酱香型白酒历史悠久,采用“12987”工艺[1],即1年1个周期、2次投料、9次蒸煮、8次发酵、7次取酒。末轮次酒醅经过多轮次发酵之后[2],残余淀粉少、酸度高、微生物活性下降,使得糖化效率显著下降;此外,经过多次反复的蒸煮,白酒酒体风味寡淡,焦苦味比较突出[3-4]。甜酒曲属于小曲中的一种,是米酒酿造的糖化、发酵和生香剂[5]。甜酒曲中存在霉菌、酵母和细菌等数十个种属的微生物[6],其中优势霉菌主要是根霉、曲霉和毛霉属等微生物[7-9]。而甜酒糟是生产甜酒的主要副产物之一,甜酒糟中富含大量活性微生物[10],可视为甜酒曲中糖化微生物的活化及扩大培养产物。在之前的研究中,采用甜酒糟强化显著提升了末轮次酱酒醅的糖化效率[1-2],使得末轮次酒醅残余淀粉消耗量较空白组提高15.38%,还原糖生成量增加12%。此外,甜酒糟强化破坏了淀粉的晶体结构,减弱了最大衍射峰强度,降低结晶度;同时促使淀粉分子质量整体变小,并通过扫描电镜观察到淀粉颗粒表面裂痕增多、孔洞增多。然而,甜酒糟强化对白酒风味的影响还未可知。因此,研究甜酒糟强化对末轮次酱酒风味的影响,对酱香型白酒的生产具有一定的科学意义。
研究表明,白酒风味与酒醅中微生物群落密切相关,乳酸菌、芽孢杆菌等功能菌群在产酸、产酯及风味前体合成中发挥关键作用[11-12]。甜酒糟富含活性微生物及有机酸等,通过甜酒糟协同高温大曲能提高末轮次酱酒醅的糖化效率,理论上可以改善微生物环境,促进糖化与产香,促进白酒中各种风味物质的生产。因此,研究酒醅微生物以及主要理化成分对酒样的风味形成息息相关。
之前的研究中已经确定了7 g/50 g和3.5 g/50 g分别为甜酒糟和甜酒曲在传统高温大曲中最佳添加量。本文旨在采用甜酒糟强化以改善末轮次酱酒的风味,在传统高温大曲中添加7 g/50 g的甜酒糟以及3.5 g/50 g的甜酒曲为甜酒糟强化组与甜酒曲强化组,并与传统高温大曲进行对照,分析大曲的生产性能、酒曲以及酒醅的微生物数量和多样性、酒样的主要风味物质,从而为末轮次酱酒的科学生产提供一定理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
原料:末轮次酱酒醅(第7轮次),高温大曲,湖南湘窖酒业有限公司;甜酒曲,安琪酵母股份有限公司;甜酒糟,以甜酒曲为糖化剂制成甜酒(醪糟)过滤后的固体物质。
试剂:无水葡萄糖、NaOH、HCl、淀粉酶、糖化酶、MRS培养基、孟加拉红培养基、Czapek Dox培养基等,分析纯;E.Z.N.A.® soil试剂盒,杭州西顿生物科技有限公司。
仪器:7890A-5975C气相色谱质谱联用仪、E-nose型智能电子鼻(便携式),ISENSO公司;HR-T16M台式高速冷冻离心机,上海基屹生物科技有限公司;PE.28型pH计、UV5 Nano超微量分光光度计,梅特勒-托利多仪器有限公司;DH-360恒温培养箱、YA28×6T全自动灭菌锅,北京科伟永兴仪器有限公司;GH-420隔水培养箱、RE-52AA旋转蒸发仪、KF960型PCR扩增仪、SDS-PAGE仪,上海雅荣生化设备仪器有限公司;GWA-UN1超纯水器,北京普析通用仪器有限责任公司。
1.2 试验方法
1.2.1 样品制备
称取3 kg糯米(干重),润粮12 h,蒸粮1.5 h,至蒸熟,冷却至35 ℃;加入安琪甜酒曲6 g与糯米混合均匀,装入坛子于28 ℃发酵4 d,即为甜酒(醪糟),过滤掉液体,所得的固体物质为甜酒糟。在此前研究中,以酒醅还原糖生成量以及淀粉消耗量为依据,经过单因素实验,确定了在传统高温大曲中加入7 g甜酒糟混匀为甜酒糟强化组(7 g/50 g)命名为样品B,在传统高温大曲中加入3.5 g甜酒曲混匀为甜酒曲强化组(3.5 g/50 g)[1-2],命名为样品C;传统高温大曲作为对照组,为样品A;3组样品均在35 ℃培养箱中培养。
以每4 kg末轮次酱酒粮醅为一组样品,对照组样品(样品A)拌入0.5 kg传统高温大曲,试验组样品分别拌入0.5 kg强化甜酒糟大曲和0.5 kg强化甜酒曲大曲。充分混匀后发酵,40 ℃发酵30 d,每组样品设置2个平行样品。分别测定3种酒曲和3种酒醅的理化指标和微生物多样性;测定该白酒的理化指标与主要风味物质[13]。
1.2.2 酒曲和酒醅理化指标测定
参照标准QB/T 4259—2011《浓香大曲》,对酒曲的水分、酸度、氨基酸态氮、发酵力、糖化力和酯化力依次进行测定;参照标准DB 34/T 2264—2014《固态发酵酒醅分析方法》,对酒醅的还原糖含量、残余淀粉含量、酒醅酸度及水分含量进行测定。
1.2.3 酒曲和酒醅微生物菌落数量的测定
细菌测定参考《白酒生产技术全书》;乳酸菌测定参考GB 4789.35—2023《食品安全国家标准 食品微生物学检验 乳酸菌检验》,霉菌和酵母菌测定参考GB 4789.15—2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验 霉菌和酵母计数》。
1.2.4 酒醅微生物区系、多样性分析
样品的预处理:分别取10 g的甜酒糟强化组酒醅、甜酒曲强化组酒醅和对照组酒醅加入灭菌的0.1 mol/L磷酸盐缓冲液进行浸泡,振荡搅拌5 min。300 r/min离心5 min,取上清液,沉淀用缓冲液重复洗涤3次。将所收集的上清液混匀,再以9 000 r/min离心3 min,收集沉淀[14]。再用缓冲液洗3次并离心,收集沉淀。
DNA的提取:按照HE等[15]方法提取总DNA。用E.Z.N.A.® soil试剂盒进行总DNA抽提,使用超微量分光光度计初检测其浓度和纯度。用0.8%的琼脂糖凝胶电泳检测其分子大小和纯度。
微生物区系分析:本实验委托飞凡标准技术服务(苏州)有限公司完成。对DNA进行PCR扩增后,分别进行真菌ITS基因测序鉴定和细菌16S rDNA基因测序鉴定。
基因序列分析:测序完成后,采用Illumina平台对真菌类和细菌类基因序列进行数据分析与序列优化。使用NCBI BLAST软件比对,将相似性≥99%的序列进行系统进化树分析,并将高质量的基因序列与数据库中的序列进行同源性比较,进而获得该基因序列的物种信息。
1.2.5 白酒理化指标的测定
在实验室模拟湘窖酒业有限公司蒸酒操作,将蒸馏好的白酒密封保存,白酒酒精度、总酸、总酯和酸酯总量的测定参照标准GB/T 10345—2022《白酒分析方法》。
1.2.6 白酒风味分析
利用GC-MS分析白酒主要风味物质,本研究仅对质量浓度超过1 mg/L的成分进行分析(酒样中的水分未计入风味物质)。用有机系0.45 μm过滤器分别对3种酒样进行过滤处理,再由离心管分别装入10 mL样品密封,由上海微谱技术检测科技集团股份有限公司进行实验测定。预处理取0.5 mL样品进行20倍稀释。GC色谱柱采用DB-5 ms毛细管柱(30 m×250 μm×0.25 μm)进行酒样中各类香气物质分离采集;压力52.76 kPa,加热器300 ℃,总流量39 mL/min,分流比为35∶1。高纯He为载气,恒流。柱流速1 mL/min,进样量1 μL;MS:全扫描模式;EI离子源,扫描范围30～350 u,扫描时间0.2 s[16]。
1.2.7 数据处理
运用SPSS软件进行数据处理和显著性分析,每组实验重复3次,结果均以“平均值±标准差”表示,Origin 2022作图。
2 结果与分析
2.1 甜酒糟强化对高温大曲生产性能的影响
2.1.1 甜酒糟强化对高温大曲微生物菌落的影响
如图1所示,样品B的细菌、酵母菌、霉菌和乳酸菌均显著高于样品A和样品C,其中细菌数量最多。细菌具有耐高温的属性,能在相对高温发酵的环境下保持代谢活性,能将高粱中的蛋白质降解为氨基酸等小分子底物,参与氨基酸代谢,为吡嗪类、酯类、酚类等酱香化合物提供前体[17],同时分泌有机酸,进一步丰富风味物质组成。
图1 不同处理组主要微生物的对比
Fig.1 Comparison of the main microorganisms among different treatment groups
注:不同小写字母表示组间具有显著差异(P<0.05)(下同)。
样品B霉菌数量显著增加,糖化酶活力随之提升,使淀粉更充分地转化为可发酵糖,为后续酵母菌酒精发酵及乳酸菌乳酸发酵提供充足碳源与营养。酵母菌数量的提高使得更多的糖类转化为酒精,并产生更多的酯类、醇类、醛类等风味物质,直接影响酱香型白酒的香气特征与口感质量。乳酸菌数量增多,乳酸产量相应提高,可有效调节末轮次酒醅的pH值,抑制杂菌滋生,维持微生物的稳定。
综上,甜酒糟的添加显著增加了高温大曲中主要微生物菌落的数量,为后续提高酒醅的糖化效率提供良好的微生物环境,进一步促进酒精发酵和风味形成。
2.1.2 甜酒糟强化对高温大曲生化指标的影响
发酵力、糖化力、酯化力、蛋白酶活力与氨基酸态氮是评价大曲生产性能的核心指标[17]。发酵力反映微生物将可发酵糖转化为乙醇的效率,与出酒率直接相关;糖化力指淀粉酶系将淀粉水解为葡萄糖、麦芽糖等可发酵糖的能力,可直接促进发酵力和酯化力等指标;酯化力[18]是指高温大曲在发酵过程中催化有机酸与醇类缩合生成酯类的能力,而这些酯类化合物组成了白酒的主要香气成分。蛋白酶活力指蛋白质降解为氨基酸等小分子物质的水平,其产物氨基酸态氮既为微生物提供氮源,也是高级醇、酯类等风味成分的前体。
如表1所示,甜酒糟强化组(样品B)上述5项指标均显著优于另外2组(P<0.05),与对照组相比,糖化力、酯化力和蛋白酶活力分别提高了11.76%、12.34%、12.89%,说明在高温大曲中添加甜酒糟可显著提高酒曲主要微生物代谢活力,进一步验证了2.1节中主要微生物的数量优势,进而促进高温大曲各项发酵性能的提高。
表1 不同处理组生化指标的对比
Table 1 Comparison of biochemical indicators among different treatment groups
组别发酵力/[g/(0.5 g·72 h)]糖化力/U酯化力/U蛋白酶活力/(U/g)氨基酸态氮/(g/kg)样品A20.83±1.1102±6.522.7±1.878.72±5.21.523±0.09样品B29.34±1.5∗114±7.2∗25.5±2.0∗88.87±6.1∗2.485±0.12∗样品C24.38±1.3102±6.817.0±1.544.01±3.41.575±0.10
注：*表示样品间具有显著差异(P<0.05)(下同)。
甜酒糟强化组酒曲糖化力显著高于传统酒曲,其糖化力反映了霉菌和细菌等产淀粉酶和糖化酶的能力,使更多的淀粉转化为可发酵糖[19];发酵力的增强说明甜酒糟强化组酒曲中富含糖化发酵功能微生物,有利于提高酒曲糖化发酵以及产醇能力[20];酯化力的提高说明甜酒糟强化组酒曲中产酯微生物及酯化酶活性较强,在高温发酵过程中加速了酯类化合物的合成,为后续产酸产酯反应创造了有利条件。蛋白酶活力的增强则促进了蛋白质的充分降解,生成小肽、氨基酸等含氮小分子物质[21],氨基酸态氮含量相应升高;这些氨基酸可进一步通过转氨、脱羧及酯化等代谢途径转化为酯类、醇类、有机酸等香气成分,赋予酒体更加醇厚、协调的风味特征。综上,甜酒糟的添加显著增强了高温大曲的糖化、发酵及蛋白水解等功能,提高了原料的利用率,为白酒风味品质提供了基础。
2.2 甜酒糟强化对末轮次酱酒醅主要成分和微生物菌落的影响
2.2.1 甜酒糟强化对末轮次酱酒醅主要理化成分的影响
从表2可知,2个强化组均比对照组的还原糖含量高,但甜酒糟强化组(样品B)的残余淀粉含量显著低于另外2组,验证了之前的结论:甜酒糟能促进末轮次酱酒醅的糖化效率。在末轮次酒醅发酵过程中,酒醅中的水分不可过高或过低,3组样品的水分维持在47%～50%,样品B的水分高于样品A和样品C,水分高更有利于微生物代谢,同时,微生物代谢会产生一定量的水,水具有良好的比热容[22],可缓冲高温造成的多种酶系失活,提供良好的微生物环境。酸度也是影响末轮次酒醅的重要原因,适宜的酸度能促进有益微生物的生长代谢,避免杂菌的产生。样品B中酸度升高主要源于乳酸菌等厌氧微生物代谢产生的乳酸及芽孢杆菌分泌的乙酸、丙酸等有机酸[23],这些有机酸又能促进各种酯类物质的生成,进而提高白酒的品质。总体而言,3组酒醅的水分和酸度均保持相对稳定,有利于达到酿酒的总体要求。
表2 不同处理组酒醅理化指标的对比
Table 2 Comparison of physicochemical indices of the fermented grains of different treatment
组别还原糖/(g/100 g)残余淀粉/(g/100 g)水分/%酸度/(mmol/10 g)样品A2.5±0.0517.78±0.23∗47.04±1.23.9±0.50样品B2.8±0.1014.85±0.4549.14±1.54.0±0.55样品C2.9±0.0617.20±0.6147.46±1.03.8±0.53
综上,甜酒糟强化组可以提高末轮次酱酒醅的糖化能力,促进淀粉的有效利用。
2.2.2 甜酒糟强化对末轮次酱酒醅中微生物菌落的影响
由图2可知,样品B的细菌、霉菌、酵母和乳酸菌均高于样品A和样品C。由2.1.1节和2.1.2节可知样品B中主要微生物和生化指标均高于样品A和样品C。甜酒糟的添加促进了更多的淀粉转化为可发酵糖,为微生物的生长繁殖提供充足的营养物质,细菌数量增加能促使白酒产生更多的风味物质,起到产香的作用;霉菌数量增加可促进酒醅的糖化,可将高粱淀粉持续水解为葡萄糖、麦芽糖,为酵母产酒精提供原材料。同时霉菌可以水解蛋白质和脂肪等大分子物质为氨基酸、脂肪酸等[24],既供细菌产酸,也经美拉德反应生成糠醛、呋喃等“焦香”物质。酵母菌数量上升产生了更多的乙醇,为后续进行酯化反应生成酯类物质提供底物。乳酸菌数量增加使得更多的糖转化成乳酸,可与乙醇缩合变成乳酸乙酯,丰富白酒的风味。
图2 不同处理组酒醅微生物菌落的对比
Fig.2 Comparison of microbial counts in the fermented grains of different treatment
2.2.3 甜酒糟强化对高温大曲和末轮次酱酒醅微生物多样性的影响
2.2.3.1 甜酒糟强化对高温大曲和末轮次酱酒醅细菌多样性的影响JP1、JP2、JP3分别表示对照组酒醅、甜酒糟强化组酒醅以及甜酒曲强化组酒醅;JQ1、JQ2、JQ3分别指对照组酒曲、甜酒糟强化组酒曲以及甜酒曲强化组酒曲。如图3所示,在高温大曲(JQ1、JQ2、JQ3)中,添加了甜酒糟的高温大曲中细菌的数量更多,多样性更丰富。测序结果显示,末轮次酱酒醅中细菌的优势菌种包括[25]:厌氧盐杆菌属(Anaerosalibacter)、草螺菌属(Herbaspirillum)、芽孢杆菌属(Bacillus)、克罗彭施泰特氏菌属(Kroppenstedtia)、枝芽孢杆菌属(Virgibacillus)等,结果显示,高温大曲中样品B此类菌属的数量高于样品A和C。其中Bacillus是酱香型白酒生产中的主要功能菌,能在55 ℃及以上高温下生长,促进以葡萄糖、甘氨酸和NaCl为原料的美拉德反应迅速发生[25],生成乙酸、乙酸乙酯、乙醛、乙缩醛、丁二醇等风味物质,是重要的产酸和产香菌,促进浓郁的酱香风味形成;在末轮次酱香型酒醅(JP123)中,块茎芽孢杆菌属(Tuberibacillus)、不动杆菌属(Acinetobacter)属数量更多,Tuberibacillus是耐热芽孢杆菌的一种,多种芽孢杆菌能代谢产生大量具有酱味的吡嗪类物质和酸味的物质[26],有助于提高白酒中四甲基吡嗪的含量,并对白酒品质有一定的提升作用[27],Acinetobacter是具有呼吸和发酵代谢作用的细菌[28],以葡萄糖和其他碳水化合物代谢产酸,是酱香型白酒酒醅中的主要微生物。
图3 不同处理组酒醅细菌的多样性分析
Fig.3 Bacterial diversity in the fermented grains of different treatment
2.2.3.2 甜酒糟强化对高温大曲和末轮次酱酒醅真菌多样性的影响
图4测序结果显示,末轮次酱酒醅中真菌的优势菌属为曲霉属(Aspergillus)、红曲霉属(Monascus)、根毛霉属(Rhizomucor)等。添加了甜酒糟的高温大曲中真菌的数量更多,多样性更丰富。其中,Monascus、Aspergillus相对丰度大,Monascus是引起大曲高酯化力的关键菌群[29-30]。Aspergillus能够参与糖酵解等途径,同时能够产生淀粉酶、蛋白酶、糖化酶、酯化酶等多种酶类[31],为白酒酿造前期对原料中淀粉等大分子物质的降解提供稳定动力。
图4 不同处理组酒醅真菌的多样性分析
Fig.4 Analysis of fungal diversity in the fermented grains of different treatment
综上,甜酒糟强化可以同时丰富酿酒细菌和真菌的丰度,为酿酒提供良好的微生物环境。
2.3 甜酒糟强化对末轮次酱酒主要成分的影响
2.3.1 甜酒糟强化对白酒理化成分的影响
由表3可知,样品B的酒精度、总酸、总酯含量均高于样品A和样品C。酒精度的提高主要是由于甜酒糟不仅能提高末轮次酱酒醅的糖化效率,生成更多的可发酵糖,而且提高了可发酵糖到酒精的转化效率,进而提高了出酒率。
表3 白酒的理化指标对比
Table 3 Comparison of physicochemical indices of Baijiu
组别酒精度/(%vol)总酸/(g/L)总酯/(g/L)样品A22±0.81.4±0.060.246 4±0.02样品B25±0.2∗1.7±0.070.299 2±0.05样品C23±0.31.5±0.040.246 4±0.01
样品B酒醅中总酸含量高于样品A和C,这主要得益于在甜酒糟的强化作用下,以乳酸菌为主的产酸类细菌含量以及活性显著提高,代谢生成更多的乳酸、乙酸等有机酸,进一步丰富了白酒的风味[32]。
酯类物质是白酒香气的主要载体,样品B中总酯含量比样品A多21.43%,甜酒糟的添加促进酒醅中的霉菌属等产糖化酶、液化酶等,分解更多的淀粉,增加酵母菌和细菌等进行代谢反应所需的还原糖含量,通过一系列反应促进酯化反应的发生,使白酒香气更浓郁。
综上,甜酒糟强化组能提升酒精度、增加总酸、提高总酯,促进白酒产香,具备应用于酱香型白酒生产的潜力。
为了模拟湘窖酒业有限公司蒸酒操作,在实验室搭建馏酒装置进行实验,鉴于实验室蒸馏设施有限,本实验蒸馏的白酒样品水汽较多,酒精度及风味物质等含量较低,但是甜酒糟强化组与空白组和甜酒曲强化组之间的各种差异及变化趋势明显,可用来比较3种白酒的风味差别。
2.3.2 甜酒糟强化对白酒主要风味物质的影响
由于酒体中存在大量风味物质,本研究仅对质量浓度超过1 mg/L的成分进行分析。表4结果显示,添加样品B乙醇含量高于样品A和样品C,说明甜酒糟强化可提高葡萄糖、麦芽糖等可发酵糖转化为酒精的效率。与空白组对比,样品B中的乙酸乙酯、丁酸乙酯、己酸乙酯含量分别提高了39.27%、13.54%、24.52%。正丁酸和己酸含量也显著高于另外2组。乙酸乙酯和丁酸乙酯具有果香[33],是酱香型白酒中重要的酯类之一,己酸乙酯由己酸菌先产己酸,再与乙醇酯化生成,丁酸乙酯与己酸乙酯含量的提升主要是由于甜酒糟中富含的细菌、酵母菌等微生物之间的相互作用使得丁酸、己酸含量上升,丁酸与己酸分别与醇反应产生丁酸乙酯和己酸乙酯。
表4 不同处理组白酒的主要风味物质对比
Table 4 Comparison of key flavor compounds in Baijiu
物质样品A/%样品B/%样品C/%乙醇87.104±3.67091.521±3.71090.645±3.800乙酸乙酯0.191±0.0080.266±0.005∗0.176±0.004叔戊醇0.058±0.0030.037±0.0090.038±0.001丁酸乙酯0.096±0.0070.109±0.0020.061±0.006己酸乙酯0.310±0.0120.386±0.0150.244±0.010乳酸乙酯0.857±0.0500.851±0.0170.868±0.050乙酸0.683±0.0210.380±0.0140.504±0.018正丁酸0.051±0.0060.139±0.005∗0.089±0.009己酸0.057±0.0040.101±0.006∗0.052±0.003
3组酒样均为实验室蒸馏,其风味与市面上的酒产品不具备可比性,但实验组与对照组的差异明显,能起到对比3组白酒风味差异的作用。
3 结论
本研究通过探讨甜酒糟强化对末轮次酱香型白酒发酵过程中微生物群落结构及酒体风味的影响,可以得出以下结论:1)高温大曲生产性能的提高:在传统高温大曲中添加甜酒糟(7 g/50 g)可显著提升大曲的发酵力、糖化力、酯化力、蛋白酶活力及氨基酸态氮含量,与对照组相比,糖化力、酯化力、蛋白酶活力分别提高了11.76%、12.34%、12.89%;2)微生物数量以及多样性的提升:甜酒糟强化显著提高了大曲和酒醅中细菌、霉菌、酵母菌及乳酸菌的数量与多样性,形成有利于发酵的微生物环境;3)酒体风味物质含量的增加:蒸馏酒样分析显示,甜酒糟强化组酒精度、总酸和总酯分别提高13.6%、21.4%和21.4%,主要风味物质如乙酸乙酯、丁酸乙酯、己酸乙酯等含量分别增加了39.27%、13.54%、24.52%,使得酒体香气更协调、口感更柔和。
综上所述,甜酒糟在提升末轮次酱酒糖化效率、改善微生物群落结构及增强酒体风味方面具有良好的应用前景,为酱香型白酒品质提升提供了一定的理论基础。
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