心血管疾病(cardiovascular disease,CVD)是全球慢性疾病负担的主要因素之一,而高胆固醇血症是其关键风险因素[1]。世界卫生组织预测,到2030年,心血管疾病仍是导致死亡的主要原因,全球将会有约2.3亿人受到影响[2]。据HASENFUß[3]研究表明,降低血清胆固醇浓度对预防CVD具有重要意义:血清胆固醇浓度每降低1%,CVD的发生率可减少2%～3%。因此,寻找可以降低血液和肝脏胆固醇含量的药物有着重要意义。目前,他汀类药物是应用最广泛的降胆固醇药物,但其存在价格较高及可能引发肝酶异常、横纹肌溶解等不良反应的局限性[4]。因此,开发安全、有效的天然降胆固醇策略具有重要意义。
在《健康中国2030规划纲要》“预防为主”的战略导向下,通过维护肠道健康来调控血脂和胆固醇备受关注,这凸显了益生菌的应用价值[5-6]。作为公认安全的益生菌,特定乳酸菌菌株已被证实能通过多种机制有效降低胆固醇。首先,它们能够激活AMP激活蛋白激酶信号通路,从而抑制脂肪酸合成并促进其分解[7]。同时,这些菌株产生的胆盐水解酶(bile salt hydrolase,BSH)能促进胆汁酸随粪便排出,迫使机体消耗更多胆固醇来合成新的胆汁酸[8-9]。此外,乳酸菌还能通过调节肠道菌群平衡,增加有益菌并抑制有害菌,来改善宿主的整体代谢健康[10-11]。最后,部分菌株还能利用共轭亚油酸(conjugated linoleic acid, CLA)异构酶系合成具有生物活性的共轭亚油酸,直接参与调控脂质代谢并减少脂肪沉积[8]。
乳酸菌健康效益发挥的前提是菌体能以足够高的活菌数量(>106 CFU/g或mL)存活并定植于肠道。为保持其稳定性,固定化与冷冻干燥是保护益生菌活性的两大核心技术。其中,以微胶囊为代表的固定化技术,通过海藻酸钠、壳聚糖等生物相容性材料包埋菌体,形成物理屏障[12]。该屏障能有效抵御胃酸和胆盐侵蚀,并实现靶向释放,从而显著提升菌株在肠道中的存活率。冷冻干燥则是另一关键工艺,它在低温真空下通过升华去除水分,并添加海藻糖、脱脂乳等冷冻保护剂来维持细胞结构完整性[13]。该技术可制得高活性、高稳定性的益生菌粉末,不仅延长了产品货架期,也为贮运及多元化应用提供了便利。
本研究旨在从传统发酵食品中筛选出具有优异降胆固醇能力的乳酸菌菌株,并对其关键益生特性进行评价。在此基础上,优化其降胆固醇反应体系,并分别探索固定化和冷冻干燥2种技术对提高菌株在模拟胃肠道环境中存活率的效果,为开发新型降胆固醇功能性食品提供科学依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
菌种来源:本研究所用菌株分离自内蒙古手工泡菜、腊肉及奶酪,均由本实验室保藏并鉴定。
培养基:液体MRS培养基、MRS琼脂培养基,北京索莱宝科技有限公司。
主要试剂:牛胆盐(B875069/生物级)、NH4Fe(SO4)2(4502094)、魔芋胶(K875387)、壳聚糖(C875441)、蔗糖(57-50-1),上海麦克林生化科技有限公司;胆固醇(色谱纯,C104036),上海阿拉丁生化科技股份有限公司;含酶的无菌人工胃液与人工肠液(所有消化液在使用前均预热至37 ℃),上海懋康生物科技有限公司;海藻酸钠(9005-38-3),西陇科学股份有限公司;菊糖(9005-80-5)、海藻糖(99-20-7),杭州草本源生物技术有限公司;乳糖(S11057),上海源叶生物科技有限公司;CaCl2(A501330),生工生物工程(上海)股份有限公司;抗氧化试剂盒(S0116),上海碧云天生物技术有限公司;脱脂乳(0039S),内蒙古伊利实业集团股份有限公司。
1.2 仪器与设备
SW-CJ-IFD紫外工作台,苏州净化设备有限公司;ZQZY-70B恒温振荡摇床,上海知楚仪器有限公司;MQD-S2R 96孔板摇床,上海旻泉仪器有限公司;Z326K高速离心机,德国HERMLE公司;PTX-JA1000SL电子天平,华志(福建)电子科技有限公司;TECAN酶标仪,美国伯腾仪器有限公司;ES-60E恒温孵育培养箱,杭州米欧仪器有限公司(MIULAB);SN210C高压灭菌锅,日本雅马拓科学株式会社(Yamato);P901型pH计,上海佑科仪器仪表有限公司;DK-2000-IIIL恒温水浴锅,菲斯福仪器(河北)有限公司;27664冷冻干燥机,德国CHRIST公司;SHZ-D真空泵,巩义市予华仪器有限责任公司。
1.3 实验方法
1.3.1 降胆固醇乳酸菌的筛选和鉴定
1)分离:将泡菜、奶酪或腊肉样品悬浮于无菌生理盐水中(37 ℃,180 r/min,15 min),梯度稀释后涂布于含CaCO3的MRS平板,37 ℃培养24 h。挑取单菌落,经MRS液体培养基(37 ℃,180 r/min,24 h)增菌后,与体积分数为50%甘油1∶1(mL∶mL)混匀,于-80 ℃保藏。
2)活化:将-80 ℃保藏菌种室温融化后,转接至MRS培养基中,在37 ℃、180 r/min条件下连续传代活化2次(每次24 h),备用。
3)降胆固醇活性筛选:采用改良后的硫酸铁铵法[14]。活化菌液按3%体积分数接种于含100 μg/mL胆固醇和质量分数0.2%胆盐的MRS培养基(实验组),并设置阳性对照(未接菌)、菌液空白(接菌但不含胆固醇)和培养基空白(不接菌不含胆固醇)3个对照组。所有组均在37 ℃、180 r/min培养24 h。培养液4 ℃、10 000×g离心30 min,上清液稀释5倍后与硫酸铁铵显色液按1∶3(mL∶mL)比例混合,室温显色后测OD570值并计算胆固醇去除率(胆固醇去除率/%=[(OD570阳性对照值-OD570培养基空白值)-(OD570实验组值-OD570菌液空白值)]/(OD570阳性对照值-OD570培养基空白值) × 100)。
4)鉴定:从72株分离株中初筛得4株高活性菌,编号为MRS1026.1～MRS1026.4,委托广州艾基生物科技有限公司完成16S rDNA测序,序列经NCBI数据库比对后以MEGA软件构建系统发育树。
1.3.2 益生特性评价
1)耐酸性:活化后菌液调OD600值至1.0,按2%体积分数接入pH 3.0的MRS,37 ℃、180 r/min培养4 h测OD600值;并以同量菌液接种于pH 6.0的MRS培养基作为空白对照。
2)胆盐耐受性:同上活化并调OD600值至1.0,按2%体积分数分别接入含质量分数0～0.3%胆盐的MRS,37 ℃、180 r/min培养4 h测OD600值;0%胆盐组为对照。
3)表面疏水性:参照文献[15]稍作修改。活化菌体经离心收集,PBS洗涤2次后重悬至OD600=0.6。取3 mL菌液加1 mL氯仿,涡旋2 min,静置1 h,测水相OD600值;以未处理菌液为对照,计算疏水率。
4)自聚集能力:参照文献[15]的方法稍作修改。活化菌体经离心、PBS洗涤2次后重悬至OD600=1.0。取4 mL菌悬液于37 ℃静置,于0、2、3、4、6、8、12、24 h时小心吸取上层液体测定OD600值以计算自聚集率。
5)抗氧化性:活化菌液经10 000×g离心后取上清液,直接以铁还原抗氧化能力(ferric reducing antioxidant potential assay,FRAP)法测定抗氧化活性;沉淀用等量PBS洗涤2～3次后重悬,再次以FRAP法测定细胞抗氧化活性;同法洗涤后的菌体经超声破碎,上清液以FRAP法测定胞内产物抗氧化活性。
1.3.3 降胆固醇反应体系优化
1)降胆固醇反应
活化菌液经10 000 r/min离心后,洗涤菌体2～3次,弃上清液,湿菌称重后复溶于降胆固醇反应液,终质量浓度32 g/L。取1 mL菌悬液加入96深孔板,30 ℃、600 r/min反应20 h。反应结束后,将反应稀释液与硫酸铁铵显色液按体积比1∶3混匀,室温静置显色,于560 nm测吸光度;以未接菌的反应液为阳性对照,计算胆固醇去除率。
2)单因素优化
依次改变反应时间(8、12、16、20、24 h)、温度(20、25、30、35、40 ℃)、缓冲液[水、生理盐水、PBS、碳酸盐缓冲液(carbonate buffer solution,CBS)]、pH值(4、6、8、10、12)、转速(200、400、600、800、1 000 r/min)、菌液质量浓度(8、16、32、48、64 g/L)及胆盐质量分数(0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%),测定各条件下的胆固醇去除率,确定最佳参数范围。
3)响应面法优化
根据单因素结果,选取温度、pH值和胆盐浓度3个显著因素,按三因素三水平Box-Behnken设计进行实验,以胆固醇去除率为响应值,利用响应面分析确定最优反应条件。因素与水平编码见电子版增强出版附表1(https://doi.org/10.13995/j.cnki.11-1802/ts.044164,下同)。
1.3.4 固定化工艺优化
1)乳酸菌固定化
活化菌液37 ℃、10 000 r/min离心收菌,PBS洗2～3次后重悬,调OD600值至1.0。按菌胶体积比1∶3与海藻酸钠-魔芋胶混合液搅匀,使用装有22 G规格针头的5 mL无菌注射器以均匀的速度从约5 cm的高度逐滴滴入于室温下磁力搅拌的CaCl2溶液中成球,固化1 h;无菌水冲净后转入质量分数1%壳聚糖溶液,400 r/min、30 min覆膜,再冲洗、称重备用。
2)包埋率测定
将固定化前的菌悬液(OD600=1.0)直接梯度稀释后倾注平板,37 ℃培养48 h,计数得游离活菌数A0。另取与上述菌悬液等量的固定化凝胶珠(称重记录),置无菌生理盐水中,37 ℃、180 r/min振荡至胶珠完全溶解,梯度稀释后同法计数,得释放活菌数A1。包埋率/%=(A0-A1)/A0×100。
3)单因素优化
依次考察CaCl2(质量分数0.4%、0.8%、1.2%、1.6%、2.0%)、魔芋胶(质量分数1.0%、1.4%、1.8%、2.2%、2.6%)、壳聚糖(质量分数1.0%、1.4%、1.8%、2.2%、2.6%)和海藻酸钠(质量分数1.0%、1.4%、1.8%、2.2%、2.6%)对包埋率的影响。
4)响应面法优化
基于单因素结果,以海藻酸钠、壳聚糖、魔芋胶浓度为三因素,采用Box-Behnken设计三水平实验,以包埋率为响应值,确定最佳配方;因素与水平编码见附表2。
1.3.5 冷冻干燥工艺优化
1)乳酸菌冷冻干燥
按体积比1∶1将OD600=1.0的菌悬液与含海藻糖、脱脂乳、菊糖的复合保护剂溶液(或无菌水作为空白对照组)混匀,37 ℃、180 r/min共孵15 min,随后-80 ℃预冻2 h,转入-55 ℃、<1 mbar条件下冻干至恒重。
2)存活率测定
冻干前后分别取样梯度稀释后倾注平板,37 ℃培养计数,计算存活率。
3)单因素优化
依次考察脱脂乳、菊糖、海藻糖在4%～20%的质量分数变化对冻干存活率的影响,其余2种保护剂质量分数固定为10%。
4)响应面法优化
依据单因素结果,以脱脂乳、菊糖、海藻糖浓度为三因素,采用Box-Behnken设计三水平实验,以存活率为响应值,确定最优复合保护剂配方;因素与水平编码见附表3。
1.3.6 体外模拟胃肠道存活率测定
活化菌液经10 000×g离心收菌,PBS洗2次并重悬,调OD600=1.0。取1 mL加9 mL模拟胃液,37 ℃、180 r/min孵育2 h,10 000×g离心,等体积PBS洗涤,梯度稀释后涂布,于37 ℃培养24 h后计数。在沉淀中再加10 mL模拟肠液,37 ℃、180 r/min孵育4 h,同法离心-洗涤-稀释-计数。
固定化凝胶珠(2 mL菌液制得)置18 mL模拟胃液,37 ℃、180 r/min 2、4 h,10 000 r/min离心后PBS洗涤并计数;沉淀转20 mL模拟肠液,37 ℃、180 r/min分别孵育4、6 h后计数。
冻干粉2 g加18 mL模拟胃液,37 ℃、180 r/min 2、4 h,10 000 r/min离心后PBS洗涤并计数;沉淀转20 mL模拟肠液,37 ℃、180 r/min分别孵育4、6 h后计数。
1.4 统计学分析
Box-Behnken设计与分析在Design-Expert 13中完成。所有实验均设置3个独立的生物学重复(n=3),每个生物学重复下设3次技术重复(平行实验),取其平均值作为一个数据点用于后续统计分析,所述的标准差或四分位距均基于这3个独立的生物学重复值计算所得。实验数据采用GraphPad Prism 9.0和SPSS 26.0进行统计分析和作图,并采用“平均值±标准差”或“中位数-四分位距”表示。首先,利用Kolmogorov-Smirnov法对数据进行正态性检验。对于符合正态分布的数据,采用单因素方差分析(analysis of variance,ANOVA)进行差异分析。若数据满足方差齐性要求,则使用Duncan或Dunnett’s(双侧)检验进行事后多重比较。若方差不齐,则采用Dunnett T3检验进行多重比较。对于非正态分布的数据,采用Kruskal-Wallis非参数检验和Dunnett’s事后检验进行差异分析(*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001)。
2 结果与讨论
2.1 降胆固醇乳酸菌的筛选与鉴定
本研究从72株分离物中筛选出4株高效菌株,其胆固醇去除率均高于60%(图1-a)。其中,MRS1026.2的去除效率最高,达74.65%,显著优于其他菌株;MRS1026.4次之,胆固醇去除率为68.61%。为明确4株菌的分类地位,本研究对其进行了16S rDNA序列测定(附表4)。系统发育分析结果(图1-b)显示,菌株MRS1026.1和MRS1026.4与植物乳植杆菌(Lactiplantibacillus plantarum)的亲缘关系最近,同属一个进化分支;菌株MRS1026.2与类植物乳植杆菌(L.paraplantarum)亲缘关系最近;菌株MRS1026.3则与戊糖乳植杆菌(L.pentosus)的亲缘关系最近。
a-4株乳酸菌的体外胆固醇去除率;b-基于16S rDNA序列构建的系统发育树
图1 筛选菌株的降胆固醇活性与系统发育鉴定
Fig.1 Cholesterol-lowering activity and phylogenetic identification of the selected strains
注:***P<0.001,**P<0.01,*P<0.05,差异具有统计学意义(下同)。
2.2 菌株的益生特性评价
益生菌的功效取决于其穿越胃肠道并定植的能力,因此耐受性与黏附性是其发挥功能的关键。首先在胃肠耐受性方面,各菌株差异显著。耐酸性测试中(图2-a),MRS1026.3表现最强(pH 3.0下存活率70.77%),而MRS1026.4最弱(36.08%)。在胆盐耐受性上(图2-b),当胆盐质量分数升至0.3%时,MRS1026.1与MRS1026.3仍展现出优异耐受力,而另2株菌存活率则急剧下跌,该差异可能与菌株BSH酶的表达水平、膜脂组成及胞外多糖分泌量相关[9]。值得注意的是,这4株菌在质量分数0.3%胆盐下的存活率均超30%,显著优于ZHAN等[16]从艾蒿发酵液分离的5株乳酸菌(存活率均 <15%),提示其更有潜力以活菌形式抵达肠道并发挥微生态调节作用。其次在黏附潜力方面,通过疏水性和自聚集能力评估。疏水性结果显示(图2-c),MRS1026.1最高(72.85%),预示其黏附潜力最强;MRS1026.3与MRS1026.4居中,而MRS1026.2最低(24.99%)。自聚集能力测试中(图2-d),MRS1026.1与MRS1026.4在初期(0～2 h)便迅速聚集,利于早期定植;而MRS1026.2与MRS1026.3则速率滞后,定植潜力相对受限。
a-pH 3.0条件下的耐酸性;b-不同质量分数胆盐下的耐受性曲线;c-细胞表面疏水性;d-自聚集能力曲线
图2 筛选菌株的耐受性与黏附潜力
Fig.2 Tolerance and adhesion potential of the selected strains
在抗氧化活性方面,乳酸菌的活性不仅源于其代谢产物(如有机酸、酶类),还源于菌体及胞内组分(磷脂、蛋白质等)[17]。如图3所示,抗氧化能力主要来自胞外分泌物(上清液)。其中,MRS1026.4的活性最强,其次是MRS1026.2(图3-a)。
a-菌株上清液的抗氧化活性;b-菌株细胞液的抗氧化活性;c-菌株破碎液的抗氧化活性
图3 筛选菌株的抗氧化活性
Fig.3 Antioxidant activity of the selected strains
为综合评价应用潜力,体外模拟消化道存活实验(图4)显示,MRS1026.4表现出最佳综合耐受性,存活率达26.92%;而MRS1026.2的存活率则极低(0.016%)。尽管MRS1026.2胃肠耐受性差,其高效的胆固醇清除能力或依赖于BSH酶、CLA异构酶等低活性需求机制[18]。相比之下,MRS1026.4展现出优异的综合益生特性,兼具良好的胆盐耐受性、黏附潜力及抗氧化性。因此,后续研究将对高效但脆弱的MRS1026.2进行固定化以提高存活率,并对综合性能优越的MRS1026.4进行冷冻干燥以备应用开发。
图4 筛选菌株在体外模拟消化道中的存活情况
Fig.4 Survival of the selected strains in the simulated in vitro gastrointestinal tract
2.3 优化MRS1026.2的体外降胆固醇条件
针对降胆固醇能力最强的菌株MRS1026.2,研究系统优化了其体外降胆固醇反应体系。
2.3.1 单因素试验确定关键影响因子
单因素试验(图5)确定了一系列最佳反应条件:反应时间20 h(平台期)、最适温度30 ℃与pH 6.0(与菌株及BSH酶的最佳活性范围相符),以及600 r/min的转速(保证充分接触)。菌液与胆盐浓度的影响则呈现先升后降的趋势:最佳菌液质量浓度为32 g/L,过高会因代谢产物积累而抑制活性[19];最佳胆盐质量分数为0.2%,因适量胆盐能激活BSH而过量则产生抑制[9]。此外,生理盐水被证实能提供最佳微环境。
a-反应时间;b-反应温度;c-pH值;d-转速;e-菌液质量浓度;f-胆盐质量分数;g-缓冲液种类
图5 单因素试验对MRS1026.2胆固醇去除率的影响
Fig.5 Effects of single factors on the cholesterol removal rate by MRS1026.2
2.3.2 响应面法优化及模型验证
本研究选取影响胆固醇去除率最显著的3个因素:温度(A)、pH值(B)和胆盐浓度(C),采用响应面法进行优化(设计与结果见附表5)。值得注意的是,设计中的5个中心点实验测得的平均胆固醇去除率为(75.57±3.58)%(附表5)。该波动反映了微生物体外实验中固有的生物学重复性差异,可能与菌株在不同批次培养中的生理状态微小变化有关。回归分析得到胆固醇去除率的二次多项式模型方程:胆固醇去除率/%=-680.30+39.01A+37.43B+551.08C-0.27AB-8.56AC+13.69BC-0.58A2-2.63B2-1 202.28C2。模型的方差分析(附表6)结果显示,该模型具有极高的显著性(P<0.001),而失拟项不显著(P>0.05),校正方差(Adjusted R2)与预测方差(Predicted R2)差值小于0.2,表明模型可信度高。回归方程R2为0.970 2,线性回归方程拟合良好,该模型可以解释97.02%的结果变化。根据F值大小判断,各因素对胆固醇去除率的影响程度为:胆盐浓度>pH值>温度。各因素之间的交互作用通过响应面等高线图和3D图直观呈现(附图1)。模型预测的最优降胆固醇条件为:温度29 ℃,pH 6.1,胆盐质量分数0.19%,此时预测去除率为75.15%。为验证模型可靠性,在最优条件下进行实验,测得平均胆固醇去除率为(74.65±2.18)%(附表7),与预测值(相对误差0.67%)高度吻合。虽然验证实验的实测值(74.65%)略低于中心点的平均值(75.57%),但考虑到中心点本身存在的实验误差,这一差异并不显著。这表明,真实的响应最优区域可能是一个较为平坦的“平台区”,而非一个尖锐的“峰顶”。模型预测的最优点和实验设计的中心点均落在这个高效去除平台区内,证明该模型能准确指导MRS1026.2的体外降胆固醇应用。
2.4 优化MRS1026.2的复合水凝胶固定化工艺
为提高MRS1026.2在胃肠道环境中的存活率,研究进一步以魔芋胶-壳聚糖-海藻酸钠为基质的复合水凝胶固定化体系,并对其工艺参数进行了系统优化。
2.4.1 单因素试验筛选固定化关键参数
在菌株包埋过程中,魔芋胶通过形成三维胶体网络提供生长微环境[20],而海藻酸钠和壳聚糖则在关键交联剂CaCl2作用下,分别形成能有效截留菌体的水凝胶骨架与具有附着增强效果的“糖覆膜”[21-22],共同保护并固定菌体。实验结果表明,各组分浓度对包埋率均呈现先升高后降低的趋势(图6)。其原因在于,浓度过低会导致凝胶网络疏松、菌体泄露;而浓度过高则会因体系黏度剧增而阻碍物质传递,并可能对菌体产生渗透压胁迫,从而降低其活性与包埋率。综合单因素试验(图6),确定各组分的最优质量分数分别为:魔芋胶1.8%、壳聚糖1.8%、海藻酸钠1.4%及CaCl2 1.0%。
a-魔芋胶质量分数;b-壳聚糖质量分数;c-海藻酸钠质量分数;d-CaCl2质量分数
图6 单因素试验对乳酸菌包埋率的影响
Fig.6 Effects of single factors on the encapsulation efficiency of lactic acid bacteria
2.4.2 响应面法优化复合水凝胶固定化配方及模型验证
为优化固定化工艺,本研究选取海藻酸钠(A)、魔芋胶(B)和壳聚糖(C)3个关键因素进行响应面法分析(设计与结果见附表8)。回归分析得到包埋率的二次多项式模型方程:包埋率/%=-851.23+158.83A+339.81B+506.06C-27.42AB+14.77AC-47.34BC-44.26A2-50.53B2-113.97C2。方差分析(附表9)表明,该模型极显著(P<0.001)且失拟项不显著(P>0.05)。模型的决定系数R2高达0.989 4,且校正与预测方差差值小于0.2,证实模型拟合度佳、可信度高。F值分析显示,各因素对包埋率的影响主次顺序为:壳聚糖(C)>魔芋胶(B)>海藻酸钠(A)。交互作用分析(附图2)显示,魔芋胶与壳聚糖(BC)的交互作用最为显著(P<0.01),其协同效应对形成致密包埋结构至关重要。根据模型预测,最佳固定化配方为:海藻酸钠质量分数1.40%,魔芋胶1.81%,壳聚糖1.80%,此时预测包埋率为88.40%。在此条件下进行验证实验,实测平均包埋率为(88.99±2.73)%(附表10),与预测值无显著差异,证明了模型的准确性与可靠性。
2.4.3 固定化凝胶珠的体外模拟消化道释放特性
为评估固定化微胶囊的保护效能与肠道靶向释放特性,本研究进行了体外模拟胃肠道消化实验(图7)。在模拟胃液中,微胶囊在孵育4 h内始终保持结构完整,菌株累计释放率仅为7.48%,显示出优异的耐酸保护能力。随后,样品被转移至模拟肠液(pH 6.8),凝胶基质迅速降解,菌株被高效释放,4 h内累计释放量即达87.50%,呈现出典型的肠道靶向行为。值得注意的是,当肠道消化延长至6 h,部分菌体因消化酶作用而失活,存活释放率回落至57.39%。综上所述,该固定化微胶囊能有效保护益生菌在胃酸环境中存活,并在肠道实现高效、定位释放,具备作为口服递送载体的潜力。
图7 固定化凝胶珠在模拟胃肠液中的存活释放曲线
Fig.7 Survival release curve of the immobilized beads in simulated gastrointestinal fluids
2.5 优化MRS1026.4的冷冻干燥保护剂配方
为确保益生菌MRS1026.4在储存和应用中的高存活率,本研究开发并优化了一种复合冷冻干燥保护剂。
2.5.1 保护剂筛选与微观结构分析
本研究首先对6种保护剂进行筛选(图8-a),其中海藻糖、脱脂乳粉和菊糖表现出最佳保护效果,存活率分别达48.36%、43.21%和41.27%。扫描电镜(图8-b)观察揭示了不同保护剂对菌粉微观形貌的影响。单一保护剂下,样品结构差异显著:脱脂乳粉(图8-b1)呈不规则大孔片状,不利于菌体包埋;海藻糖(图8-b2)形成粗糙的颗粒聚集表面;而菊糖(图8-b3)则产生明显褶皱。相比之下,复合保护剂显著改善了微观形貌。脱脂乳粉的加入有效填充了菊糖的褶皱(图8-b4),并使海藻糖体系的表面更为光滑平整,形成了致密的膜状结构(图8-b5)。海藻糖与菊糖的复合(图8-b6)也同样体现了优化微观结构的协同效应。这种微观结构的优化是复合保护剂协同作用的外在体现,其内在保护机制可能涉及物理与生化层面的互补与增效。例如,脱脂乳中的蛋白质作为优良的填充剂和成膜剂,能够有效填补菊糖这类长链多糖形成的网状骨架中的孔隙或褶皱[23],共同构建出一个更为致密、均匀的物理屏障(图8-b4)。当海藻糖这类小分子保护剂加入时,则形成了“宏观包埋”与“微观稳定”的经典协同模式:脱脂乳或菊糖提供了宏观的结构支撑,而海藻糖则能渗透并作用于细胞表面,通过“水替代假说”在微观层面稳定细胞膜和蛋白质的生物活性构象(图8-b5)[24]。此外,海藻糖与菊糖的组合(如图8-b6)也体现了碳水化合物间的优势互补,即菊糖通过提高体系的玻璃化转变温度来增强物理稳定性[24-25],而海藻糖则提供关键的生化保护。
a-不同保护剂对乳酸菌冻干存活率的影响;b-不同保护剂配方冻干后的扫描电镜图
(1-脱脂乳粉;2-海藻糖;3-菊糖;4-脱脂乳粉+菊糖;5-脱脂乳粉+海藻糖;6-海藻糖+菊糖)
图8 冻干保护剂的筛选及微观结构
Fig.8 Screening and microst, mructure of cryoprotectants
a-脱脂乳质量分数;b-海藻糖质量分数;c-菊糖质量分数
图9 单因素试验优化冻干保护剂组分质量分数
Fig.9 Single-factor optimization of cryoprotectant component concentrations
2.5.2 单因素优化保护剂组分浓度
单因素试验结果显示(图9),脱脂乳粉、海藻糖和菊糖对冻干存活率的影响均呈单峰趋势,表明浓度过低保护不足,而浓度过高则会因渗透压、传质受阻等因素产生负面效应。其中,脱脂乳粉的最佳质量分数为16%(图9-a),其蛋白质能形成物理保护层,但浓度过高会导致黏度过大,阻碍水分升华与菌体复水[23]。海藻糖的最佳质量分数为12%(图9-b),它通过形成水化膜和玻璃态基质来稳定细胞,但质量分数过高会使外壳刚性过强,影响菌体复苏[24]。菊糖的最佳质量分数为16%(图9-c),主要通过形成玻璃态结构及协同增效发挥作用,但过量易引发结晶损伤细胞[24-25]。综上,通过单因素试验确定的脱脂乳粉、海藻糖和菊糖的最优质量分数分别为16%、12%和16%。
2.5.3 响应面法优化复合保护剂配方
为优化冻干保护剂配方,本研究采用响应面法考察了脱脂乳(A)、海藻糖(B)和菊糖(C)的浓度(设计与结果见附表11)。回归分析得到以存活率为响应值的二次多项式模型:存活率/%=-565.24+21.88A+32.24B+38.68C+0.70AB-0.53AC-0.52BC-0.90A2-1.21B2-0.89C2。方差分析(附表12)显示,该模型极显著(P<0.000 1)且失拟项不显著(P>0.05),其决定系数R2高达0.980 8,校正方差与预测方差差值小于0.2,证实模型拟合良好且可靠性高。F值分析表明,各因素对存活率的影响主次顺序为:脱脂乳粉>海藻糖>菊糖,其中前两者影响显著(P<0.05)。结合交互作用分析(附图3),模型预测的最佳工艺条件为:脱脂乳粉质量分数13.42%、海藻糖14.15%、菊糖12.95%,预测存活率为76.82%。按此配方进行的验证实验测得平均存活率为(79.64±4.90)%(附表13),与预测值无显著差异,证明该回归模型能准确地优化乳酸菌的冻干保护剂配方。
2.5.4 优化冻干粉的体外胃肠道耐受性评估
为评估优化后冻干工艺对菌株MRS1026.4活性的保护效果,本研究检测了其在体外模拟胃肠道中的存活能力(图10)。该冻干菌粉表现出优异的耐酸性,在模拟胃液中处理2 h和4 h后,存活率分别高达86.28%和82.31%。随后,在经历完整的“4 h胃液+6 h肠液”模拟消化后,菌株最终存活率仍维持在73.42%的高水平。统计学分析表明,相较于初始的2 h胃液组,(4 h胃液+4 h肠液)与(4 h胃液+6 h肠液)的存活率均显著降低(P<0.05),但与4 h胃液组相比差异不显著(P>0.05)。这一结果证明,优化后的复合冻干保护剂配方显著提升了菌株MRS1026.4对胃酸和胆盐的综合耐受性。
图10 优化冻干粉在体外模拟胃肠道中的存活率
Fig.10 Survival rate of optimized freeze-dried powder in simulated gastrointestinal tract in vitro
3 结论
本研究成功从传统发酵食品中筛选出4株具有降胆固醇潜力的乳酸菌。其中,L.paraplantarum MRS1026.2表现出最高的胆固醇去除能力(74.65%),而L.plantarum MRS1026.4则展现出优异的综合益生特性和胃肠道耐受性(存活率26.92%)。通过对降胆固醇反应体系的优化,确定了最佳条件,为后续功能评价提供了标准化方法。更重要的是,本研究证明了固定化和冷冻干燥是提升乳酸菌胃肠道存活率的有效手段:采用优化的海藻酸钠-魔芋胶-壳聚糖复合体系进行固定化,使MRS1026.2在模拟胃肠液中的存活率从几乎为零提升至57.39%。采用优化的脱脂乳-海藻糖-菊糖复合保护剂进行冷冻干燥,使MRS1026.4在模拟胃肠液中的存活率提升至73.42%。这些结果表明,通过合理的保护技术,可以显著增强乳酸菌的稳定性与生物利用度,为其在功能食品和医药领域的应用奠定了坚实的基础。未来的研究可进一步开展动物体内实验,验证其在体内的降胆固醇效果及对肠道菌群的调节作用;同时,从分子层面揭示其作用机制,特别是可利用代谢组学等技术,探究本研究中复合保护剂与菌体相互作用的细胞代谢基础,阐明其协同保护机理。
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