γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid,GABA)为一种抑制性神经递质,是一种天然的、自身不能合成蛋白的氨基酸,具有独特的生理功能如改善睡眠、抗抑郁症、降血糖、降血压、防止动脉硬化和改善肝、肾脏功能等[1]。GABA在2009年被我国卫生部列为新资源食品后,其发展和使用受到越来越多的关注[2]。目前GABA制备主要以化学合成、生物催化、微生物发酵等方式进行[3]。微生物发酵法是利用微生物细胞内源性的谷氨酸脱羧酶(glutamic acid decarboxylase,GAD),催化L-谷氨酸脱羧,生成GABA和CO2,制备过程成本低、工艺简单,相较于其他方法更易于规模化生产[4]。酵母、乳酸菌、真菌等多种微生物都具有合成GABA的能力,并主要通过GAD途径催化生成。
乳酸菌是公认安全的食品微生物,在发酵过程中能产生GABA,因此被广泛应用于发酵食品、保健品和药物开发中[5]。KWON等[6]首次以植物乳植杆菌KS2020和柠檬明串珠菌S5为菌种,通过串联共发酵开发了1款GABA强化泡菜功能饮料,GABA含量为2.6%。BUATONG等[7]以植物乳植杆菌L42 g作为高效发酵剂,生产具有抗氧化和抗菌等功能的杏仁、薏苡仁植物发酵饮料,GABA含量为496.7 μg/mL。莫小群等[8]以香蕉为原料,采用植物乳植杆菌和短乳杆菌进行混合发酵,得到一种富含GABA的益生菌香蕉发酵饮料,GABA含量为0.783 mg/mL;陈世培[9]从泡菜中筛选出1株高产GABA的植物乳植杆菌NCU001051,用该菌株生产出1款健康营养美味且富含GABA的胡萝卜发酵饮料,GABA含量为0.69 g/L。
番木瓜(Carica papaya L.)又名木瓜,是著名的热带亚热带水果之一,属药食兼用水果,富含糖类、黄酮类、萜烯类、生物碱和木瓜蛋白酶等多种营养成分和生物活性物质,具有抗肿瘤、增强免疫调节等作用,因此具有较高的营养价值和经济价值,其产业发展前景十分广阔[10]。但番木瓜属于呼吸跃变型果实,采后极容易变黄、软化导致腐烂,货架期较短。因此,除鲜食外,深加工是提升番木瓜经济价值的重要途径之一[11]。例如,番木瓜可作为加工果汁、发酵饮料、果酒、果酱、酱菜和酶制剂等产品的原料。利用乳酸菌发酵番木瓜汁,能有效改变饮品的风味特征及营养成分,为番木瓜高值化利用提供重要途径。在发酵过程中,菌种是平衡饮品风味特征与异味控制的关键因素。本课题组前期从发酵泡菜、发酵乳制品中已获得3株具有较好合成GABA能力及较优发酵特性的植物乳植杆菌LM2、LS2、LN3,其GABA产量分别为1.20、1.53、0.71 g/L。然而,这3株菌株在实际应用中是否具有改善发酵饮品GABA、品质及风味的能力还不清楚。因此,本文采用产GABA的植物乳植杆菌LM2、LS2、LN3分别接种发酵番木瓜汁,并测定发酵番木瓜汁的理化品质、活性成分、有机酸、抗氧化能力、挥发性风味物质等,探究产GABA植物乳植杆菌对发酵番木瓜汁品质及风味的影响,以期为开发1款新型功能性健康饮品提供科学依据和技术支持。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
植物乳植杆菌菌株,广西果蔬贮藏与加工新技术重点实验室保藏菌种(编号:LM2、LS2、LN3);番木瓜,广西南宁市武鸣区里建基地,地理坐标为北纬23°14′46″,东经为108°3′6″;己烷、丙酮、甲醇、石油醚、乙醇、苯酚、次氯酸钠(分析纯),国药集团化学试剂有限公司;β-胡萝卜素、没食子酸标准品(纯度>98%、色谱级),上海源叶生物科技有限公司。
1.2 仪器与设备
57330-U SPME装置手柄、固定搭载装置、57328-U 双极性50/30 μm二乙烯基苯/碳分子筛/聚二甲基硅氧烷(divinylbenzene/carboxen/polydimethylsiloxane,DVB/CAR/PDMS)萃取头,美国Supelco公司;Agilent 7890A-5975C GC-MS、Agilent 1260 Infinity HPLC,美国Agilent公司;D-37520型高速冷冻离心机,德国赛默飞世尔有限公司;TU-1810紫外可见分光光度计,北京普析通用仪器有限责任公司;离子PTP-IV-30型实验室超纯水机,广州品业仪器设备有限公司。
1.3 实验方法
1.3.1 番木瓜发酵饮料的制备
基于前期大量预实验,番木瓜发酵汁的制备工艺如下:挑选完好、无腐烂的8～9成熟番木瓜,清洗后去皮、去籽,切块加水打浆(木瓜∶水=1∶1.5,质量比)后过滤(400目),用白砂糖调配至固形物含量6%,按质量分数加入5%全脂牛奶、5 g/L的L-谷氨酸,在100 ℃加热5 min进行灭菌处理,按发酵液质量的4%接种量分别接种植物乳植杆菌LM2、LS2、LN3,37 ℃恒温培养72 h。未发酵(CK)和发酵样品经过滤后,滤液于-80 ℃冷冻备用。
1.3.2 pH、总酸和还原糖的测定
使用pH计测定pH值;总酸含量采用GB 12456—2021《食品安全国家标准 食品中总酸的测定(含第1号修改单)》中的pH计电位滴定法测定;还原糖含量采用GB 5009.7—2016《食品安全国家标准 食品中还原糖的测定》中3,5-二硝基水杨酸比色法测定。
1.3.3 类胡萝卜素的测定
参考CARBONELL-CAPELLA等[12]所述方法并稍有改动:取1.0 mL的样品,加入5.0 mL的萃取溶剂(己烷∶丙酮∶甲醇=2∶1∶1,体积比)摇匀放置在25 ℃下避光100 r/min振荡30 min,然后于4 ℃条件下,6 000 r/min离心10 min,将最上层溶液转移到容量瓶,用己烷定容,于450 nm波长处测定吸光度。
1.3.4 总酚的测定
参考ZHENG等[13]的方法并稍有改动:取4.0 g样品加入40.0 mL体积分数50%乙醇溶液提取样品后,收集上清液即为提取液。取1.0 mL提取液、5.0 mL水和1.0 mL福林酚试剂混合,于暗处反应5 min,然后加入3.0 mL体积分数20% Na2CO3溶液混匀后在30 ℃条件下避光反应60 min,于765 nm波长处测定吸光度值,以没食子酸为标准品,求得线性吸光度值回归方程为y=0.111 9x+0.006 7(R2=0.999 2)。
1.3.5 GABA的测定
参考肖君荣[14]的方法:采用Berthelot比色法测定。取样品0.2 mL,加入2.0 mL 0.1 mol/L四硼酸钠缓冲液,1.0 mL体积分数为6%的苯酚溶液,混匀,在5 min内加入1.0 mL 体积分数10%次氯酸钠溶液,振荡混匀,沸水浴10 min后置于冰浴中20 min,待溶液出现蓝绿色后,加入2.0 mL体积分数60%乙醇溶液。振荡均匀,静置后于645 nm波长处测定其吸光值。
1.3.6 有机酸测定
参考叶秀娟等[15]的方法并稍有改动:取5.0 g样品匀浆,加入40.0 mL超纯水,超声波处理30 min后,定容至50.0 mL。经10 000 r/min离心15 min,取上清液经0.22 μm水性滤膜过滤后用于HPLC分析。色谱条件:色谱柱为微纯MicroPulitePerfect T3(4.6 mm×250 mm,5 μm),流动相为0.01 mol/L KH2PO4水溶液(用磷酸调pH值为2.80)和体积分数1.5%甲醇溶液,流速0.5 mL/min,柱温30 ℃;进样量10.0 μL,检测波长210 nm。
1.3.7 抗氧化能力的测定
DPPH自由基清除能力的测定参考李昌宝等[16]所述方法并稍有改动:取1.0 mL样品,加入2.0 mL 0.1 mmol/L DPPH溶液,充分均匀后避光放置30 min,在517 nm处测定其吸光值。
ABTS阳离子自由基清除能力的测定参考JAKUBCZYK等[17]所述方法并稍有改动:取1.0 mL样品,加入ABTS溶液2.0 mL,混合均匀后避光放置30 min,在734 nm处测定其吸光值。
1.3.8 挥发性风味物质的测定
参考辛明等[18]的方法测定并稍有改动:取搅匀的样品2.5 mL于20 mL萃取瓶中,加入1.0 g NaCl,加入10.0 μL 7.71 μg/mL 2-辛醇溶液作为内标物。将萃取头插入样品瓶顶空部分,于40 ℃吸附30 min,取出吸附后的萃取头,插入GC-MS进样口。GC-MS分析条件:DB-WAX MS毛细管柱(30 m×0.25 mm,0.25 μm),进样温度260 ℃,无分流,载气为氦气(99.999%),流量1 mL/min;升温程序为40 ℃保持5 min,然后以8 ℃/min线性升温至90 ℃,10 ℃/min线性升温至250 ℃,在此温度下保持5 min;离子化方式为电子轰击电离,离子源温度230 ℃,电子能量80 eV,接口温度280 ℃;全扫描方式,扫描质量范围35～350 U;对照NIST 2014谱库进行数据分析。
1.3.9 感官评价
采用定量描述分析法对番木瓜发酵汁进行感官评价。评价小组由10名经过筛选和培训的专业感官评价员组成(5名男性,5名女性;年龄范围25～40岁)。评价项目包括色泽、气味、口感、组织状态,每个感官项目的得分范围0～30分,4项总分100分(表1)。在正式感官评价之前对品评小组进行培训,使全部品评人员熟悉感官评分标准且水平达到一致。
表1 感官品质评分标准
Table 1 The sensory quality scoring criteria
感官项目评定标准分值/分色泽(20分)色泽均匀,颜色明亮、呈橙红色16～20色泽较均匀,颜色呈橙黄色或偏暗6～15色泽不均匀,颜色暗淡无光泽1～5气味(30分)具有番木瓜香味,气味协调,无异味21～30番木瓜香味较淡,气味协调,无异味10～20无番木瓜香味,气味协调,有异味1～9口感(30分)酸甜适中,口感细腻,无苦涩味21～30酸甜比例一般,口感一般,无苦涩味10～20酸甜比例不协调,口感较差,带有苦涩味1～9组织状态(20分)均匀一致,无分层,无沉淀或有轻微沉淀16～20无分层,底部有沉淀6～15稍有分层,底部沉淀明显1～5
1.4 数据处理
所有数据为3次以上重复实验的“平均值±标准差”;使用SPSS 22.0、GraphPad Prism 9.5.0软件进行统计分析、绘图;利用邓肯多重比较法对数据间进行差异显著性分析,P<0.05表示差异显著。
2 结果与分析
2.1 番木瓜发酵汁理化指标分析
pH值与酸度是菌种发酵特性的重要指标,它们能直接影响发酵饮品的感官品质。由表2可知,与CK组相比,LM2、LS2、LN3组的pH值均显著降低(P<0.05),pH值在3.42～3.46,均符合发酵饮料标准(pH≤4.5),其中LS2的pH值最低为3.42。发酵后的pH值降低可能是由乳酸菌代谢产生有机酸导致的。CK组总酸含量为0.79 g/L,发酵后LM2、LS2、LN3组均显著升高(P<0.05),总酸含量在4.78～5.83 g/L,其中LS2的总酸含量最高为5.83 g/L。LI等[19]采用植物乳植杆菌发酵苹果汁,由于苹果中的糖被植物乳植杆菌发酵产生酸,pH值呈下降趋势,总酸含量呈上升趋势,这与本文的研究结果一致。LM2、LS2、LN3组的总酸含量与pH值呈负相关,这与KAPRASOB等[20]、史晴晴等[21]的研究一致,即pH越低,总酸含量越高。
表2 不同发酵菌种对番木瓜汁理化指标的影响
Table 2 Effects of different fermentation strains on physicochemical indexes of papaya juice
指标CKLM2LS2LN3pH5.02±0.01a3.45±0.02b3.42±0.01c3.46±0.01bc总酸/(g/L)0.79±0.01d5.08±0.12b5.83±0.16a4.78±0.12c还原糖/(mg/100 g)12.22±0.24a8.28±0.11b6.73±0.27c6.38±0.06c类胡萝卜素/(mg/g)6.35±0.33a4.20±0.32b4.14±0.12b4.34±0.23b总酚/(mg/kg)8.03±0.33b24.63±0.61a24.15±0.38a24.70±0.65a
注：表中组间不同小写字母表示差异显著(P<0.05)(下同)。
糖类物质在微生物发酵过程中充当主要碳源。由表2可知,与CK组相比,LM2、LS2、LN3组的还原糖含量均显著降低(P<0.05),分别降低了32.24%、44.93%、47.79%。发酵后还原糖含量降低,其原因可能是在发酵过程中,植物乳植杆菌需要糖代谢来维持自身生长和繁殖所需的能量,此外还有部分糖类物质被生物转化为有机酸[20]。
类胡萝卜素和总酚均是番木瓜发酵饮料的活性成分。类胡萝卜素含量在发酵后显著降低(P<0.05),与CK组(6.35 mg/g)相比,LM2、LS2、LN3组类胡萝卜素含量分别降低33.86%、34.80%、31.65%,且3组之间无显著性差异(P>0.05)。导致类胡萝卜素下降的原因可能是其性质不稳定,在发酵过程中因温度升高而被氧化,造成含量降低。总酚含量在发酵后显著升高(P<0.05),与CK组(8.03 mg/kg)相比,LM2、LS2、LN3组总酚含量分别增加2.07倍、2.00倍、2.08倍,且3组之间无显著性差异(P>0.05)。总酚含量增加可能与乳酸菌合成水解酶的能力有关,或者是由于乳酸菌产酸,继而在酸性环境下促进酚类物质从膳食纤维中的复合形式释放成可溶性形式。有研究表明,植物乳植杆菌具有较高的多酚代谢能力,具有乳杆菌属中特有、负责合成酚脱羧酶和单宁酶的基因[22]。WANG等[23]利用嗜酸乳杆菌、植物乳植杆菌和鼠李糖乳酪杆菌发酵蓝莓汁,结果表明,发酵蓝莓汁的总酚含量分别提高了20.49%、37.6%、12.46%。周瑶等[24]利用植物乳植杆菌Lp发酵番木瓜汁,结果表明发酵番木瓜汁的总酚含量提高1.55倍,与本文的研究结果一致。
2.2 番木瓜发酵汁GABA
GABA具有降低血压、抗抑郁、助睡眠等生理功能,在功能性食品领域被广泛应用。由图1可知,与CK组相比,LM2、LS2、LN3组的GABA含量均显著升高(P<0.05),其中LS2组GABA的含量最高(1.30 g/L),LM2组次之(1.07 g/L),LN3组最低(0.91 g/L)。发酵后GABA的含量显著增加,与前期研究证明植物乳植杆菌具有较好的GABA合成能力一致,进一步说明植物乳植杆菌发酵能够赋予产品较高含量的GABA,从而改善食品的营养价值。陈世培[9]利用植物乳植杆菌NCU001051发酵胡萝卜汁,发酵后GABA含量从0.15 g/L增加到0.69 g/L;吕欣然等[25]采用植物乳植杆菌PJ-7发酵胡萝卜汁,发酵后GABA产量从0.04 mg/mL增加到1.33 mg/mL。上述研究均与本文研究结果一致。
图1 不同发酵菌种对番木瓜汁GABA含量的影响
Fig.1 Effects of different fermentation strains on GABA content of papaya juice
注:图中组间不同小写字母表示差异显著(P<0.05)(下同)。
2.3 番木瓜发酵汁有机酸
有机酸是乳酸菌发酵的主要代谢产物,能够抑制有害菌的生长。乳酸菌将果蔬原料中的糖类分解代谢成多种酸类物质,包括乳酸、乙酸、柠檬酸等有机酸,有助于产品风味的形成。发酵番木瓜汁中有机酸的含量如表3所示。植物乳植杆菌发酵番木瓜汁中有机酸的种类和含量均发生了变化。草酸、柠檬酸、富马酸含量与CK组相比,LM2、LS2、LN3组均显著增加(P<0.05)。柠檬酸是三羧酸循环的中间产物,其产生的酸味具有一定的清爽感。与CK组相比,柠檬酸的增涨幅度最大,LS2组增涨了5.0倍、LN3组增涨了4.9倍、LM2组增涨了4.5倍。抗坏血酸经发酵后有所降低,与CK组相比,LS2组降幅最低(20%),其次为LM2(40%)、LN3(40%)。苹果酸在CK组的含量最高(0.34 mg/g),占有机酸总量的43.69%,但经发酵后LM2、LS2、LN3组均未检测到苹果酸,这可能是由于在发酵过程中乳酸菌进行苹果酸-乳酸发酵,使苹果酸向乳酸转变,造成苹果酸的降低,甚至被消耗完全,这与史梅莓等[26]的研究结果一致。乳酸、乙酸仅在LM2、LS2、LN3组中检测出,在CK组中均未检测到这2种酸,说明各组在发酵过程中不断积累乳酸和乙酸。乳酸可以赋予泡菜柔和的酸味,乙酸主要由乳酸菌的异型发酵产生,可以促进风味的形成。TOFALO等[27]、陈荣豪等[28]在研究乳酪、番木瓜发酵时发现,经乳酸菌发酵后乳酸和乙酸含量显著增加,与本文研究结果相似。乳酸是LM2、LS2、LN3组主要的有机酸,分别占有机酸总量的52.85%、52.06%、56.25%,说明发酵过程中生成的有机酸以乳酸为主,其原因可能是植物乳植杆菌可以利用苹果酸作为碳源,通过苹果乳酸酶将苹果酸脱羧直接转化为乳酸。LS2组有机酸总量最高(3.87 mg/g),说明LS2能够促进发酵番木瓜中有机酸的形成。
表3 不同发酵菌种对番木瓜汁有机酸的影响 单位:mg/g
Table 3 Effects of different fermentation strains on organic acids of papaya juice
组别草酸抗坏血酸乙酸乳酸柠檬酸富马酸苹果酸CK0.05±0.00b0.05±0.01a——0.19±0.03c0.01±0.01b0.34±0.05aLM20.17±0.04a0.03±0.01b0.37±0.10b1.87±0.08b1.04±0.04b0.04±0.01a—LS20.19±0.00a0.04±0.01ab0.43±0.02a2.01±0.07a1.14±0.06a0.04±0.00a—LN30.19±0.02a0.03±0.00b0.20±0.03c2.05±0.07a1.13±0.05a0.04±0.00a—
注：“—”表示未检测出(下同)。
2.4 番木瓜发酵汁抗氧化性
在评估抗氧化能力时,可通过测定番木瓜汁对DPPH自由基和ABTS阳离子自由基的清除效果来反映其抗氧化能力。如图2所示,番木瓜汁经植物乳植杆菌发酵后的DPPH自由基清除能力和ABTS阳离子自由基清除能力均有所增加。发酵结束后,LM2、LS2、LN3组的DPPH自由基清除率分别提升了1.01%、5.55%、2.82%,ABTS阳离子自由基清除率分别提升了4.46%、17.61%、11.40%,其中LS2组的清除率均最高。有研究发现,清除DPPH自由基的能力与总酚含量之间有一定的相关性,发酵后总酚含量增加,发酵果汁中含有较多的酚类物质,它们具有氢原子转移或给电子自由基的能力,能作为还原剂、自由基清除剂和单线态氧猝灭剂,具有显著的抗氧化活性。此外,乳酸菌本身含有酶和非酶抗氧化机制,能促使果汁在发酵过程具有较高的抗氧化能力。徐铭阳[29]采用植物乳植杆菌MY-12发酵红枣汁,DPPH自由基清除率提升了2.56%,ABTS阳离子自由基清除率提升了15.19%;LIU等[30]采用乳酸菌发酵胡萝卜汁,经过发酵后DPPH自由基及ABTS阳离子自由基清除能力分别提高66.3%和21.0%,与本研究结果一致。
a-DPPH自由基清除率;b-ABTS阳离子自由基清除率
图2 不同发酵菌种对番木瓜汁抗氧化能力的影响
Fig.2 Effects of different fermentation strains on antioxidant capacity of papaya juice
2.5 番木瓜发酵汁挥发性风味物质
番木瓜发酵汁的挥发性风味物质主要来源于原料本身和乳酸菌发酵后生成的代谢产物。发酵前后番木汁的挥发性风味物质如表4所示,4组样品中共鉴定出挥发性风味物质77种,包括醇类17种、酯类10种、酸类6种、酮类17种、烯类12种、醛类8种、酚类2种、呋喃类2种、烷烃类1种、其他类2种,各组之间挥发性风味成分差异较大。CK组鉴定出42种挥发性风味物质,LM2、LS2、LN3组分别鉴定出54、51、50种挥发性物质,说明番木瓜汁经植物乳植杆菌发酵后风味物质种类数增加,风味更为丰富。
表4 不同发酵菌种对番木瓜汁挥发性风味物质的影响
Table 4 Effects of different fermentation strains on volatile flavor substances of papaya juice
类别保留时间/min挥发性物质含量/(μg/g)CKLM2LS2LN3醇类19.08 9-十二炔-1-醇—0.72 ——24.78 正己醇—0.11 ——29.10 4-甲基-1-己醇——0.26 —30.53 2-乙基己醇0.25 0.53 0.62 0.47 31.68 2-壬基醇—0.24 ——31.69 4-甲基-2-己醇———0.19 32.92 芳樟醇745.82 413.40 520.16 279.51 33.29 正辛醇0.67 0.81 0.57 0.74 35.48 二氢芳樟醇0.95 22.53 23.57 23.43 37.28 1-壬醇0.39 1.14 0.66 1.04 38.02 (E)-2,6-二甲基-5,7-辛二烯-2-醇——0.32 —39.01 α-松油醇0.56 47.02 52.14 50.14 42.63 橙花醇2.97 10.45 12.64 5.81 44.21 香叶醇—18.48 15.47 21.23 5.59 苯甲醇0.62 5.54 8.83 6.15 46.83 苯乙醇—0.94 1.04 0.98 47.56 (+)-p-薄荷-1-烯-9-醇—0.35 0.34 0.49 酯类11.08 丁酸甲酯0.36 ———18.03 己酸甲酯1.04 ———26.58 辛酸甲酯16.40 4.56 9.68 —28.91 2-(5-甲基-5-乙烯基四氢呋喃-2-基)丙-2-基碳酸乙酯40.33 52.80 51.45 54.30 34.97 癸酸甲酯1.14 —1.09 0.24 42.69 月桂酸甲酯0.75 ———45.41 丁酸苯甲酯0.32 ———51.43 甲基丙烯酸苄基酯1.00 1.21 1.18 1.17 53.28 异硫氰酸苄酯214.09 106.92 151.78 131.64 57.04 (Z)-十六烯酸甲酯3.73 ———酸类29.18 乙酸—15.06 17.26 9.19 36.22 丁酸9.16 30.71 31.09 33.88 44.18 正戊酸—16.72 15.01 16.62 51.27 辛酸2.70 36.13 28.95 29.85 54.57 正壬酸1.62 1.13 0.98 1.04 57.71 正癸酸1.87 14.42 13.27 12.59 酮类17.94 2-庚酮—0.17 0.19 0.18 22.45 3-羟基-2-丁酮—0.75 0.89 1.78 24.49 甲基庚烯酮1.05 0.74 0.78 0.86 26.64 2-壬酮—0.59 0.49 0.55 35.20 2-十一酮—0.67 0.57 0.58 37.71 苯乙酮0.11 ———43.03 2-十三烷酮—0.23 0.34 —43.78 大马士酮——1.15 1.67 44.69 香叶基丙酮3.48 0.31 —0.49 47.83 β-紫罗酮0.61 ———49.61 2H-吡喃-2,6(3H)-二酮———0.17 53.44 植酮——2.19 —
续表4
类别保留时间/min挥发性物质含量/(μg/g)CKLM2LS2LN3酮类55.95 2′-羟基-5′-甲基苯乙酮—0.41 0.56 0.43 57.41 2,4-二甲基苯乙酮—1.34 1.02 1.14 57.42 3,4-二甲基苯乙酮—1.16 ——57.42 3-乙基苯乙酮———1.23 60.43 3,3-二甲基-2-苯并呋喃-1(3H)-酮—0.50 ——烯类17.03 β-蒎烯4.09 —1.45 —17.04 月桂烯—1.34 2.05 1.66 17.26 α-水芹烯0.32 0.14 0.24 0.18 17.84 α-松油烯0.69 0.65 0.85 —18.63 (+)-柠檬烯2.20 1.30 1.76 1.29 19.07 3-亚甲基-6-(1-甲基乙基)环己烯0.29 ———19.36 对薄荷-1,3,8-三烯0.66 —0.46 —19.91 (E)-Β-罗勒烯——0.98 0.80 19.94 3,6,6-三甲基-双环(3.1.1)庚-2-烯1.59 0.66 ——20.70 3-蒈烯2.83 1.35 1.80 1.50 22.16 (+)-4-蒈烯———1.02 55.96 3-羟基-4-甲氧基苯乙烯———0.39 醛类26.86 壬醛2.06 0.92 1.06 0.93 32.72 苯甲醛0.25 1.04 0.99 1.92 34.56 5-甲基呋喃醛—0.11 ——39.87 2,5-二甲基苯甲醛—0.25 ——39.87 3-乙基苯甲醛0.53 0.27 —0.10 41.05 3,4-二甲基苯甲醛—0.20 ——53.68 间苯二甲醛0.48 0.26 0.17 0.25 54.43 对苯二甲醛0.61 ———酚类52.31 对甲基苯酚—0.18 —0.30 58.91 2,4-二叔丁基苯酚66.55 10.57 12.26 11.41 呋喃类20.43 顺式-2-乙烯基四氢-2-甲基-5-(1-甲基乙烯基)-呋喃—0.55 0.56 0.65 40.52 2-[(2S,5S)-5-乙烯基-5-甲基四氢呋喃-2-基]丙-2-醇-2H-吡喃 (1∶1)1.43 1.60 1.88 1.92烷烃类19.03 1-亚甲基-4-(1-甲基乙烯基)环己烷——0.94 —其他类44.01 茴香脑0.95 0.51 0.56 0.42 47.65 苯乙腈—1.54 1.66 1.61
醇类物质是发酵番木瓜汁中最丰富的关键挥发物,能为饮品增添独特的风味,且与其他风味物质相互作用,形成协调的风味体系。CK组的醇类物质共鉴定出8种;LM2、LS2、LN3组的醇类物质分别鉴定出14、13、12种,分别新增6、5、4种,均新增的醇类物质有香叶醇、苯乙醇、(+)-p-薄荷-1-烯-9-醇。CK组的醇类物质含量占番木瓜汁挥发性物质总含量的66.13%,LM2、LS2、LN3组的醇类物质含量分别占发酵番木瓜汁挥发性物质总含量的62.76%、63.90%、54.48%。这与PINO等[31]的研究结果相似,其研究表明番木瓜中主要挥发性成分以酯类为主:约占总挥发物的40.8%～63.0%。发酵后,LM2、LS2、LN3组的二氢芳樟醇、α-松油醇、苯甲醇显著高于CK组,二氢芳樟醇具有新鲜木香并稍有柑橘气息的玫瑰木油香气,α-松油醇具有似紫丁香花的香气,苯甲醇具清甜的苦杏仁味,因此赋予发酵番木瓜汁醇厚的风味和独特复杂的香气。芳樟醇属花香型的香气成分,具有花香、木香和柑橘香等,有多个番木瓜挥发性成分研究表明,芳樟醇是番木瓜果实中主要的芳香化合物[32]。FARINA等[33]研究发现,番木瓜中芳樟醇可达90%以上,是番木瓜关键的挥发性物质。本文中芳樟醇也是番木瓜汁最丰富的醇类物质,CK组的芳樟醇含量占醇类物质总含量的99.19%,LM2、LS2、LN3组的芳樟醇含量分别占发酵番木瓜汁醇类物质总含量的79.26%、81.71%、71.64%。发酵后芳樟醇含量显著降低,LM2、LS2、LN3组与CK组相比,分别降低44.57%、30.26%、62.52%,说明LM2、LN3组的芳樟醇损失严重,而LS2组的芳樟醇则相对保持较好,保留了番木瓜的特征香气成分。
酯类物质由醇类与酸类缩合反应、酶作用反应或者微生物代谢产生,主要提供果香、花香或者酒香[26]。CK组鉴定出10种酯类物质,占挥发性物质总含量的24.54%;LM2、LS2、LN3组酯类物质种类分别鉴定出4、5、4种,占挥发性物质总含量的19.89%、21.60%、26.16%。发酵后酯类物质变化显著,与CK组相比,LM2、LS2、LN3组酯类物质含量分别降低40.72%、28.29%、38.98%。吕欣然等[25]在利用植物乳植杆菌PJ-7发酵萝卜时发现,酯类物质比CK组降低了12.62%;廖茂雯等[34]利用植物乳植酸菌b-1发酵蓝莓汁,在0～72 h发酵期间酯类物质种类及含量呈先上升后下降的趋势,在72 h发酵结束时酯类由5种变为3种,这些研究结论均与本文研究一致。乳酸菌发酵后,有的菌株可促进酯类物质形成,有的则会降低酯类物质含量,这可能与菌株本身的特性有关,植物乳植杆菌发酵后代谢产生了其他物质。发酵前后,异硫氰酸苄酯均为番木瓜汁的主要酯类物质,同时它也是番木瓜的关键风味活性物质,具有典型的番木瓜香气,这与PINO[35]、孔祥琪等[36]的研究一致。LM2、LS2、LN3组的异硫氰酸苄酯含量较CK组分别降低50.06%、29.10%、38.51%,因此LM2、LN3组的番木瓜特征香气损失严重,而LS2组的番木瓜特征香气相对保持较好。
酸类是发酵制品中具有特殊风味的成分,可由脂质氧化产生或者糖代谢、氨基酸降解。适度的酸味可增加饮品的清爽感和开胃效果,过量则可能使饮料口感过酸,影响适口性。CK组鉴定出4种酸类物质,占挥发性物质总含量的1.35%;LM2、LS2、LN3组酸类物质种类分别鉴定出7、6、6种,占挥发性物质总含量的13.72%、10.70%、14.41%。发酵后丁酸、辛酸、正癸酸均显著增加,其中丁酸、辛酸是发酵番木瓜汁的主要酸类物质。丁酸具有干乳酪的气味,是番木瓜的风味活性物质之一,与CK组相比,LM2、LS2、LN3组分别增加了2.3倍、2.4倍、2.7倍,因此3株植物乳植杆菌均提升了发酵番木瓜汁的风味。而乙酸、正戊酸为发酵后新增的酸类物质。乙酸是经乳酸菌发酵产生的挥发性酸,主要通过磷酸葡萄糖酸途径和柠檬酸的代谢产生,研究发现与其他乳酸菌相比,乳杆菌发酵果蔬汁挥发性成分中具有更高的乙酸含量,赋予果汁理想的酸味,LS2组的乙酸含量增加最高,为17.26 μg/g,其次为LM2、LN3组。周瑶等[24]、黄宁馨等[37]也分别在研究植物乳植杆菌发酵番木瓜汁、枸杞果汁时均检测到新增乙酸,这与本文研究的结论一致。
酮类可能是由于氨基酸降解和脂肪氧化降解而形成。发酵后番木瓜汁中酮类物质更加丰富,CK组的酮类物质共鉴定出4种,含量最高的为香叶基丙酮;LM2、LS2、LN3组分别鉴定出11、10、11种,新增7、6、7种,其中2-庚酮、3-羟基-2-丁酮、2-壬酮、2-十一酮、2′-羟基-5′-甲基苯乙酮、2,4-二甲基苯乙酮等6种酮类为3株植物乳植杆菌均新增的酮类物质。酮类物质是发酵番木瓜汁新生成的挥发性成分种类最多的物质,这与陈荣豪等[28]的研究结果一致。
大多数醛类物质在低浓度时往往呈现清香、果香或脂肪香等令人愉悦的香气,但易被氧化还原为酸类和醇类物质。醛类在各组样品中含量不高,CK、LM2、LS2、LN3组分别占挥发性物质总含量的0.35%、0.37%、0.22%、0.45%。苯甲醛具有杏仁的香甜味道,主要由支链氨基酸的降解产生,其在发酵后增长幅度最大,LM2、LS2、LN3组分别增涨了3.1倍、3.0倍、6.7倍。壬醛有强烈的油脂气味和甜橙气息,CK组的壬醛含量在醛类物质中占比最大(52.52%),LM2、LS2、LN3组的壬醛含量有所降低,其中LS2组降幅最小(48.58%),其次为LN3组(54.83%)、LM2(55.40%)。壬醛来源于不饱和脂肪酸的氧化,LM2、LS2、LN3组间的含量出现显著差异可能与菌株抑制氧化的能力有关。
CK组的酚类物质仅鉴定到2,4-二叔丁基苯酚,但其含量不低,约占挥发性物质总含量的5.85%,发酵后其含量显著降低,LM2、LS2、LN3组均下降80%以上。周瑶等[24]研究发现,番木瓜发酵后2,4-二叔丁基苯酚未检出;黄宁馨等[37]研究发现,枸杞果汁发酵后2,4-二叔丁基苯酚下降46.57%,与本研究结果相似。对甲基苯酚呈现一种辛辣、强烈的,类似苯酚的香气及烟草香,是酸笋中主要的特征风味化合物,酸笋中的酸臭味主要与对甲苯酚含量呈正相关[38]。发酵后,因此,对甲基苯酚可能是造成发酵番木汁产生不良风味的原因。发酵后,LM2、LN3组新增了对甲基苯酚,含量分别为0.18、0.30 μg/g,LS2组未检出对甲基苯酚,说明LS2组没有产生不良风味。
烯类物质在CK、LM2、LS2、LN3组中分别鉴定出8、6、8、7种,含量分别占挥发性物质总量的1.11%、0.65%、0.96%、0.95%。β-蒎烯具有清新、柑橘类果香,是CK组的主要烯类物质,占烯类物质含量的32.28%;发酵后仅在LS2组中鉴定到,占烯类物质含量的15.12%。呋喃类、烷烃类及其他类物质的含量较少,但对发酵番木瓜汁的整体风味的形成具有协同作用。
综上所述,植物乳植杆菌发酵能增加番木瓜汁中挥发性风味物质种类数,使番木瓜汁的风味更为丰富。接种LS2后,芳樟醇、异硫氰酸苄酯等关键风味活性物质相对CK组保持较好,保留了番木瓜的特征香气成分,且无不良的风味,说明接种LS2的番木瓜汁发酵风味成分更佳。
2.6 番木瓜发酵汁感官评价
感官评分直接表现了产品的被接受度。如图3所示,在色泽方面,发酵后LM2、LS2、LN3组颜色均为呈橙红色、色泽亮丽,无显著性差异(P<0.05),这可能与类胡萝卜素含量有关,发酵后LM2、LS2、LN3组也无显著性差异(P<0.05)。在气味和口感方面,4组得分差异较大,LS2组评分均为最高,酸甜适中、无苦涩味且番木瓜香气浓郁,这与上文挥发性风味物质结果相吻合,LS2组含有较高的芳樟醇、醇类物质及酯类物质,因此番木瓜香气更为浓郁。在组织状态方面,发酵后LS2、LN3、LM2组样品均明显无沉淀及分层现象。综上,LS2组样品的感官评价总分最高。
图3 不同发酵菌种对番木瓜汁感官评价的影响
Fig.3 Effects of different fermentation strains on sensory evaluation of papaya juice
3 结论
本文利用植物乳植杆菌LM2、LS2、LN3对番木瓜汁进行发酵,分析其理化品质、活性成分、有机酸、抗氧化能力、挥发性风味物质等。结果表明,发酵降低了番木瓜汁pH值及还原糖、类胡萝卜素等含量,可提高总酸、总酚、GABA、有机酸含量及抗氧化能力,同时增加风味物质种类,从而改善饮品的风味。其中,LS2组发酵番木瓜汁的总酸含量为5.83 g/L,GABA为1.30 g/L,有机酸总量为3.87 mg/g,感官评价总分87.5分,DPPH自由基和ABTS阳离子自由基的清除率分别为91.38%、88.71%,在发酵样品中均为最高。此外,LS2组发酵番木瓜汁的挥发性风味物质种类丰富,共检测出51种挥发性物质,以醇类和酯类为主,关键风味物质芳樟醇、异硫氰酸苄酯含量分别为520.16、151.78 μg/g,较好地保留了番木瓜的特征香气成分。本研究为开发富含GABA的番木瓜发酵汁提供技术支持和试验参考。后续将进一步优化植物乳植杆菌LS2的发酵条件和参数,以提高GABA产量及改善产品品质;同时开展货架期试验和稳定性研究,为番木瓜发酵汁产品的工业化生产提供理论支撑。
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