黑米富含多种生物活性成分,具有抗氧化、抗炎等功能,以其为原料开发的米乳饮料符合当前健康饮料的消费趋势。研究表明,通过益生菌发酵可有效提高黑米的营养价值[1-2],然而,液态发酵型米乳存在保质期短、贮藏与运输不便等问题。因此,将液态米乳喷雾干燥制备成固体饮料,可以提高产品便携性,降低运输成本,但益生菌对温度、pH等敏感,容易失活[2-3]。
喷雾干燥是将悬浊液、溶液、乳液经过雾化处理后高温瞬时干燥的方法,具有干燥速度快、产品质量高、适用范围广等优点[3]。然而,使用喷雾干燥制备活菌营养产品存在挑战,尤其是对于“热敏感”益生菌菌株。由于温度高和接触面积大,蒸发迅速,微生物在喷雾干燥过程中同时受到热、渗透和氧化应激等影响,容易导致不可逆细胞死亡,其中脱水和高温引起的失活是主要因素[4]。因此,通过适合的包埋技术保护益生菌,减少益生菌干燥过程中的失活率,可以提升产品价值。
复合凝聚法是一种基于正负电荷高分子间静电相互作用的高效微胶囊包埋技术。该方法可在特定pH下诱导明胶(gelatin,GE)与阿拉伯胶(gum arabic,GA)等壁材形成复合相膜层,将芯材包裹于微囊内,从而在微观层面形成致密的保护屏障[5]。GA属于杂多糖,具有优异的乳化与稳定性能,在pH>2.2时带负电荷;GE则具有良好的成膜性和生物相容性,等电点在4.5～5.5,当pH值低于等电点时,GE主要带正电。在特定pH环境,GE和GA通过静电相互作用而复合凝聚、包裹芯材形成稳定复合物[6]。研究表明,复合凝聚法能将易挥发的风味物质包裹在微胶囊中,减少加工和贮存过程中的风味损失,实现风味物质的缓释[7]。复合凝聚法通过微胶囊化酶,提高酶稳定性和利用率,提升酶催化效果[8]。此外,复合凝聚法能包埋多酚、维生素等营养元素,提高其稳定性和利用度[9]。因此两者复合形成的结构均一、力学强度高壁材,对益生菌保护具有显著优势。尽管复合凝聚法在食品微胶囊化中已有应用,但其在谷物发酵饮品中用于益生菌保护的研究仍较少。
基于此,本论文以米麴与干酪乳酪杆菌发酵制备的黑米乳为原料,采用GE/GA复合凝聚技术包埋乳酸菌,通过喷雾干燥制得发酵型黑米乳粉,系统分析复合凝聚对米乳粉益生菌活性、结晶结构、复溶性及流变性质的影响,旨在阐明GE/GA复合体系对益生菌的保护机理及其在谷物发酵饮料工业化中的应用潜力。
1 材料与方法
1.1 主要材料与试剂
黑稻(紫玉莲香)于2022年7月在广西采收,干燥后真空包装,-20 ℃冷藏。米麴为本团队筛选的米曲霉,保藏于中国典型培养物保藏中心,保藏号为CCTCCM2023533。干酪乳酪杆菌(Lacticaseibacillus casei)LC 89,微康益生菌(苏州)股份有限公司;GE,武汉慕丰生物科技有限公司;GA,上海新联纺进出口有限公司;MRS固体培养基,广东中山百微生物技术有限公司;其余试剂为分析纯或色谱纯,广东西陇化工股份有限公司。
1.2 主要仪器与设备
LPG-5高速离心喷雾干燥机,中国常州通干干燥工程有限公司;ULTS1651 -80 ℃超低温冰箱,美国赛默飞世尔(苏州)仪器有限公司;LDZX-50KBS压力蒸气灭菌锅,中国上海申安医疗机械厂;MAX-A20001电子天平,中国五鑫衡器有限公司;SW-CJ-2D超净台工作台,中国苏州净化设备有限公司;SHP-250智能生化培养箱,中国上海鸿都电子科技有限公司;MCR302流变仪,安东帕集团。
1.3 实验方法
1.3.1 发酵型黑米乳的制备
取1 kg黑米和1.5 kg饮用水,100 ℃加热30 min后,加入4 g米曲霉(3.5×108 CFU/g),拌匀,置于培养箱(32 ℃,相对湿度90%)发酵40 h后,加入5 L纯净水,搅拌均匀,60 ℃发酵1 h,然后无菌接入15 mL干酪乳酪杆菌(5.6×109 CFU/mL),40 ℃发酵12 h,得到发酵型黑米乳(图1)。
图1 基于GE-GA静电互作的复合凝聚形成黑米乳微囊化的示意图
Fig.1 Schematic illustration of the microencapsulation of black rice milk via gelatin-gum arabic complex coacervation based on electrostatic interactions
1.3.2 发酵型黑米乳粉的制备
称取1 kg发酵型黑米乳,分别添加20 g GE、60 g GA、20 g GE+60 g GA,分别命名为GE组、GA组、GEGA组,对照组不添加GE和GA;各组样品分别600 r/min搅拌5 min,然后进行喷雾干燥,进风风量100%,进风温度为115 ℃,收集黑米乳粉(图1),贮存于4 ℃冰箱。
1.3.3 乳酸菌活菌数测定
采用平板计数法进行测定。样品经过生理盐水梯度稀释后,每个稀释度取0.1 mL样液置于灭菌MRS固体培养皿后涂布,37 ℃培养24～48 h。选取菌落数为30～300 CFU的平板进行计数。对贮藏0、90、180、210 d的活菌数进行测定,结果以lg CFU/mL表示[10]。
1.3.4 水分含量
参考LI等[11]的方法测定固体饮料的水分含量。将称量瓶放入105 ℃干燥箱中,干燥至恒重。称取2 g粉末放入已恒重的称量瓶中,再置于105 ℃干燥箱中干燥,直至连续2次称量的质量差不超过2 mg,此时认为样品已达到恒重。试样中水分含量的计算如公式(1)所示:
(1)
式中:X,水分含量,%;m1,称量瓶和样品的质量,g;m2,称量瓶和样品干燥后的质量,g;m3,称量瓶的质量,g。
1.3.5 吸湿性
参考LI等[11]的方法,将干燥至恒重的称量瓶取出,准确称入0.5 g样品,放入25 ℃、相对湿度为75%的恒温恒湿箱内,培养箱内置200 mL饱和NaCl溶液,2 d后取出称重,计算吸湿性。吸湿性表示为每100 g粉末吸收的水分质量,按公式(2)计算。
(2)
式中:H,吸湿性,%;m1,菌粉放置前的质量,g;m2,菌粉吸收水分后的质量,g。
1.3.6 微观结构
样品用导电双面胶固定后喷金,在5 kV的加速电压下,采用扫描电子显微镜进行拍摄。
1.3.7 长程晶体结构测定
广角X射线衍射仪(X-ray diffractometer,XRD)用于测定长程晶体结构。衍射强度的扫描范围设定为5～35 °(2θ),扫描速度为0.02 °/s。衍射图通过Jade 6.0软件采集,相对结晶度(%)根据衍射图中结晶区域面积与总面积的比值进行计算[12]。
1.3.8 发酵型黑米乳粉的复溶稳定性分析
称取10 g黑米乳粉,加入40 mL温水(60 ℃),搅拌均匀制得复溶米乳饮料;量取10 mL米乳饮料,称量质量(g),然后转入离心管内,3 500 r/min离心10 min,去除上清液,称量沉淀物质量(g)。离心沉淀率的计算如公式(3)所示。
离心沉淀率
(3)
1.3.9 复溶饮料流变性质
使用流变仪对其进行分析。将2.5 mL复溶米乳饮料样品放于平行板中间,设置其间隙为1 mm,测量温度为25 ℃,在测试前先静置5 min,在样品边缘涂上1层硅油防止水分蒸发;在剪切速率为0.1～100 s-1进行测试,温度为25 ℃,得出随剪切速率变化的表观黏度(η)曲线[13]。
1.4 数据统计与分析
所有的实验进行3次独立重复操作,采用SPSS 27.0软件对数据进行单因素ANOVA分析(Duncan’s),显著性水平设定为P<0.05,结果以“平均值±标准偏差”表示;采用Origin 2021绘制图表。
2 结果与分析
2.1 黑米乳粉的乳酸菌活菌数
如图2-a所示,GEGA组的活菌数最高,为6.53 lg CFU/g,比喷雾干燥前的米乳饮料仅降低1.05 lg CFU/g,其次为GE组、GA组,而对照组活菌数大幅降低,为3.38 lg CFU/g。喷雾干燥过程中对照组益生菌严重失活可能是高温环境、乳酸菌脱水和细胞结构损伤等原因造成的[14]。从图2-a可知,GE组、GA组菌活性高于对照组,可能是GE和GA在益生菌表面形成一层连续的保护膜,可以有效阻挡危害因素直接接触益生菌,减少细胞因外界刺激而受损的几率[13]。GA是一种杂多糖,可以很好地覆盖在乳酸菌上,减少喷雾干燥对益生菌热传递[15]。经过喷雾干燥后益生菌活性最高的组为GEGA组,可能是GE和GA的静电互作形成了微胶囊结构,为乳酸菌提供了保护屏障,从而削弱了外部环境的恶劣影响[16]。
a-乳酸菌米乳粉的乳酸菌活菌数;b-GEGA组贮藏过程中的活菌数
图2 乳酸菌米乳粉的乳酸菌活菌数和GEGA组贮藏过程中的活菌数变化
Fig.2 Viable counts of Lactobacillus in lactic acid bacteria rice milk powder and changes in viable counts during storage in the GEGA group
注:不同小写字母表示差异显著(P<0.05)(下同)。
2.2 黑米乳粉贮藏过程中的乳酸菌活菌数
微胶囊化可以为益生菌提供保护,减少外界对益生菌的伤害,维持其活性[17]。然而,乳酸菌容易失活,贮藏温度对乳酸菌稳定性的影响显著[17]。如图2-b所示,-20 ℃和4 ℃贮藏条件下,益生菌的活菌数量相对稳定,其中,-20 ℃贮藏90 d、4 ℃ 60 d,黑米乳粉的乳酸菌活菌数高于6 lg CFU/mL;常温贮存(25 ℃)时,乳酸菌的稳定性急剧下降,贮藏120 d后乳酸菌活菌数已不足3 lg CFU/mL,这可能是由于本研究使用的干酪乳酪杆菌在米乳粉中较难存活。ALVES等[17]使用藻酸盐和玉米淀粉作为壁材封装植物乳植杆菌,发现在室温下贮存30 d后,乳酸菌活菌数显著减少,作者认为这是由于乳酸菌在接近22 ℃环境下的代谢活动更快,产生的代谢物会加速乳酸菌死亡,而在低温储存时,益生菌代谢活动低,更有利于贮藏活菌型米乳粉[17-18]。
2.3 黑米乳粉的水分含量
水分含量是评价粉末保质期和贮存稳定性的关键指标。由图3-a可知,对照组的水分含量最高为7.22%,GE组、GA组、GEGA组的水分含量分别为3.02%、1.71%、3.50%,这说明添加了GE和GA降低了黑米乳粉的水分含量(P<0.05)。高水分含量可能加速微生物污染,有害微生物与乳酸菌竞争营养物质最终导致益生菌活力降低,较低的水分含量可以有效避免贮存过程中的微生物污染、脂质氧化和微胶囊的凝聚问题,低水分含量减少了包埋内材料的接触面积,限制了分子的流动性,有效地阻碍了微胶囊由于水分含量过高而凝聚在一起[18-20]。水分含量3%～5%是微生物和化学稳定性的最佳选择,有利于菌粉长期贮存的稳定性,可以有效延长益生菌粉的保质期[21]。由此,GEGA组米乳粉的水分含量在适宜范围内,适合长期贮存。
a-水分含量;b-吸湿性
图3 发酵型黑米乳粉的水分含量和吸湿性
Fig.3 Moisture content and hygroscopicity of fermented black rice milk powder
2.4 黑米乳粉的吸湿性
吸湿性也是粉末产品贮存的关键参数,菌粉的吸湿性直接影响贮藏稳定性。一般来说,较高的吸湿性会导致微胶囊的聚集或团聚,从而降低微胶囊的质量并破坏贮存中的活性物质[22]。粉末吸湿性的高低取决于食物结构中存在的亲水基团的数量,这些亲水基团能够与周围空气中存在的水分子结合[23]。从图3-b中可知,对照组吸湿性为22.49%,添加了GE、GA后的吸湿性略有上升,分别为24.96%、23.70%,GEGA组为22.28%。吸湿性的这种变化可归因于GA的化学结构,GA具有大量的亲水基团分支,而亲水基团含有较短链和更多的亲水基团[24]。因此GA粉末容易与周围空气中的水分子结合,而GE组米乳粉形成海绵状结构的能力可能会导致更高的水分含量[24]。
2.5 黑米乳粉的微观结构
如图4扫描电镜图可知,喷雾干燥后的黑米乳粉颗粒均呈球形,对照组、GE组、GA组米乳粉的形状相对不规则,且有明显的褶皱;粉末表面出现褶皱的主要原因是喷雾干燥的高温导致微胶囊迅速脱水,致使颗粒凹陷[15];与此不同,GEGA组的颗粒表面更为光滑,可能是GE和GA的静电互作形成了更为圆润规则的微胶囊,造成在喷雾干燥过程中GEGA颗粒的褶皱少、凹陷更不明显,这或有助于保护益生菌。
a-对照组;b-GE组;c-GA组;d-GEGA组
图4 黑米乳粉的微观结构
Fig.4 Microstructure of black rice milk powder
2.6 黑米乳粉的长程晶体结构
通过X射线衍射测定黑米乳粉的长程结构并计算其相对结晶度,结果如图5-a所示,各组样品在2θ≈20°附近均出现尖峰,表明样品主要为部分无定形结构。通过计算得出对照组的结晶度为7.76%,GE组、GA组以及GEGA组的结晶度分别为8.40%、8.61%和8.98%,与对照组相比,GEGA组衍射峰强度略增强且峰形更尖锐,结晶度高于其他组,表明通过GE和GA的静电相互作用形成了更有序的分子排列结构,GE的线性多肽链和GA的支化多糖网络可能通过协同交联作用增强了壁材分子堆砌的有序性与致密性,从而在喷雾干燥过程中形成更稳定的保护屏障[19],这种结构有序性的提升也提高了GEGA组的活菌数和贮藏稳定性。
a-XRD图;b-复溶饮品的乳酸菌活菌数
图5 黑米乳粉的XRD图和复溶饮品的乳酸菌活菌数
Fig.5 XRD pattern of black rice milk powder and viable counts of lactic acid bacteria in the redissolved beverage
2.7 黑米乳粉的复溶饮料活菌数
复溶饮料的活菌数是评价喷雾干燥米乳粉在实际应用中的重要指标。如图5-b所示,不同处理组中GEGA组活菌数最高,为6.33 lg CFU/mL,这表明GE和GA形成的微胶囊结构降低了喷雾干燥过程中高温对益生菌的损害作用,提高了益生菌的存活率(P<0.05),GE组、GA组分别为4.40、4.18 lg CFU/mL,这说明GE、GA也能对益生菌起到一定的保护作用,而对照组的菌活最低,仅为3.00 lg CFU/mL,这可能是没有多糖保护的情况下,乳杆菌在喷雾干燥的高温脱水过程中受到了较大的损伤,最终导致其在复溶饮料中的存活率降低[19]。
2.8 黑米乳粉的复溶饮料稳定性
离心沉淀率指在离心力作用下液体中的固体颗粒沉降到底部的速率或程度,常用于评估饮料、乳制品等液体食品的稳定性,离心沉淀率越高,意味着更多的固体成分沉降,液体饮料的稳定性越差,这会影响产品的保质期和口感。从图6-a可看出,不同组复溶米乳饮料的离心沉淀率有显著差异,对照组的离心沉淀率最高,GEGA组的米乳饮料离心沉淀率为17.51%,稳定性显著提高,这可能是由于GE和GA的静电相互作用使米乳饮料有良好的稳定性,可以减少颗粒间的聚集和沉降[25]。
a-离心稳定性;b-流变性质
图6 黑米乳粉复溶饮料的离心稳定性和流变性质
Fig.6 Centrifugal stability and rheological properties of redissolved black rice milk beverage
2.9 黑米乳粉复溶饮料流变性质
流变性质不仅可以评估复溶饮料的稳定性,还可以作为饮料质地和口感的评价指标。如图6-b所示,所有样品的黏度在1～100 s-1范围内均随着剪切速率的增加而逐渐降低,表现出剪切稀化现象,这是一种典型的非牛顿剪切稀化行为,该现象是由于剪切作用下多糖链与蛋白质分子间的缠结被破坏,体系结构松弛,从而导致黏度下降,在这种情况下,随着剪切速率的增加,米乳的内部结构可能会被剪切过程中增加的剪切力改变,从而影响其流变性质[26]。如图6-b可知,添加GE和GA均会影响饮品黏度,其中GEGA组表现出最高黏度与最显著的稀化特征,说明其网络结构更致密、粒子分布更均匀,能有效提升饮料的质地与稳定性。
3 结论与讨论
黑米富含花青素、类黄酮、膳食纤维等营养活性物质,具有抗炎、增强免疫能力等生理功能,以黑米为主要原料开发的米乳固体饮料符合当代饮品生产和消费趋势。目前,益生菌发酵饮料市场越来越大,而活菌饮料因其良好的益生功能,更是受到消费者的喜爱,通过益生菌发酵可以提升黑米乳的营养价值,但黑米乳保质期短,直接喷雾干燥又容易导致益生菌大量死亡。因此,本研究采用米麴和干酪乳酪杆菌发酵制备发酵型黑米乳,通过GE与GA的静电吸附作用进行复合凝聚,制得的优质乳酸菌黑米乳粉不仅结晶度高、结构致密,所含乳杆菌活菌数高、贮藏稳定性好,复溶后益生菌活菌数符合国家要求,且离心沉淀率低、流动性良好。随着人们对绿色健康的不断追求,消费者对营养饮料的需求会不断增高,本文所述的GE/GA复合凝聚法可以通过核壳结构为益生菌提供良好保护,提升益生菌在产品中的存活率和稳定性,生产的益生菌米乳粉不仅缓解了活菌饮料保存难的困境,还解决了高温干燥过程益生菌损失严重的问题,可为活菌型米乳粉的工业化生产提供技术支撑。
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