浓香型白酒是中国白酒的典型代表,其独特的风味品质与酿造核心载体——浓香大曲(又称中高温大曲)的微生物群落结构及其代谢功能密切相关。浓香大曲是浓香型白酒酿造的关键糖化剂与发酵剂,为发酵提供丰富的微生物、多样化的酶系以及风味前体物质,同时也是重要的酿酒原料[1]。浓香大曲在入库贮藏前需经历约30 d的培菌过程。此过程中,受温湿度等环境条件动态变化及大曲自身代谢活动影响,其内部微生物群落结构在升温期、顶温期和降温期等不同培菌阶段发生显著演替,并同步积累多种功能性酶和风味前体物质,对最终的酿酒品质具有决定性影响[2-3]。

小麦作为浓香大曲的主要原料,其类型差异可能影响大曲品质与微生物组成,进而影响其发酵特性[4]。根据小麦的硬度(角质率),可分为硬质小麦和软质小麦。其中,硬质小麦相对软质小麦通常具有角质化程度高、细粉率高、脂肪含量低、蛋白质含量高等特点[4-5]。这些源于原粮的理化特性差异,可能对大曲培菌过程中微生物的生长繁殖及其驱动的生化反应产生不同影响[6]。与此同时,培菌过程还受到温度、湿度等环境因子的驱动,这些因子促使微生物群落发生动态演替,进而调控酶活性、风味物质形成及功能微生物丰度等关键指标,最终影响基酒品质。由此可见,大曲培菌过程实质上受到原料特性与环境因子的双重调控。若在培菌工艺研究中仅关注环境因子对微生物演替的作用,而忽视原料特性(如小麦类型)对微生物群落的根本性塑造作用,则难以建立针对不同类型小麦的精细化制曲工艺,进而可能导致菌群失衡、代谢功能波动乃至大曲品质不稳定等问题。

针对上述问题,本研究选取软质小麦与硬质小麦分别制备浓香大曲,在标准化培菌工艺条件下,对其整个培菌过程(升温期、顶温期、降温期)进行系统性动态跟踪。研究采用扩增子高通量测序技术,解析培菌过程中微生物群落的演替特征,重点阐明大曲菌群结构演替与原料特性(软质/硬质)的响应关系,并识别其特征性优势菌群。同时,系统监测大曲关键理化指标(水分、酸度、酶活性等)的动态变化,旨在揭示微生物群落演替与理化性质变化的内在联系,阐明小麦硬度对大曲微生态系统形成的塑造作用,为浓香型白酒制曲原料选择和培菌工艺参数的精准调控提供理论基础,助力产品品质提升。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

软质与硬质小麦大曲,舍得酒业制曲车间。依据培菌工艺关键节点,于1、3、5、7、10、12、14、16、18、20、24、27 d取样。每个时间点随机选取曲房左下角、正中心及右上角3个位点,各取一块曲坯,粉碎后过40目筛(孔径0.45 mm),-20 ℃冷冻保存。软质与硬质小麦原粮理化特性见表1。

试剂:土壤DNA提取试剂盒,美国Omega Bio-tek公司。

1.2 仪器与设备

QL-861漩涡振荡器,江苏海门市麒麟医用仪器厂;ZWYR-D240恒温培养振荡器,上海智城分析仪器制造有限公司;Sorvall ST 16R高速冷冻离心机、NanoDrop 2000超微量分光光度计,美国Thermo Scientific公司;Mini Pro 300V Power Supply电泳仪,美国Major Science公司;ChemiDoc MP凝胶成像系统,美国Bio-Rad公司;Illumina NextSeq 2000高通量测序平台,美国Illumina公司。

1.3 实验方法

1.3.1 浓香型大曲的理化指标测定

参照轻工行业标准QB/T 4257—2011《酿酒大曲通用分析方法》测定水分、酸度、糖化力及液化力。

1.3.2 宏基因组DNA提取、PCR扩增和高通量测序

DNA提取:采用土壤DNA提取试剂盒(Omega Bio-tek,美国)从冷冻样品中提取总DNA,经超微量分光光度计检测DNA纯度(A260nm/A280nm=1.8～2.0)及浓度。

PCR扩增:使用引物338F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′),806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′);对细菌核糖体16S rRNA基因的V3-V4高变区进行扩增,1737F(5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′)和2043R(5′-GCTGCGTTCTTCATC-GATGC-3′)对真菌的内部转录间隔区(ITS1)进行扩增。PCR产物经纯化后构建文库,委托上海派森诺生物科技有限公司在Illumina NextSeq 2000测序平台(Illumina,San Diego,USA)对样本进行双端测序。

测序数据预处理:原始测序数据采用QIIME2(2019.4)流程中的DADA2插件进行处理,具体包括:对双端序列进行质量过滤、去噪、拼接以及去除嵌合体序列,最终获得扩增子序列变体(amplicon sequence variant, ASV)的特征表及其代表性序列。基于所得到的ASV特征表和序列信息,进行多项生物信息学分析与可视化,为后续统计分析提供高质量的数据基础。

1.4 数据处理及分析

采用Excel 2016对实验数据进行整理与分析;采用origin 2022对环境因子、大曲理化指标及微生物丰度绘制折线图和柱状图进行可视化;采用R 4.4.2 stats包对小麦理化指标进行t检验差异分析;采用R 4.4.2 vegan和ggplot 2包对微生物的α、β多样性进行可视化;采用R 4.4.2 Hmisc包进行微生物相关性计算,并采用gephi进行微生物共生网络可视化,用R 4.4.2 vegan和ggplot 2包进行环境因子和核心微生物间的冗余分析(redundancy analysis,RDA),采用pheatmap包对PICRUSt预测的酶基因丰度进行可视化。

2 结果与讨论

2.1 培菌环境因子分析

曲间温度与湿度是表征发酵进程及微生物代谢活性的关键环境因子(图1-a～图1-c)。培菌期间温度呈“上升-峰值-下降”趋势,湿度则呈现反向变化规律。依据温度特征,培菌过程划分为3个阶段:升温期(0～5 d),顶温期(6～15 d),降温期(16～27 d)。相较软质麦曲,硬质麦曲在升温期升温速率更快,但顶温值显著低于软质麦曲(硬质顶温:52.8 ℃,软质顶温:55.9 ℃,P<0.05),且降温期降温速率更快,两类麦曲在培菌末期均恢复至室温。硬质麦曲由于细粉率较高且蛋白质含量丰富,可能促进了好氧细菌前期快速增殖并释放大量代谢热;但其支链淀粉比例低可能导致可利用碳源受限,进而导致顶温期耐热微生物活性较弱,产热能力因此下降,最终导致降温速率加快[7-8]。综上,小麦理化特性可通过调控微生物代谢活动,显著影响培菌环境因子的动态变化。

2.2 大曲理化指标动态变化

水分与酸度是影响大曲微生物生长的核心理化参数。受高温蒸发驱动,2种大曲水分在培菌前期持续下降,中后期趋于稳定,末期硬质/软质麦曲水分分别为9.75%和10.81%,二者无显著差异(图2-a)。2种大曲酸度均呈现“快速上升-骤降-平稳”趋势(图2-b)。这可能是因为在培菌前期好氧微生物利用氨基酸及单糖产有机酸致使酸度激增,而在第7天进行“揭排”工艺后促使挥发性酸逸散,导致酸度回落;而在中后期,可能是产酸与挥发达到平衡,导致保持在平稳的趋势[9-10]。在培菌结束时,硬质麦曲酸度显著高于软质麦曲(硬质麦曲:1.02 mmol/10 g,软质0.86 mmol/10 g,P<0.05),这可能与降温期产酸菌持续活跃有关。

酶活性是评价大曲质量的关键指标,糖化酶和液化酶的活性共同决定浓香型白酒的发酵效能。硬质与软质麦曲初始糖化力无显著差异(图2-c)。在顶温期,2种大曲的糖化力迅速下降,这是可能因为温度过高使得霉菌活性受到抑制或部分酶失活。在降温期,硬质麦曲糖化力回升,软质麦曲糖化力维持在较低水平,培菌结束时硬质麦曲糖化力689.43 mg/(g·h)显著高于软质麦曲401.99 mg/(g·h)(P<0.05)[11-12]。这可能是因为硬质麦曲温度下降迅速,部分产糖化酶霉菌生长以及酶的积累。在培菌过程中液化力则呈和糖化力相反的趋势,2种大曲液化力逐渐上升,在顶温期达稳定状态,培菌结束时无显著差异(图2-d)。这可能是因为液化酶最适温度较高(中温α-淀粉酶≈60 ℃),且主要由耐热细菌(如Bacillus)分泌,故在高温期活性优势显著[13]。

2.3 微生物群落结构变化

2.3.1 微生物群落多样性特征

基于Shannon指数的α多样性分析表明(图3-a和图3-b),培菌过程中硬质与软质麦曲α多样性呈现显著差异。硬质麦曲真菌Shannon指数呈先下降后上升趋势,而软质麦曲则呈逐渐下降趋势。2种麦曲的真菌Shannon指数、糖化力均与湿度呈显著正相关(真菌Shannon指数vs湿度,r=0.52;糖化力vs湿度,r=0.78,P<0.05),液化力与湿度呈显著负相关(r=-0.60,P<0.05)(图4)。培菌初期,软质麦曲真菌Shannon指数更高,反映其原料携带的真菌复杂度与均匀度更优;升温期,2种大曲真菌Shannon指数迅速下降;在顶温期真菌Shannon维持在低水平,这进一步说明一些产糖化酶的非耐热菌可能在这个阶段大量衰亡;降温期,硬质真菌Shannon指数上升,而软质麦曲依然保持较低水平,这说明降温期若温度较高会继续抑制部分真菌活性,从而影响真菌群落的多样性。2种麦曲细菌Shannon指数在培菌过程中呈先上升再下降趋势,且与温度呈显著正相关(r=0.75,P<0.05),这进一步说明温度升高促进细菌的生长。除培菌末期外,硬质麦曲细菌Shannon指数始终高于软质麦曲,这表明硬质麦曲可能具有较丰富的功能。此外,通过NMDS分析微生物群落结构,发现硬/软质麦曲真菌群落结构高度相似(仅培菌首日分异显著),而细菌群落结构分异明显。

综上所述,硬/软质麦曲真菌群落结构差异较小,尽管起始群落(培菌首日)存在差异,但整个培菌过程中的群落结构演变更易受到制曲环境(如温度、湿度)的影响,进而影响糖化酶活性。相比之下,两者的细菌群落结构差异较大,且细菌多样性受温度影响显著,这与其液化力的变化密切相关。因此,在大曲生产培菌中可通过分别调控温度与湿度来定向干预细菌与真菌的群落动态,进而影响糖化力与液化力。

2.3.2 微生物互作网络结构差异

在阐明硬质与软质麦曲培菌过程中微生物结构动态变化的基础上,本研究进一步利用网络分析揭示了微生物间的互作关系(图5)。硬质麦曲与软质麦曲的真菌共生网络分别由16个和18个真菌属构成,网络内显著相关性对数分别为41对和44对。相较硬质麦曲,软质麦曲真菌网络展现出更高的平均度、图密度、平均聚类系数和较低的平均路径长度(表2),表明其真菌群落结构具有更高的复杂性;同时,软质麦曲真菌网络的模块化程度更高且网络直径更低,表示其群落结构稳定性亦优于硬质麦曲。此外,网络中的正相关性占比在软质麦曲(93.18%)显著高于硬质麦曲(80.49%)(图5-a和图5-b),表明软质麦曲真菌群落内协同作用更强[14]。在门水平上,软质麦曲真菌网络除包含硬质麦曲中主要的子囊菌门(Ascomycota)和毛霉门(Mucoromycota)成员外,还包含担子菌门(Basidiomycota)的代表,表示其制曲过程中微生物功能多样性更为丰富。

对细菌共生网络拓扑特征的分析显示(表2),与真菌网络相似,软质麦曲细菌网络亦较硬质麦曲更为复杂且稳定。硬质与软质麦曲的细菌网络分别包含41个和57个细菌属,显著相关性对数分别为46对和91对。网络中的正相关性占比极高,硬质麦曲为93.48%,而软质麦曲达到100%。这些细菌主要归属于变形菌门(Proteobacteria)、厚壁菌门(Firmicutes)、放线菌门(Actinobacteriota)和拟杆菌门(Bacteroidota)。值得注意的是,硬质麦曲中变形菌门占比最高(43.9%),而在软质麦曲中,变形菌门与厚壁菌门并列成为最主要的类群(占比均为33.3%)。

综上所述,硬质与软质麦曲的微生物互作网络存在显著差异。软质麦曲在真菌和细菌层面均展现出更为复杂且稳定的微生物群落结构,这有助于微生物群落在环境多变的窖池发酵体系中维持功能活性,进而促进丰富风味物质的形成。

2.4 培菌中微生物丰度变化

基于属水平前10微生物丰度分析(图6-a和图6-b),培菌初期,硬质与软质麦曲的优势真菌分别为曲霉属(Aspergillus)和帚枝霉属(Sarocladium)。Aspergillus作为大曲常见优势菌,可分泌淀粉酶、糖化酶等功能酶;而Sarocladium为非典型大曲优势菌,多源于土壤或植物环境[13]。至顶温期,两类麦曲真菌群落结构趋同,优势菌均为嗜热子囊菌属(Thermoascus)、嗜热真菌属(Thermomyces)及丝孢毕赤酵母属(Hyphopichia)或Aspergillus。其中,Thermoascus可产热稳定性内切葡聚糖酶及葡萄糖苷酶;Thermomyces可合成α-淀粉酶、葡萄糖淀粉酶等,促进淀粉降解;Hyphopichia则兼具糖化酶分泌及乙酸乙酯、苯乙醇等风味物质合成能力[15-17]。培菌结束时,硬质麦曲真菌群落多样性和均匀度相对较高(图3-a),优势菌为Aspergillus(14.83%)、Hyphopichia(11.71%)、假丝酵母属(Candida,11.44%)和Sarocladium(11.32%),其中Candida可分泌多种水解酶(脂肪酶、蛋白酶、淀粉酶等),提供风味前体物质[18];而软质麦曲则以耐热菌Thermoascus(55.66%)和Thermomyces(19.31%)为主。

细菌群落方面,培菌初始阶段硬质与软质麦曲的优势菌分别为葡萄球菌属(Staphylococcus)和泛菌属(Pantoea)。其中,Pantoea为大曲培菌初期常见微生物,可为其他菌群提供营养;Staphylococcus可分泌酯合成酶,促进己酸乙酯生成[11,19]。顶温期,两类麦曲的优势细菌均为魏斯氏菌属(Weissella)、Staphylococcus和芽孢杆菌属(Bacillus)。Weissella作为核心功能菌,兼具分泌糖苷水解酶、产酸调节微环境及提供风味前体的作用;耐热的Bacillus则能分泌淀粉酶、糖化酶、蛋白酶等功能酶,并合成吡嗪类风味物质[20-21]。培菌末期,硬质麦曲优势细菌为Weissella(55.72%)和Pantoea(19.63%);而软质麦曲因降温速率较慢,优势菌除Weissella(50.28%)外仍以耐热的Bacillus(9.97%)为主。

2.5 培菌过程中环境因子、理化指标和优势微生物响应关系

本研究进一步利用RDA解析硬质与软质麦曲培菌过程中环境因子、理化指标与优势微生物的互作关系(图7)。研究发现,硬/软质麦曲中,Aspergillus、Hyphopichia、Rhizopus、Candida及Sarocladium等真菌与糖化力、湿度、水分呈显著正相关(P<0.05),和温度呈显著负相关(P<0.05),且主要富集于升温期(图7-a和图7-b)。上述菌属已被证实可通过分泌淀粉酶、糖化酶协同驱动淀粉糖化进程,表明升温期真菌群落的协同作用直接促进了糖化酶合成。Thermomyces、Thermoascus及Rhizomucor等真菌则与液化力、温度呈显著正相关,主要分布于顶温期与降温期。值得注意的是,温度与湿度对硬质麦曲中糖化力/液化力相关真菌的影响强度显著高于软质麦曲(RDA轴解释率更高),暗示硬质曲真菌群落对环境因子的响应更为敏感。对于细菌而言,Staphylococcus、Pantoea等细菌与糖化力、水分、酸度显著正相关(P<0.05),这与前期研究揭示其协同产糖化酶微生物群落的互作机制一致;而Weissella、Bacillus则与液化力显著正相关(P<0.05),二者可通过分泌淀粉酶、糖苷水解酶参与大分子淀粉降解(图7-c和图7-d)。需强调的是,湿度与上述细菌丰度的相关性显著(尤其对硬质曲),温度的影响相对较弱。此外,酸度对硬质麦曲细菌群落的调控作用强于软质麦曲,表明曲坯理化特性差异可塑造菌群结构。

综上,温度与湿度是驱动麦曲微生物群落演替的关键环境因子,其通过调控优势菌属(如嗜热真菌、功能细菌)的丰度,直接影响糖化酶与液化酶的活性;且硬质麦曲微生物群落对环境因子的响应敏感性及与酶活的关联强度均显著高于软质麦曲,这为阐释两类麦曲的工艺适应性差异提供了微生物生态学依据。

2.6 培菌过程中关键酶基因变化

大曲富含多种参与碳水化合物代谢和乙醇发酵的酶。本研究利用PICRUSt对标记基因序列进行功能预测,分析了不同培菌时期功能酶基因相对丰度的变化(图8)。原料淀粉经α-淀粉酶和糖化酶水解生成葡萄糖;同时,纤维素被纤维素酶和β-葡萄糖苷酶降解为葡萄糖[22-23]。葡萄糖被微生物吸收后进入糖酵解途径,在己糖激酶、葡萄糖-6-磷酸异构酶等催化下转化为果糖-6-磷酸,进而经6-磷酸果糖激酶、丙酮酸激酶等作用生成丙酮酸[24-25]。在厌氧条件下,丙酮酸经醛脱氢酶、乙醇脱氢酶等催化生成乙醇;而在有氧条件下,丙酮酸则不可逆地转化为乙酰辅酶A,后者通过三羧酸循环彻底氧化为CO2和水[26]。

在真菌方面,硬质曲和软质曲中编码α-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶及β-葡萄糖苷酶的基因在培菌中后期相对丰度显著升高,这与液化酶活性的变化趋势相符(图8-b)。耐热真菌属Thermomyces和Thermoascus在高温环境下可分泌高活性且稳定的α-淀粉酶、葡萄糖淀粉酶、内切葡聚糖酶及葡萄糖苷酶等,是导致中后期液化酶活性增强的主要原因(表3)。此外,硬质曲中编码淀粉磷酸化酶的基因在培菌初期和末期呈现较高丰度。该酶催化淀粉分子α-1,4-糖苷键的磷酸解反应,从非还原端逐步释放葡萄糖-1-磷酸,此为糖代谢的关键中间产物。鉴于硬质麦曲富含更多以α-1,4-糖苷键连接、难降解的直链淀粉,其末期优势真菌Rhizopus分泌的淀粉磷酸化酶显著促进了糖化进程。同样,编码己糖激酶、6-磷酸果糖激酶和丙酮酸激酶的基因在培菌末期丰度较高,其中Saccharomycopsis和Aspergillus[27-28]是驱动糖酵解的核心真菌属(表3)。在细菌方面,硬质曲和软质曲中参与糖化过程的酶编码基因丰度主要集中在培菌前中期。值得注意的是,软质曲编码α-淀粉酶的基因在培菌后期仍维持较高丰度,这与Bacillus属细菌密切相关(图8-c,表4)。作为耐热细菌,Bacillus具有高效产淀粉酶和糖化酶的能力[29]。综上所述,大曲培菌过程中糖化及乙醇发酵相关功能酶由多种微生物协同分泌。随着培菌进程的推进,微生物群落发生显著演替,导致不同时期功能酶基因的分布模式呈现动态差异。

3 结论

本研究揭示了硬质与软质小麦大曲在培菌过程中环境因子、微生物群落演替及功能酶活性之间的协同变化规律。结果表明,温度和湿度是驱动微生物群落结构演替的核心环境调控因子。受其小麦理化特性影响(细粉率高、蛋白质含量高),硬质曲在升温期表现出更高的代谢活跃度;而软质曲则呈现更高的顶温值和更缓慢的降温过程,导致其微生物群落演替轨迹与硬质曲显著分化。培菌结束时,硬质曲以Aspergillus、Candida等真菌及Weissella、Pantoea等细菌为主导协同促进糖化酶合成,软质曲依赖耐热真菌Thermoascus、Thermomyces及细菌Bacillus维持液化酶活性。此外,液化酶相关基因丰度与液化酶变化同步,在培菌中后期达峰值;糖酵解关键酶基因末期富集,主要受Saccharomycopsis、Aspergillus驱动。进一步的分析表明,软质曲的微生物共生网络结构更为复杂且稳定;相比之下,硬质曲的菌群对环境因子(如温度、湿度)以及理化参数(如酸度)的响应更为敏感。基于上述功能差异,硬质小麦曲凭借其高效的糖化能力,适于在酿酒过程中承担发酵启动的关键角色;而软质小麦曲则依托其出色的热稳定性与持续的液化功能,成为高温或长期发酵体系中保障发酵效率与稳定性的核心要素。综上,小麦理化特性通过调控微生物代谢热效应与群落演替,影响大曲培菌微环境动态及酶功能表达。该结论为优化大曲生产工艺提供了理论依据,对食品发酵行业技术发展具有指导意义。

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Investigating the influence mechanism of wheat type on microbial incubation dynamics in Nongxiang Daqu

YAO Weike, PU Jizhou, WANG Jun, GUO Huixiang, YU Shengling, CHEN Wenjun, YANG Dailin*

(Shede Spirits Co. Ltd., Shehong 629209, China)

ABSTRACT To investigate the mechanisms underlying the influence of wheat type on the microbial incubation process of Nongxiang-flavor Daqu, this study selected hard wheat (HW) and soft wheat (SW) as raw materials for Daqu production.By dynamically monitoring the incubation process and combining microbiome and physicochemical analyses, we systematically elucidated the interrelationships among environmental factors, microbial community structure, and enzymatic activity.The results showed that, compared with SW Daqu, HW Daqu exhibited more rapid temperature fluctuations and a lower peak temperature during incubation.Although no significant differences in physicochemical parameters were observed between the two Daqu types during most of the cultivation period, by the end of incubation, HW Daqu showed significantly higher acidity and saccharification power than SW Daqu.Microbiome analysis revealed that fungal diversity in HW Daqu markedly rebounded in the later incubation stages, with Aspergillus (14.83%) and Candida (11.44%) emerging as dominant genera.In contrast, the SW Daqu showed low fungal diversity, with predominantly thermophilic fungi, including Thermoascus (55.66%) and Thermomyces (19.31%).Bacterial diversity in both Daqu types followed a similar pattern:an initial increase followed by a decline, with consistently higher diversity in HW Daqu.The final bacterial community in the HW Daqu was dominated by Weissella (55.72%) and Pantoea (19.63%), whereas the SW Daqu was primarily composed of Weissella (50.28%) and Bacillus (9.97%).Network topology analysis indicated that SW Daqu possessed a more complex microbial co-occurrence structure, suggesting potentially greater functional stability during subsequent pit fermentation.Redundancy analysis (RDA) further identified temperature and humidity as the key environmental drivers shaping microbial succession and demonstrated that the microbial assemblage in HW Daqu was more sensitive to environmental fluctuation.This study elucidates the mechanism by which wheat’s physicochemical properties influence Daqu quality by modulating microbial metabolism and community structure.The findings provide a theoretical foundation for optimizing raw material selection and fermentation parameters in Daqu production.

Key words hard wheat;soft wheat;Nongxiang Daqu;physicochemical indexes;microbial community structure;mechanism analysis

DOI：10.13995/j.cnki.11-1802/ts.044803

引用格式：姚伟科,蒲吉洲,王军,等.小麦类型对浓香型白酒大曲培菌过程影响机制研究[J].食品与发酵工业,2026,52(13):122-132.YAO Weike, PU Jizhou, WANG Jun, et al.Investigating the influence mechanism of wheat type on microbial incubation dynamics in Nongxiang Daqu[J].Food and Fermentation Industries,2026,52(13):122-132.

第一作者：硕士,助理工程师(杨岱霖工程师为通信作者,E-mail:yangdailin65@outlook.com)

基金项目：中国生态酿酒产研院开放基金项目(SD-ST-015)

收稿日期：2025-10-14,改回日期:2025-12-10