g/L,结构也多以Rha-C8-C10和Rha-C10-C12为主。由于Pseudomonas putidas是一种致病菌,很难进行工业发酵放大;E. coli含有内毒素,在后期下游分离纯化需增加一步脱出内毒素的工艺流程,导致分离纯化成本占据了生产成本的一半以上;而毕赤酵母(Pichia pastoris)是一种安全的工业菌株,也不需要脱除内毒素等复杂的纯化工艺流程,含有强启动子以及可进行高密度发酵,满足工业化需求。
随着RLs合成途径[4-5]的解析,研究人员还开发了不同宿主及遗传改造策略生产出多种结构类型的RLs。例如,在P.aeruginosa PA14中,过表达rhlAB-R[6]操纵子和RhlA酶进行半理性进化改造(R202K突变)[7]后,产生链长C8-C14和C10-C14等多种脂肪酸链组合的RLs;在E.coli BL21中,共表达rhlABC操纵子与rfbD基因[8],可生成以Rha-C8-C10和Rha-C10-C12为主的RLs;在P.putida KT2440宿主中构建启动子文库[9]后,主要合成链长为C10-C10的RLs;而泰国伯克霍尔德菌(Burkholderia thailandensis)E264在经过群体感应系统的基因缺失或scmR基因敲除[10]后,可合成多种具有不同脂肪酸链长度组合的RLs结构。
但目前尚未有文献报道利用毕赤酵母(Pichia pastoris)来合成RLs。P.pastoris是目前工业生物技术领域用以蛋白表达和生物催化的常用宿主之一,具有表达强度高、翻译后修饰能力强、细胞密度高等优点。因此,本研究首次研究了P.pastoris合成RLs的潜力,拟利用P.pastoris GS115作为宿主,通过异源表达rmlABCD和rhlAB基因进行RLs合成。
为进一步通过基因工程策略提升RLs合成量和结构,本论文拟利用毕赤酵母自带的强效启动子,包括诱导型启动子PAOX和组成型启动子PGAP [11-12],以及不同表达盒的设计方案,能够精确调控RLs合成相关酶的表达强度,从而显著提高合成RLs的产量和结构多样性。
单RLs因其结构差异展现出多领域应用潜力。短链结构(如Rha-C8-C10)具较高临界胶束浓度(critical micelle concentration,CMC),适合作为食品乳化剂[13];长链结构(如Rha-C12-C14)乳化性能更优,更适用于稳定油-水体系[14]。在医药领域[15],不饱和结构(如Rha-C10∶1-C10∶1)具有出色的抗菌和抗生物膜活性,可有效用于敷料等抗感染材料。农业[16]方面,饱和中链结构(如Rha-C10-C10)对多种植物病原菌具有高效杀菌作用,IC50值<5 mg/L,具备开发为绿色生物农药的潜力。在环境修复[17]中,长链结构可高效增溶烃类污染物,形成稳定乳化体系并被微生物降解,适用于石油污染治理。因此,针对不同结构的单RLs进行定向合成,将有望满足食品、医药、农业与环境工程中的定制化应用需求。
本研究以毕赤酵母GS115为宿主,表达RLs合成通路的关键基因簇rhlAB和rmlABCD,探讨了在诱导型和组成型启动子条件下对RLs合成的影响。实验结果明确证实了毕赤酵母作为异源宿主生产RLs的可行性,并为今后RLs工业化生产奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
培养基:LB培养基(g/L)(蛋白胨10,酵母提取物5,NaCl 10);YPD培养基(g/L)(酵母提取物10、蛋白胨20、无水葡萄糖20);缓冲甘油复合培养基(buffered glycerol-complex medium,BMGY)(g/L)[甘油10,酵母提取物10,蛋白胨20,酵母氮源基础(yeast nitrogen base,YNB) 13.4,K3PO4缓冲液100 mmol/L,(NH4)2SO4 5和400 μg/L生物素,pH 6.0];缓冲甲醇复合培养基(buffered methanol-complex medium,BMMY)(g/L)[甲醇10,酵母提取物10,蛋白胨20,YNB 13.4,K3PO4缓冲液100 mmol/L,(NH4)2SO4 5和400 μg/L生物素,pH 6.0]。固体培养基添加质量浓度为20 g/L的琼脂粉。
试剂:蛋白胨、酵母粉,英国Oxoid公司;甲醇、无水葡萄糖、NaCl、KH2PO4、K2HPO4、D-山梨醇,国药集团化学试剂有限公司;博来霉素、YNB,北京索莱宝生物工程有限公司;一步克隆和胶回收试剂盒,南京诺唯赞生物科技股份有限公司;质粒小提试剂盒,北京天根生化科技公司。
菌株:P.pastoris GS115为实验宿主菌株,E.coli JM109用于质粒的构建。
质粒:pPICZ A和pGAPZ A载体质粒。
本研究中所使用的基因和引物如电子版增强出版附表1所示(https://doi.org/10.13995/j.cnki.11-1802/ts.043904,下同)。
表1 本研究中构建的RLs合成菌株
Table 1 The RLs synthetic strain constructed in this study
启动子菌株名基因型质粒RLs结构PGAPHW001GS115/pGAPZ A-rmlABCD-rhlABpGAPZ ARha-C10, Rha-C10-C10, Rha-C10-C12∶1HW002GS115/pGAPZ A-rmlABCD/pGAPZAMH-rhlABpGAPZ A;pGAPZAMHRha-C8-C10, Rha-C10-C12∶1PAOXHW003GS115/pPICZ A-rmlABCD-rhlABpPICZ ARha-C10, Rha-C10-C10HW004GS115/pPICZ A-rmlABCD/pPICZAMH-rhlABpPICZ A;pPICZAMHRha-C8-C10, Rha-C10-C12∶1
1.2 仪器与设备
GR75DP高温高压灭菌锅,致微(厦门)仪器有限公司;SHA-C恒温摇床,常州澳华仪器有限公司;DHP-9162恒温培养箱,上海精宏实验设备有限公司;C1000 Touch PCR仪、PowerPacTM基础电泳仪电源,美国伯乐Bio-Rad公司;DYY-6C核酸电泳槽,北京六一生物科技有限公司;ECM830电穿孔仪,美国BTX公司;MST-65恒温金属浴,杭州奥盛仪器有限公司;HH-S2恒温水浴锅,金坛市荣华仪器制造有限公司;Gel-Doc3000核酸凝胶成像仪,北京赛智创业科技有限公司;SW-CJ-2FD超净工作台,苏州安泰空气技术有限公司;TU-1901紫外分光光度计,北京普析通用仪器有限责任公司;XW-80A旋涡混匀器,海门市其林贝尔仪器制造有限公司;MC-16R微量离心机,湖南可成仪器设备有限公司;L-535R台式冷冻离心机,湖南湘仪仪器有限公司;G80F23CN3XL-R6(K5)微波炉,格兰仕集团;SB-30制冰机,杭州雪科电器有限公司;PR620R电子天平,赛多利斯科学仪器有限公司;KQ-500DE超声波清洗机,昆山舒美超声仪器有限公司;SpectraMax i3x核酸测定仪,美国Molecular Devices公司;Bio Tek Synergy 2多功能酶标仪,美国Bio-Tek伯腾仪器有限公司;PN1600蓝光LED灯,加拿大光学治疗公司;1200 Infinity高效液相色谱仪,美国安捷伦Agilent科技公司;StepOne实时荧光定量PCR仪,Applied Biosystems公司;Falcon 353224 6孔板、Falcon 353072 96孔板、Falcon 351008一次性培养皿,康宁生命科学有限公司。
1.3 实验方法
1.3.1 RLs合成基因克隆和载体构建
本研究中基因簇rmlABCD与rhlAB均来源于P.aeruginosa PAO1,并由商业公司根据毕赤酵母密码子偏好性进行了基因合成。根据合成片段设计实验所用引物,选择基因上下游各30 bp左右片段设计引物rmlABCD-F、rmlABCD-R、rhlAB-F和rhlAB-R,使用引物PCR扩增得RLs合成基因rmlABCD和rhlAB。
利用引物AmpR-F、AmpR-R、PpHIS4-F和PpHIS4-R将氨苄青霉素抗性基因元件及PpHIS4基因元件分别导入pGAPZ A和pPICZ A质粒中,成功构建获得新型表达质粒pGAPZAMH与pPICZAMH。
1.3.2 RLs表达菌株构建
构建菌株GS115/pGAPZ A-rmlABCD-rhlAB(HW001)和GS115/pPICZ A-rmlABCD-rhlAB(HW003)。
首先,利用引物rmlABCD’-rhlAB’-F和rmlABCD’-rhlAB’-R将rmlABCD和rhlAB基因片段进行PCR扩增并连接成长片段rmlABCD-rhlAB;接着,将PCR产物用Not I与EcoR I两种限制性内切酶消化处理后,与经相同酶切处理的表达载体pGAPZ A和pPICZ A连接,分别构建pGAPZ A-rmlABCD-rhlAB与pPICZ A-rmlABCD-rhlAB;随后,将构建的表达载体转化至JM109,在含有抗生素Zeocin的LB琼脂平板上进行筛选;最后,将鉴定正确的表达载体pGAPZ A-rmlABCD-rhlAB与pPICZ A-rmlABCD-rhlAB转入P.pastoris GS115菌株中,在含有Zeocin的YPD琼脂平板进一步筛选。
菌株GS115/pGAPZ A-rmlABCD/pGAPZAMH-rhlAB(HW002)和GS115/pPICZ A-rmlABCD/pPICZAMH-rhlAB(HW004)的构建过程与HW001和HW003类似,但有以下不同:1)首先分别构建表达载体pGAPZ A-rmlABCD与pPICZ A-rmlABCD并转化至P.pastoris GS115,获得的转化子GS115/pGAPZ A-rmlABCD与GS115/pPICZ A-rmlABCD用于后续第2次转化;2)其次,将rhlAB基因片段经NotI与EcoRI酶切后,分别与经相同酶切处理的载体pGAPZAMH与pPICZAMH连接,获得表达载体pGAPZAMH-rhlAB和pPICZAMH-rhlAB,并转化至上述已获得的菌株GS115/pGAPZ A-rmlABCD与GS115/pPICZ A-rmlABCD中,最终在基础葡萄糖(minimal dextrose,MD)琼脂平板筛选。
转化子通过菌落PCR与DNA测序进行验证。菌落PCR采用特异性引物,针对载体特异序列及插入的目的基因片段进行扩增,以确认整合的正确性。扩增的PCR产物随后由商业测序公司(GENEWIZ,中国)进行DNA序列测定,以确保序列的准确性,通过PCR检测与测序验证的转化子菌株被用于进一步的RLs合成培养实验。
1.3.3 PGAP-P.pastoris的摇瓶培养
将菌株在YPD平板划线活化并接种于5 mL的YPD试管培养。将初始OD600值为0.2的菌液接种于BMGY培养基,30 ℃、220 r/min培养192 h。培养过程中,每隔24 h向BMGY培养基中添加体积分数为2%的甘油作为补料碳源,选取RLs产量最高的转化子进行后续研究。
1.3.4 PAOX-P.pastoris的摇瓶培养
将菌株在YPD平板上划线活化并接种于5 mL的YPD试管培养。将初始OD600值为0.2的菌液接种于BMGY培养基,30 ℃、220 r/min培养48 h。随后,收集全部培养细胞并转移至BMMY培养基中继续培养。在培养48 h耗尽初始甘油后,参照本实验室先前研究报道的甘油-甲醇交替补料策略进行补料[18]:第1个24 h内,分别在0 h和12 h各添加1次体积分数为0.5% 的甲醇;第2个24 h内添加体积分数为1%的甘油;第3个24 h内再次采用第1个24 h相同的甲醇补料方式;第4个24 h内再次补加体积分数为1% 的甘油。此后,持续交替进行24 h甲醇与甘油的补料,直至达到最佳采收阶段为止。
1.4 数据处理
1.4.1 P.pastoris生长曲线测定
P.pastoris生长曲线分析根据实验室报道方法[19]。
1.4.2 P.pastoris GS115合成RLs的产物提取及分析
RLs测定采用地衣酚-硫酸法[20]。地衣酚在酸性条件下与鼠李糖反应产生特定颜色的产物,在420～430 nm具有最大吸收峰。通过比色法测定该波长范围内的吸光度,即可推算出RLs含量。
RLs产物提取是将发酵液离心,去沉淀取上清液处理后,使用6 mol/L HCl溶液调节上清液pH值至2.0,于4 ℃静置沉降。之后使用等体积甲醇对上清液进行萃取,利用40 ℃条件下的旋转蒸发仪去除有机溶剂,即可获得粗提取的RLs样品。粗提样品再次溶解于甲醇中,制备成待测样品溶液。
RLs结构鉴定使用Waters公司四级杆飞行时间质谱-液相色谱-质谱联用仪(quadrupole-time of flight-liquid chromatograph-mass spectrometer,Q-TOF-LC-MS)系统[20-21]。该设备配备负离子模式下的电喷雾电离源(electrospray ionization,ESI),质谱扫描范围为m/z 0～3 000。使用BEH C18色谱柱(150 mm×2.1 mm,粒径1.7 μm),流动相为体积分数0.1%的甲醇和乙腈,流速设为0.3 mL/min,色谱柱温度维持在45 ℃,检测波长200 nm。仪器校正采用体积比为1∶1∶8的体积分数10%甲酸、0.1 mol/L NaOH和乙腈的混合溶液。实验数据采用MassLynx V4.1软件进行处理与分析。LC-MS能相对定量主要RLs同系物的比例,但绝对定量每种结构仍受限于标准品可得性和分离效率。未来需进一步开发高灵敏度、高通量的分析方法,并结合标准品库的完善,以实现更精确的结构特异性定量。
每隔24 h取样测定1次RLs,以确定最佳的培养终点,并分析最高RLs水平处的结构。
鼠李糖标准品用甲醇作溶剂,标准液配制成10、20、40、80、160、320 mg/L不同质量浓度,绘制标准曲线。
1.4.3 基因转录水平的RT-PCR分析
以下过程均在无RNase污染的超净台中进行。
从甘油管活化含有PGAP质粒和PAOX质粒的转化子;培养过夜后测定其OD600值,计算后转接至50 mL新鲜BMGY液体培养基中使初始OD600值为0.02。30 ℃、220 r/min振荡培养4～5 h,当菌液OD600值培养到0.8～1.0时,含PGAP质粒转化子停止培养;含PAOX质粒的转化子离心转接至BMMY培养基中诱导4 h后停止培养。
使用FastPure Complex Cell Total RNA Isolation Kit提取试剂盒提取总RNA;使用HiScript IV All-in-One Ultra RT SuperMix for qPCR试剂盒将RNA反转录为cDNA。使用ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix试剂盒配制qPCR扩增体系,使用StepOne实时定量PCR仪进行RT-PCR反应。
RT-PCR体系如下:总体系为20 μL,其中模板cDNA 800 ng,酶10 μL(避光),上下引物各0.4 μL,ddH2O补齐。PCR程序如下:95 ℃,30 s;95 ℃,10 s;60 ℃,30 s,40个循环;95 ℃,15 s;60 ℃,60 s;95 ℃,15 s。每孔3个重复。
反应结束后,系统控制面板会显示各孔的Ct值,计算2-ΔΔCt值可以确定目的基因的相对转录水平。Ct值是指反应体系的荧光信号达到阈值时,也就是起始模板扩增至一定产物量所对应的扩增循环数。因此模板浓度越高,Ct值越小。18S rRNA是本次实验的内源性参考基因,能够为后续数据提供参照、作为基准。
2 结果与分析
2.1 组成型P.pastoris GS115合成RLs的结构
如1.3.2节所述,构建2种组成型菌株,GS115/pGAPZ A-rmlABCD-rhlAB(HW001)以及GS115/pGAPZ A-rmlABCD/pGAPZAMH-rhlAB(HW002)。对rmlABCD和rhlAB基因验证,其理论长度在3 400 bp和2 300 bp左右;如图2所示,菌株HW001和HW002均构建正确。
M-DNA Marker;泳道1-rhlAB;泳道2-rmlABCD。
图2 菌株建构的PCR验证
Fig.2 PCR verification of strain construction
GS115、HW001和HW002的生长曲线比较如图3-a所示,在BMGY培养基中,HW001生长速率和最高OD600值均高于原始菌株GS115,在168 h其OD600值为38.80,较GS115提升18.58%;而HW002生长弱于HW001和GS115,分别降低了37.52%和25.91%。
a-生长曲线;b-RLs产量
图3 GS115、HW001和HW002的生长曲线及RLs产量
Fig.3 Growth curves and RLs production of GS115, HW001 and HW002
然后比较HW001与HW002中RLs合成量,如图3-b所示,HW001在144 h合成RLs达30.80 mg/L;而HW002合成量达38.20 mg/L,较HW001提高了24.03%。
最后利用LC-MS/MS鉴定了RLs组成,如附图1所示,HW001合成了3种结构的RLs,包括Rha-C10(m/z 333),Rha-C10-C10(m/z 505)和Rha-C10-C12∶1(m/z 529),前两者为常见类型[1]。而HW002仅合成2种RLs:Rha-C8-C10(m/z 475)和Rha-C10-C12∶1(m/z 529),后者于HW001相同。
2.2 诱导型P.pastoris GS115合成RLs的结构
如1.3.2节所述,构建2种诱导型菌株,GS115/pPICZ A-rmlABCD-rhlAB(HW003)以及GS115/pPICZ A-rmlABCD/pPICZAMH-rhlAB(HW004)。
GS115、HW002和HW004的生长曲线比较如图4-a所示,在BMMY培养基中,HW003生长速率和最高OD600值均高于原始菌株GS115,在168 h其OD600值为35.52,较GS115提升17.46%;而HW004生长也高于HW003和GS115,分别降低了5.29%和25.91%。
a-生长曲线;b-RLs产量
图4 GS115、HW003和HW004的生长曲线及RLs产量
Fig.4 Growth curves and RLs production of GS115, HW003, and HW004
然后比较HW003与HW004中RLs合成量,如图4-b所示,HW003在144 h合成RLs达53.86 mg/L;而HW004合成量达42.70 mg/L,较HW003降低了20.72%。
本研究中所采用的甲醇交替补料策略是本实验室已发表成果[18],在RLs的生物合成过程中表现出明显优势。在初步实验中,传统单一使用甲醇补料的诱导方式未能成功合成RLs,可能原因是甲醇作为唯一碳源难以提供充足的碳骨架用于合成RLs前体物质——脂肪酸。因此,本研究中将典型的诱导阶段细分为4个48 h周期,每个周期内分别以甲醇(前24 h)与甘油(后24 h)交替进行补料。这种策略背后的可能机制是:在碳源从甲醇切换至甘油后,菌株能够显著提高ATP和NADPH的产生量[18]。虽然在甘油补料的24 h期间,RLs相关基因的表达停止,但在之前甲醇补料的24 h内已表达的酶量足以继续催化RLs的合成过程,从而有效地提高了整体RLs的产量。
最后利用LC-MS/MS鉴定了RLs组成,如电子版增强出版附图2所示,HW003合成了2种结构的RLs,包括Rha-C10(m/z 333)和Rha-C10-C10(m/z 505),前两者为常见类型[1]。而HW004也合成2种RLs:Rha-C8-C10(m/z 475)和Rha-C10-C12∶1(m/z 529)。
本研究首次在P.pastoris GS115中揭示了基因簇不同整合模式与不同启动子对RLs产量及结构组成的影响,如表1所示。随着未来进一步对调控机制的深入研究,我们有望在P.pastoris GS115中实现对特定结构RLs的精准合成。
本研究发现了RLs中不同结构组分,但目前由于无法获得商业化标准品,因此无法对其分别定量,未来可借助制备型HPLC获得纯净的几种RLs组分,再进行测定。
2.3 不同策略对RLs转录水平的影响
根据表1发现HW002相较于HW001,HW004比HW003更倾向于合成含有双链和不饱和结构的RLs。为何HW001、HW002、HW003和HW004的RLs的合成结构存在差异,由图1可知,RLs的结构由rhlA决定,本研究推测与rhlA转录差异有关。基于此,使用RT-PCR方法分析不同菌株中rhlA基因的转录水平。
如图5所示,RT-PCR数据显示与GS115相比,HW001、HW002、HW003和HW004菌株中rhlA基因转录水平的确有所不同。
图5 转录水平分析对RLs合成的影响
Fig.5 Effect of transcriptional level analysis on rhamnolipid biosynthesis
注:GS115菌株为对照,分析HW001、HW002、HW003和HW004中rhlA基因的转录水平。
对图5进一步分析发现,使用2次转化时,HW002和HW004中的rhlA基因转录水平相较于1次转化的HW001和HW003分别上调了0.70倍和0.25倍。其原因与启动子个数有关,如HW001中,rmlABCD-rhlAB的表达均由1个PGAP控制;而在HW002中,rmlABCD和rhlAB则分别由2个PGAP控制。据报道,基因到启动子的远近影响着转录强度[22],距离越远,转录越弱。启动子类型对转录水平影响也比较显著,采用诱导性启动子时rhlA基因转录水平则比采用组成型启动子时更强,HW003和HW004中的rhlA转录水平相较于HW001和HW002分别提高了1.25倍和0.65倍。
3 结论
本研究在P.pastoris GS115中实现了RLs的生物合成,通过优化编码RLs合成基因(rhlA、rhlB、rmlA、rmlB、rmlC和rmlD),研究了不同启动子(PAOX和PGAP)和转化方式对RLs组分及合成产量的影响。
构建了菌株GS115/pGAPZ A-rmlABCD-rhlAB(HW001)、GS115/pGAPZ A-rmlABCD/pGAPZAMH-rhlAB(HW002)、GS115/pPICZ A-rmlABCD-rhlAB(HW003)以及GS115/pPICZ A-rmlABCD/pPICZAMH-rhlAB(HW004)。采用PGAP时,HW001合成3种RLs(Rha-C10、Rha-C10-C10和Rha-C10-C12∶1),共30.80 mg/L,而HW002合成38.20 mg/L的2种RLs,除Rha-C10-C12∶1外,还有Rha-C8-C10;采用PAOX时,HW003合成2种RLs(Rha-C10和Rha-C10-C10),共53.86 mg/L,而HW004合成42.70 mg/L的RLs,组成与HW002相同。
本研究证实了P.pastoris GS115合成RLs的可行性,揭示不同启动子和转化方式对RLs组分会产生显著影响,为合成不同结构的RLs提供了重要依据。
[1] THAKUR P, SAINI N K, THAKUR V K, et al.Rhamnolipid the Glycolipid Biosurfactant:Emerging trends and promising strategies in the field of biotechnology and biomedicine[J].Microbial Cell Factories, 2021, 20(1):1.
[2] WITTGENS A, ROSENAU F.Heterologous rhamnolipid biosynthesis:Advantages, challenges, and the opportunity to produce tailor-made rhamnolipids[J].Frontiers in Bioengineering and Biotechnology, 2020, 8:594010.
[3] SOBER
N-CH
VEZ G, GONZLEZ-VALDEZ A, SOTO-ACEVES M P, et al.Rhamnolipids produced by Pseudomonas:From molecular genetics to the market[J].Microbial Biotechnology, 2021, 14(1):136-146.
[4] BAHIA F M, DE ALMEIDA G C, DE ANDRADE L P, et al.Rhamnolipids production from sucrose by engineered Saccharomyces cerevisiae[J].Scientific Reports, 2018, 8:2905.
[5] WIDBERGER J, WITTGENS A, KLAUNIG S, et al.Recombinant production of Pseudomonas aeruginosa rhamnolipids in P.putida KT2440 on Acetobacterium woodii cultures grown Chemo-Autotrophically with carbon dioxide and hydrogen[J].Microorganisms, 2024, 12(3):529.
[6] GUTIÉRREZ-GMEZ U, SOTO-ACEVES M P, SERV
N-GONZLEZ L, et al.Overproduction of rhamnolipids in Pseudomonas aeruginosa PA14 by redirection of the carbon flux from polyhydroxyalkanoate synthesis and overexpression of the rhlAB-R operon[J].Biotechnology Letters, 2018, 40(11):1561-1566.
[7] DULCEY C E, LPEZ DE LOS SANTOS Y, LÉTOURNEAU M, et al.Semi-rational evolution of the 3-(3-hydroxyalkanoyloxy)alkanoate (HAA) synthase RhlA to improve rhamnolipid production in Pseudomonas aeruginosa and Burkholderia glumae[J].The FEBS Journal, 2019, 286(20):4036-4059.
[8] DU J, ZHANG A J, HAO J A, et al.Biosynthesis of di-rhamnolipids and variations of congeners composition in genetically-engineered Escherichia coli[J].Biotechnology Letters, 2017, 39(7):1041-1048.
[9] TISO T, SABELHAUS P, BEHRENS B, et al.Creating metabolic demand as an engineering strategy in Pseudomonas putida-Rhamnolipid synthesis as an example[J].Metabolic Engineering Communications, 2016, 3:234-244
[10] VICTOR I U, KWIENCIEN M, TRIPATHI L, et al.Quorum sensing as a potential target for increased production of rhamnolipid biosurfactant in Burkholderia thailandensis E264[J].Applied Microbiology and Biotechnology, 2019, 103(16):6505-6517.
[11] VOGL T.Engineering of promoters for gene expression in Pichia pastoris[J].Methods in Molecular Biology, 2022, 2513:153-177.
[12] HU X Q, CHU J, ZHANG S L, et al.Comparative performance of S-adenosyl-L-methionine biosynthesis and degradation in Pichia pastoris using different promoters and novel consumption inhibitors[J].Enzyme and Microbial Technology, 2014, 55:94-99.
[13] LU J P, CHEN Z H, ZHU H M, et al.Optimizing rhamnolipid performance by modulating the expression of fatty acid synthesis genes fabA and fabZ in Pseudomonas aeruginosa Pao1[J].Genes, 2025, 16(5):515.
[14] CHEN I C, LEE M T.Rhamnolipid biosurfactants for oil recovery:Salt effects on the structural properties investigated by mesoscale simulations[J].ACS Omega, 2022, 7(7):6223-6237.
[15] BUONOCORE C, GIUGLIANO R, DELLA SALA G, et al.Evaluation of antimicrobial properties and potential applications of Pseudomonas gessardii M15 rhamnolipids towards multiresistant Staphylococcus aureus[J].Pharmaceutics, 2023, 15(2):700.
[16] ZHAO F, WANG B X, YUAN M L, et al.Comparative study on antimicrobial activity of mono-rhamnolipid and di-rhamnolipid and exploration of cost-effective antimicrobial agents for agricultural applications[J].Microbial Cell Factories, 2022, 21(1):221.
[17] NIKOLOVA C, GUTIERREZ T.Biosurfactants and their applications in the oil and gas industry:Current state of knowledge and future perspectives[J].Frontiers in Bioengineering and Biotechnology, 2021, 9:626639.
[18] HU X Q, CHU J, ZHANG S L, et al.A novel feeding strategy during the production phase for enhancing the enzymatic synthesis of S-adenosyl-L-methionine by methylotrophic Pichia pastoris[J].Enzyme and Microbial Technology, 2007, 40(4):669-674.
[19] CHENG B J, YU K Y, WENG X, et al.Impact of cell wall polysaccharide modifications on the performance of Pichia pastoris:Novel mutants with enhanced fitness and functionality for bioproduction applications[J].Microbial Cell Factories, 2024, 23(1):55.
[20] DÉZIEL E, LÉPINE F, MILOT S, et al.Mass spectrometry monitoring of rhamnolipids from a growing culture of Pseudomonas aeruginosa strain 57RP[J].Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Molecular and Cell Biology of Lipids, 2000, 1485(2-3):145-152.
[21] ESLAMI P, HAJFARAJOLLAH H, BAZSEFIDPAR S.Recent advancements in the production of rhamnolipid biosurfactants by Pseudomonas aeruginosa[J].RSC Advances, 2020, 10(56):34014-34032.
[22] ALFONSO-GONZALEZ C, LEGNINI I, HOLEC S, et al.Sites of transcription initiation drive mRNA isoform selection[J].Cell, 2023, 186(11):2438-2455.e22.