蜜蜂是重要的传粉昆虫,其肠道微生物群在营养、免疫和环境适应中发挥关键作用。有研究表明,蜜蜂肠道微生物组中95%～99%的菌群由9种优势细菌构成[1]。这些菌群可划分为2个功能类群:5种核心菌群和4种附属菌群。核心菌群含革兰氏阴性菌蜜蜂肠斯诺德氏菌(Snodgrassella alvi),栖蜜蜂吉列姆氏菌(Gilliamella apicola)[2]及革兰氏阳性菌乳杆菌(Lactobacillus) Firm-4、Firm-5和双歧杆菌属(Bifidobacterium)[3];附属菌群包括稀罕弗里希氏菌(Frischella perrara)[2]、蜜蜂巴尔通氏体(Bartonella apis)、蜜蜂大黄蜂菌(Bombella apis)[5]和葡糖杆菌属(Gluconobacter)中的一个特定类群“Alpha 2.1”[6]。作为核心菌群之一的双歧杆菌分离源多样,广泛分布于温血动物的肠道、污水、发酵或生牛奶,以及群居昆虫的后肠[7],目前已知有106个物种被归类为该属的成员。目前对蜂源双歧杆菌的研究主要集中在西方蜜蜂(Apis mellifera)和大黄蜂(Bombus spp.)上,而对亚洲本土蜂种的相关菌株研究仍较为匮乏。
蜂蜜是蜜蜂采集花蜜后,经体内酶和微生物共同转化形成的天然产物,主要成分包括水分、糖类、有机酸、矿物质、蛋白质、维生素及酚酸、黄酮等活性物质[8]。Bifidobacterium favimelis IMAU50987分离自云南省黑蜂巢蜂蜜,在先前对B.favimelis IMAU50987的API 50 CHL碳源利用实验中[9],B.favimelis IMAU50987对麦芽糖、蔗糖、棉子糖等9种碳源呈阳性反应,对乳糖和龙胆二糖呈弱阳性,与同属于星状双歧杆菌(Bifidobacterium asteroides)组的近缘菌株相比较,D-葡萄糖的阴性反应和淀粉与糖原的阴性反应只出现在B.favimelis IMAU50987中,表明其具备代谢复杂多糖(如淀粉、糖原)及寡糖(如棉子糖)的能力,但无法利用葡萄糖等单糖,表明其在碳源的利用能力上与近缘菌株有差异,碳源是微生物生长必不可少的成分,对生长速率、生物量积累以及代谢产物的生成都具有显著影响[10-11]。有研究表明,B.asteroides具有高度丰富和多样化的碳水化合物利用相关的基因[12-13],故解析碳源利用特征对菌株的潜在应用至关重要。
本研究的意义在于:1)首次系统报道云南省黑蜂巢蜂蜜源B.favimelis IMAU50987的碳源利用特征,为理解分离自蜂蜜及蜜蜂肠道双歧杆菌的生态适应性提供新见解;2)通过比较基因组学和泛基因组分析,揭示菌株功能基因构成,探究与近缘菌株的功能差异,说明其碳源利用特点;3)通过安全性评价,为该菌株的潜在应用提供科学依据,为B.favimelis IMAU50987的进一步开发和利用提供数据参考。
1 材料与方法
1.1 材料与仪器
B.favimelis IMAU50987分离自云南省黑蜂巢蜂蜜样品,由内蒙古农业大学乳品生物技术与工程教育部重点实验室乳酸菌菌种资源库提供;从NCBI Refseq数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/)下载,用于比较基因组学分析的10株菌的全基因组序列,菌株基本信息详见电子版增强出版附表1(https://doi.org/10.13995/j.cnki.11-1802/ts.044383,下同),分别是:B.xylocopae XV2T、B.polysaccharolyticum W8117T、B.mizhiense S053-2T、B.mellis Bin7 NT、B.actinocoloniiforme DSM 22766T、B.apousia W8102T、B.asteroides DSM 20089T、B.choladohabitans B14384H11T、B.indicum LMG 11587T和B.apis F753-1T;MRS培养基,英国Qxoid公司;L-半胱氨酸盐酸盐,北京酷来搏科技有限公司;琼脂,天津市英博生化试剂有限公司;抗菌药物药敏纸片,杭州微生物制剂有限公司。
表1 B.favimelis IMAU50987特有基因的KEGG功能注释
Table 1 KEGG functional annotation of genes specific to IMAU50987
通路名称ID基因名称功能描述淀粉和蔗糖代谢K00688PYG, glgPglycogen phosphorylaseK00690sucPsucrose phosphorylaseK00702cbpA_2cellobiose phosphorylaseK00705malQ4-alpha-glucanotransferaseK00847scrKfructokinaseK00963UGP2, galU, galFUTP-glucose-1-phosphate uridylyltransferaseK01179celAendoglucanaseK01182IMA, malLoligo-1,6-glucosidaseK01187malZalpha-glucosidaseK01193INV, sacAbeta-fructofuranosidaseK01200pulApullulanaseK01223bglA6-phospho-beta-glucosidaseK01810GPI, pgiglucose-6-phosphate isomeraseK01835pgmphosphoglucomutaseK05349bglXbeta-glucosidaseK05350bglBbeta-glucosidaseK16055TPStrehalose 6-phosphate synthase/phosphataseK25026glkglucokinase糖酵解/糖异生K00382DLD, lpd, pdhDdihydrolipoyl dehydrogenaseK00886ppgKpolyphosphate glucokinaseK01624FBA, fbaAfructose-bisphosphate aldolase, class IIK01785galM, GALMaldose 1-epimeraseK01803TPI, tpiAtriosephosphate isomerase (TIM)K04072adhEacetaldehyde/alcohol dehydrogenase
ZHJH-C1214C超净工作台、SX-500高压蒸汽灭菌锅,上海智城仪器制造厂;5810R台式高速离心机,德国Eppendorf公司;AR2202CN电子分析天平,奥豪斯仪器上海有限公司;CX33光学显微镜,日本OLYMPUS公司;LRH-CL/CA/CB系列恒温培养箱,上海一恒科学仪器有限公司。
1.2 实验方法
1.2.1 菌种活化和培养条件
将实验室前期真空冷冻干燥保藏在安瓿管中的B.favimelis IMAU50987,在添加了0.05%的L-半胱氨酸盐酸盐的改良MRS培养基中活化,采用平板划线法纯化菌株,35 ℃厌氧培养48 h后,挑取单个菌落接种于改良MRS液体培养基。连续培养至3代后将培养液以3 800 r/min离心5 min,弃去上清液,采用无菌的PBS对菌体沉淀洗涤2次。随后加入1.5 mL PBS充分振荡混匀,再次离心收集菌泥,用作全基因组重测序的样本。整个传代过程中,每代菌株均通过革兰氏染色镜检,观察菌体形态,以判定是否存在污染。
1.2.2 核泛基因集的构建
利用Prokka软件对基因组进行预测,并采用Roary软件对其核心基因组和泛基因组进行统计,以氨基酸一致性>90%为标准划分基因家族,构建核心基因集和泛基因集。
1.2.3 功能基因预测及注释
基于Prokka软件对氨基酸序列进行注释后的文件,在直系同源簇数据库(cluster of orthologous groups of proteins, COG)、碳水化合物活性酶数据库(carbohydrate-active enzymes database, CAZy)和KEGG中进行比对,对其编码基因序列进行注释。
1.2.4 基因组岛预测
在IslandViewer4网站(https://www.pathogenomics.sfu.ca/islandviewer/)选择IslandPath-DIMOB、SIGI-HMM和IslandPick 3种预测方法对B.favimelis IMAU50987的全基因组序列进行基因组岛预测和整合。
1.2.5 毒力基因和耐药基因的检索分析
通过耐药基因数据库(comprehensive antibiotic research database, CARD)对B.favimelis IMAU50987的耐药基因进行分析。利用基因组的蛋白序列与CARD数据库进行比对。筛选标准为Identity>85%和e-value<1e-15。使用毒力因子数据库(virulence factor database, VFDB)对B.favimelis IMAU50987的毒力基因进行分析。利用B.favimelis IMAU50987基因组蛋白序列与VFDB数据库进行比对。筛选标准为Identity>85%和e-value<1e-15。
1.2.6 抗生素敏感试验
采用纸片扩散法(Kirbv-Bauer法,K-B法)对菌株进行药物敏感性测试:取100 μL的B.favimelis IMAU50987的菌悬液均匀涂布于改良MRS固体培养基上,再将药敏片置于培养基表面,确保两纸片中心间距≥24 mm,且纸片边缘距琼脂边缘≥15 mm。37 ℃厌氧培养36 h后,依据CLSI标准,通过测量抑菌环直径判定菌株对药物的敏感性(敏感、中介或耐药)[14]。
2 结果与分析
2.1 核心基因构建系统发育树
为分析B.favimelis IMAU50987与近缘菌株的种间遗传进化关系,本研究基于Roary软件识别得到的88个核心基因,采用邻接法(neighbor-joining, NJ)构建系统发育树如图1所示,以分析菌株间的进化关系[15]。这11株菌的基因组大小为1.83～2.28 Mb,平均大小为(2.07±0.13) Mb,各基因组中编码序列(coding sequences, CDS)的平均数量为(1 573±100)个,GC含量范围为59.50%～63.50%,平均含量为(61.18±1.25)%。B.xylocopae XV2T与B.actinocoloniiforme DSM 22766T处于同一分支,亲缘关系较近,B.favimelis IMAU50987单独处于一个分支,与其他近缘菌株遗传距离较远。
图1 基于11株双歧杆菌的88个核心基因构建的系统发育树
Fig.1 Phylogenetic tree constructed based on 88 core genes from 11 Bifidobacterium strains
2.2 泛基因分析
为从泛基因水平进一步了解B.favimelis IMAU50987与近缘菌株的差异,利用B.favimelis IMAU50987与其近缘菌株的附属基因组绘制基因存在于缺失分布热图,如图2所示,每一行为一个基因,每一列对应一个菌株,其中蓝色表示该基因在菌株中存在,黄色则表示缺失。由图2可以看出菌株间的聚类趋势与分离源分离地无显著关联,且不同菌株之间附属基因存在一定差异,具有菌株特异性。菌株B.apousia W8102T、B.mizhiense S053-2T、B.polysaccharolyticum W8117T、B.asteroides DSM 20089T、B.apis F753-1T、B.choladohabitans B14384H11T和B.mellis Bin7 NT基因组成较为相似,而菌株B.actinocoloniiforme DSM 22766T、B.xylocopae XV2T、B.indicum LMG 11587T和B.favimelis IMAU50987基因组成差异较大,未表现出明显的聚集趋势。
图2 基因存在与缺失分布图
Fig.2 The presence and absence of genes based on the genome sequences
2.3 碳源利用能力分析
API 50 CHL是一种标准化的鉴定系统,通过检测菌株对49种碳源的发酵能力来评估其碳水化合物利用情况。在先前的实验研究中可以得到B.favimelis IMAU50987的API 50 CHL碳水化合物利用结果[9],9种碳源呈阳性反应,包括D-核糖、麦芽糖、蜜二糖、蔗糖、棉子糖、淀粉、糖原、苦杏仁苷、七叶苷;2种碳源呈弱阳性,包括乳糖和龙胆二糖,表型结果表明菌株IMAU50987具备代谢复杂多糖(如淀粉、糖原)及寡糖(如棉子糖)的能力。根据以往研究报道的近缘菌株的API 50 CHL糖发酵结果[16-22],将B.favimelis IMAU50987与其对比,详见电子版增强出版附表2,发现淀粉和糖原的阳性反应以及D-葡萄糖的阴性反应只出现在菌株IMAU50987中,说明菌株IMAU50987在碳源利用上与近缘菌株存在差异。
表2 B.favimelis IMAU50987编码的碳源代谢相关酶与关键基因汇总表
Table 2 Summary of carbon source metabolism-related enzymes and key genes encoded by IMAU50987
碳源基因名称酶学名称/功能描述EC号推测功能及代谢位置蔗糖sacA, scrB, gph蔗糖水解酶,蔗糖-6-磷酸水解酶,蔗糖磷酸化酶3.2.1.26,3.2.1.51,2.4.1.7将蔗糖转化为G-6-P与果糖;为双歧途径提供底物麦芽糖malE, malF, malG, malP麦芽糖结合蛋白,转运蛋白,麦芽糖-6-磷酸酶,麦芽糖磷酸化酶3.2.1.86,2.4.1.8通过ABC转运系统导入麦芽糖,经麦芽糖磷酸化酶分解为G-1-P棉子糖rafA, rafB, agaα-半乳糖苷酶,棉子糖转运蛋白,半乳糖苷水解酶3.2.1.22降解棉子糖为半乳糖、果糖和葡萄糖,促进寡糖利用淀粉amyA, malQ, glgPα-淀粉酶,4-α-葡聚糖转移酶,糖原磷酸化酶3.2.1.1,2.4.1.25,2.4.1.1降解复杂多糖为麦芽糖与麦芽三糖,为细胞内代谢提供底物葡萄糖ppgK, pgi多磷酸葡萄糖激酶,葡萄糖-6-磷酸异构酶2.7.1.63,5.3.1.9参与双歧途径下游代谢,但缺少有效摄取系统(如ptsG, glcU)
2.4 B.favimelis IMAU50987全基因组功能注释
2.4.1 COG注释结果
为了探究菌株碳源利用特征的分子机制,基于COG数据库对11株菌的基因组进行了功能注释,如图3-a所示,结果显示,共注释到4个功能层级,21个功能分类,其中碳水化合物运输和代谢(G族)基因占比最高(15.11%),其次为翻译、核糖体结构和生物发生(J族,11.57%)、氨基酸转运和代谢(E族,9.91%)和转录(K族,8.08%),说明菌株具有较强的碳源代谢及蛋白质合成能力。而功能未知的S族基因的存在,表明仍存在大量待研究的功能基因。值得关注的是,仅菌株IMAU50987注释到细胞骨架(Z族)相关基因,提示其可能具有独特的结构特征。菌株IMAU50987与近缘菌株注释到的COG各类别基因的相对丰度总体差异较小,但菌株IMAU50987碳水化合物运输和代谢相关基因在基因组中的占比(13.9%)高于其他近缘菌株。
a-COG功能分类的UpSet图;b-CAZy注释结果热图
图3 B.favimelis IMAU50987及其近缘菌株的COG与CAZy注释结果
Fig.3 Results of COG and CAZy annotation of B.favimelis IMAU50987and reference strain
2.4.2 CAZy注释结果
为了进一步对菌株的碳水化合物利用能力进行分析,基于CAZy数据库对B.favimelis IMAU50987及其10株近缘菌株基因组进行注释,注释结构揭示了各菌株中碳水化合物活性酶的分布情况,具体结果见图3-b,共注释到3大类碳水化合物活性酶(GHs、GTs、CBMs)的25个亚类基因家族,GHs家族最为丰富,共注释到17个GHs家族的功能小类,其中GH13、GH3、GH32和GH65在B.favimelis IMAU50987和10株近缘菌株中都有被注释到,GH3、GH32含量较为丰富,GH3主要编码葡萄糖苷酶和木糖苷酶,二者广泛存在于细菌、真菌以及植物中,主要参与纤维素代谢,GH32家族可催化果聚糖类化合物中糖苷键的水解或合成,包含多种水解酶,如菊粉酶、蔗糖酶和果聚糖酶,以及具有转移活性的果糖基转移酶等;还注释到7个GTs家族,其中GT2、GT20、GT28、GT39和GT4在全部菌株中都被注释到,GT2广泛参与细胞壁多糖、糖脂和糖蛋白的生物合成,常见于细菌和真核生物;GT4在乳糖、蔗糖代谢及胞外多糖合成方面起重要作用;GT20通常涉及甘露糖代谢,可能影响宿主-微生物互作;GT28参与糖蛋白合成,在宿主适应性和生态位竞争中可能发挥作用;GT39研究相对较少,可能与特定糖基化途径有关。
碳水化合物链接模块(carbohydrate-binding modules,CBMs)是一类非催化结构域酶,有助于蛋白质与多糖的结合,主要作用是对碳水化合物的黏附。特别地,CBMs家族只在B.favimelis IMAU50987中被注释到,为CBM48。CBM48能够特异性识别并结合糖原或淀粉颗粒,帮助糖苷水解酶(如α-淀粉酶、糖原磷酸化酶)更高效地降解或合成多糖;以及辅助酶活性。CBM48的存在可能表明该菌株具有更强的糖原或淀粉降解能力,适合在富含这些多糖的环境中生存。
B.favimelis IMAU50987展现出了丰富且独特的组成特征,在GHs和GTs家族中表现出与近缘菌株的高度一致性,表明其具备稳定而核心的糖代谢系统,可能有助于其在肠道或是某些特定生态位中的适应能力;而其独有的CBM48结构域则突显了其在淀粉和糖原代谢方面的潜力,提示该菌株可能具备更强的多糖降解能力,在富含复杂碳源的环境中具有一定的生态优势。
2.4.3 KEGG注释结果
为了进一步探究菌株IMAU50987的功能基因分布和代谢能力,对其进行KEGG注释。注释结果见图4,显示菌株IMAU50987共有860个基因获得注释,346个基因未被明确分类,剩余514个基因分别归属于KEGG所涵盖的6大类通路:代谢、遗传信息处理、环境信息处理、细胞生长、生物体系统和人类疾病。其中,参与代谢相关通路的基因数量最多,而归入生物体系统相关通路的基因数量最少,其中,主要涉及的代谢途径包括碳水化合物代谢、核苷酸代谢和氨基酸代谢。以上结果进一步证明,该菌株在碳源代谢方面具有较强的潜力。在KEGG注释得到的二级通路中,碳水化合物代谢通路占据主要地位,其中注释最多的三级通路为淀粉和蔗糖代谢通路以及糖酵解/糖异生通路。
图4 B.favimelis IMAU50987的KEGG注释结果
Fig.4 KEGG annotation results of B.favimelis IMAU50987
为了进一步揭示B.favimelis IMAU50987编码的特有基因在碳源代谢中的作用,对其所含有的1 315个特有基因进行KEGG功能注释,得到与淀粉和蔗糖代谢通路以及糖酵解/糖异生通路相关的基因注释结果如表1所示。B.favimelis IMAU50987编码了多种参与碳水化合物分解、转化和利用的酶,主要包括:参与碳水化合物降解的酶,如内切葡聚糖酶、普鲁兰酶、纤维二糖磷酸化酶、β-半乳糖苷酶、α-葡萄糖苷酶等,这些酶能够高效降解如淀粉、普鲁兰糖、麦芽糊精和纤维二糖的多糖和寡糖,有助于B.favimelis IMAU50987利用复杂碳源而非单糖葡萄糖;以及参与碳水化合物转化与激活的酶,如糖原磷酸化酶、4-α-葡聚糖转移酶、葡萄糖激酶和果糖激酶,这些酶可以将糖类转化为如葡萄糖-6-磷酸、UDP-Glu等中间代谢产物,供能或参与生物合成,表明该菌株可能具备糖储存及快速动员机制;此外还保留了多种参与核心碳代谢的关键酶,包括葡萄糖-6-磷酸异构酶、果糖二磷酸醛缩酶、磷酸丙糖异构酶、磷酸葡萄糖变位酶等。这些酶广泛存在于糖酵解、戊糖磷酸途径以及糖异生等代谢网络中,虽然双歧杆菌不具备完整的糖酵解途径,但这些核心酶使其能够将多种糖源转化为三碳代谢中间体,并顺利进入双歧途径及其他中心碳代谢过程。
2.5 碳源代谢途径构建
对B.favimelis IMAU50987的碳源利用特性分析结果显示,该菌株对葡萄糖的利用呈阴性,为探究这一表型差异的分子机制,对其基因组进行功能注释与蛋白序列检索。结果表明,该菌株虽编码多种与葡萄糖代谢相关的酶类,如多磷酸葡萄糖激酶(polyphosphate glucokinase)和葡萄糖-6-磷酸异构酶(glucose-6-phosphate isomerase),但未检测到典型的葡萄糖摄取系统。具体而言,与磷酸转移酶系统(phosphotransferase system, PTS)相关的葡萄糖特异性转运蛋白基因(如ptsG、crr)以及主要协同转运蛋白超家族(major facilitator superfamily, MFS)相关的基因(如glcU、glcT)均未在基因组中检出。这一结果表明,B.favimelis IMAU50987虽具备葡萄糖代谢所需的部分下游酶类,但由于缺乏葡萄糖跨膜转运系统,其在表型水平上表现出对葡萄糖的低效摄取与利用。POKUSAEVA等[23]通过研究指出,双歧杆菌可以利用多种膳食碳水化合物,逃脱肠道上部的降解,其中许多是植物来源的寡糖和多糖,这是由双歧杆菌的基因组决定了这种对复杂的富含碳水化合物的胃肠道环境的明显代谢适应,因为它编码了大量预测的碳水化合物修饰酶。与此一致,B.favimelis IMAU50987可能更依赖对环境中寡糖和多糖的降解代谢,以获取生长所需碳源。
基于上述功能注释信息,结合KEGG代谢通路分析结果,整理了B.favimelis IMAU50987编码的碳源代谢相关酶类与关键基因,如表2所示,这些基因主要参与多糖降解、寡糖转运及双歧途径(bifid shunt)中的关键代谢反应,反映了该菌株在复杂碳源环境中的代谢适应特征。随后,如图5所示,结合基因组功能注释结果,对B.favimelis IMAU50987的主要碳源代谢通路进行了预测,主要包括3大模块:外源多糖的降解,中间产物的磷酸化与转化以及双歧途径。在外源多糖代谢部分,淀粉、蔗糖、纤维素等植物来源的寡糖和多糖分别通过α-淀粉酶、蔗糖水解酶、β-葡萄糖苷酶等分解为葡萄糖-1-磷酸、葡萄糖及果糖等中间产物。这些中间产物在葡萄糖激酶、果糖激酶的作用下进一步转化为葡萄糖-6-磷酸后,进入双歧途径(bifid shunt)。在该途径中,xfp编码的磷酸乙酰转移酶将葡萄糖-6-磷酸转化为乙酰磷酸、赤藓糖-4-磷酸等中间体,最后生成乙酸、乳酸等主要发酵产物。
图5 B.favimelis IMAU50987的主要碳源代谢途径预测
Fig.5 Prediction of carbohydrate metabolism pathway in B.favimelis IMAU50987
2.6 基因组岛预测
通过基因组学方法不仅可以分析微生物基因组间基因结构和进化关系,还能解析细菌基因组间的水平基因转移。基因组岛(genomic island, GI)作为一种整合移动元件,通过促进物种内或物种间的基因交换而作用于宿主菌的群体遗传,即通过不同宿主间水平基因转移(horizontal gene transfer, HGT)使受体菌获取大片段DNA序列,增加受体菌的多功能性和适应性,使某些细菌能够拥有全新的生态位[24-25]。B.favimelis IMAU50987基因组中共预测到5个基因组岛,预测结果见图6。基因组岛的总长度为43 784 bp,平均长度约为8 757 bp,涉及到多种蛋白质和酶的加工合成。其中最大的基因组岛长度为18 610 bp,包含15个基因;最小的基因组岛长度为4 400 bp,包含3个基因。
图6 B.favimelis IMAU50987基因组岛中的的基因统计分布
Fig.6 Statistical distribution of genes in gene island of B.favimelis IMAU50987
2.7 安全性分析
2.7.1 耐药基因及毒力基因分析
将B.favimelis IMAU50987的蛋白序列与CARD数据库含有的所有耐药基因序列进行比对,见电子版增强出版附表3,发现在核苷酸一致性>70%的情况下,共检索到2个耐药基因:Bado_rpoB_RIF、Bbif_ileS_MUP。其中利福平抗性由Bado_rpoB_RIF基因介导,研究证实其为长双歧杆菌和众多商业化益生菌株的固定属性;莫匹罗星则由Bbif_ileS_MUP介导:莫匹罗星抑制异亮氨酸-tRNA合成酶活性,阻碍蛋白质合成;而ileS突变使菌株对此抑制产生耐受。利用此抗性,莫匹罗星被用作双歧杆菌选择性培养基的成分[26]。将B.favimelis IMAU50987的蛋白序列与毒力因子数据库(VFDB)进行比对,在核苷酸一致性大于85%的情况下,未注释到毒力基因。
2.7.2 抗生素耐药性
评估菌株的抗生素敏感性是安全性评价中的关键环节之一,对菌株IMAU50987的抗生素耐药性进行检测,药敏试验结果表明,B.favimelis IMAU50987对丁胺卡那、庆大霉素、新霉素、苯唑西林、卡那霉素、米诺环素、头孢他啶、头孢拉定、头孢氨苄具有耐药性,具体结果见电子版增强出版附表4。
3 结论
本研究围绕研究团队从云南省黑蜂巢蜂蜜中分离鉴定得到的双歧杆菌新种B.favimelis IMAU50987及NCBI RefSeq数据库中属于B.asteroides组的10株近缘菌株进行了全基因组测序与比较基因组分析。结合功能注释结果发现,菌株IMAU50987编码的与碳水化合物代谢相关的基因与近缘菌株相比数量较多,提示其具有较强的碳源利用潜力。值得注意的是,该菌株具有特有的碳水化合物结合模块CBM48,CBM48的存在表明该菌株具有较强的糖原或淀粉降解能力,可能有助于其在富含复杂碳源的生态环境中生存与定植。
对菌株IMAU50987中特有基因的KEGG功能注释显示,其编码多种参与碳水化合物分解、转化与利用的酶类,主要富集于碳水化合物的降解,转化与激活以及糖代谢核心路径,包括淀粉和蔗糖代谢、糖酵解/糖异生等。这些结果说明该菌株具备高效降解二糖、多糖及寡糖的能力,并可能具有糖类储存与快速动员机制,有助于其在碳源动态变化环境中的竞争适应。进一步对蛋白序列进行分析发现,虽然该菌株中存在与葡萄糖代谢相关的基因,但未发现与葡萄糖特异性磷酸转移酶系统相关的核心转运蛋白基因(如ptsG)。这一缺失可能是其低效利用葡萄糖的主要原因之一,但其具体机制仍需进一步实验验证。此外,对可移动元件的预测结果显示,IMAU50987基因组中存在多个基因组岛,提示其在进化过程中可能通过水平基因转移获得了多样化的代谢能力,对其基因组多样性的形成具有重要作用。菌株IMAU50987的耐药基因、毒力基因分析和抗生素耐药性实验结果均表明其在遗传水平上具有良好的安全性。
综上所述,B.favimelis IMAU50987具有多样化且独特的碳源代谢能力,能有效利用植物来源的寡糖和多糖,体现出其对复杂碳源环境的适应性。该菌株中独特的功能基因与碳代谢相关酶的发现,为其特殊碳源偏好的遗传基础提供了证据,未来的研究将结合不同碳源诱导条件下的转录组学与代谢组学分析,对关键糖苷水解酶及糖转运系统的表达变化进行系统研究,从功能层面进一步揭示B.favimelis IMAU50987碳源利用差异的分子机制,明确其在多糖降解与利用中的核心基因网络。本研究为该菌株的深入功能挖掘和未来在食品、肠道微生态等领域的应用提供了基础数据与理论支持。
[1] MARTINSON V G, DANFORTH B N, MINCKLEY R L, et al.A simple and distinctive microbiota associated with honey bees and bumble bees:The microbiota of honey bees and bumble bees[J].Molecular Ecology, 2011, 20(3):619-628.
[2] KWONG W K, MORAN N A.Cultivation and characterization of the gut symbionts of honey bees and bumble bees:Description of Snodgrassella alvi gen.nov., sp.nov., a member of the family Neisseriaceae of the Betaproteobacteria, and Gilliamella apicola gen.nov., sp.nov., a member of Orbaceae fam.nov., Orbales ord.nov., a sister taxon to the order ‘Enterobacteriales’ of the Gammaproteobacteria[J].International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 2013, 63(Pt_6):2008-2018.
[3] TOOTIAIE S, MOHARRAMI M, MOJGANI N.Honeybee gut:Reservoir of probiotic bacteria[M].MOJGANI N, DADAR M.Probiotic Bacteria and Postbiotic Metabolites:Role in Animal and Human Health.Singapore:Springer Singapore, 2021:221-236.
[4] ENGEL P, KWONG W K, MORAN N A.Frischella perrara gen.nov., sp.nov., a gammaproteobacterium isolated from the gut of the honeybee, Apis mellifera[J].International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 2013, 63(Pt_10):3646-3651.
[5] JEYAPRAKASH A, HOY M A, ALLSOPP M H.Bacterial diversity in worker adults of Apis mellifera capensis and Apis mellifera scutellata (Insecta:Hymenoptera) assessed using 16S rRNA sequences[J].Journal of Invertebrate Pathology, 2003, 84(2):96-103.
[6] ALI KHAN K, AL-GHAMDI A A, GHRAMH H A, et al.Structural diversity and functional variability of gut microbial communities associated with honey bees[J].Microbial Pathogenesis, 2020, 138:103793.
[7] LI T T, ZHANG H X, GU C T.Bifidobacterium mizhiense sp.nov., isolated from the gut of honeybee (Apis mellifera)[J].International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 2022, 72(5):005390.
[8] KHAN I U, DUBEY W, GUPTA V.Medicinal properties of honey:A review[J].International Journal of Pure &Applied Bioscience, 2014, 2(5):149-156.
[9] LI Y, SONG Q J, YANG H J, et al.Bifidobacterium favimelis sp.nov., isolated from black comb honey[J].International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 2024, 74(11):006573
[10] S
NCHEZ-CLEMENTE R, GUIJO M I, NOGALES J, et al.Carbon source influence on extracellular pH changes along bacterial cell-growth[J].Genes, 2020, 11(11):1292.
[11] 王佳, 郑诗琪, 冯鑫, 等.植物乳植杆菌AR113利用碳源情况研究[J].食品与发酵工业, 2023, 49(11):1-6.WANG J, ZHENG S Q, FENG X, et al.Research of carbon source utilization by Lactiplantibacillus plantarum AR113[J].Food and Fermentation Industries, 2023, 49(11):1-6.
[12] ZHENG H, PERREAU J, POWELL J E, et al.Division of labor in honey bee gut microbiota for plant polysaccharide digestion[J].Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2019, 116(51):25909-25916.
[13] BOTTACINI F, MILANI C, TURRONI F, et al.Bifidobacterium asteroides PRL2011 genome analysis reveals clues for colonization of the insect gut[J].PLoS One, 2012, 7(9):e44229.
[14] GAUR P, HADA V, RATH R S, et al.Interpretation of antimicrobial susceptibility testing using European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing (EUCAST) and Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) breakpoints:Analysis of agreement[J].Cureus, 2023, 15(3):e36977.
[15] MORITA H, TOH H, FUKUDA S, et al.Comparative genome analysis of Lactobacillus reuteri and Lactobacillus fermentum reveal a genomic island for reuterin and cobalamin production[J].DNA Research, 2008, 15(3):151-161.
[16] KILLER J, KOPE
N
J, MRZEK J, et al.Bifidobacterium actinocoloniiforme sp.nov.and Bifidobacterium bohemicum sp.nov., from the bumblebee digestive tract[J].International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 2011, 61(6):1315-1321.
[17] JIANG C S, LI C Y, GU C T.Bifidobacterium apis sp.nov., isolated from the gut of honeybee (Apis mellifera)[J].International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 2024, 74(4):006358.
[18] CHEN J T, WANG J N, ZHENG H.Characterization of Bifidobacterium apousia sp.nov., Bifidobacterium choladohabitans sp.nov., and Bifidobacterium polysaccharolyticum sp.nov., three novel species of the genus Bifidobacterium from honey bee gut[J].Systematic and Applied Microbiology, 2021, 44(5):126247.
[19] PINO A, BENKADDOUR B, INTURRI R, et al.Characterization of Bifidobacterium asteroides isolates[J].Microorganisms, 2022, 10(3):655.
[20] JIANG C S, LI C Y, GU C T.The Type Strain of Bifidobacterium indicum Scardovi and Trovatelli 1969 (Approved Lists 1980) is ATCC 25912, not DSM 20214, and Rejection to Reclassify Bifidobacterium coryneforme as Bifidobacterium indicum[J].Current Microbiology, 2024, 81(7):168.
[21] OLOFSSON T C, MODESTO M, PASCARELLI S, et al.Bifidobacterium mellis sp.nov., isolated from the honey stomach of the honey bee Apis mellifera[J].International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 2023, 73(3):005766.
[22] ALBERONI D, GAGG
A F, BAFFONI L, et al.Bifidobacterium xylocopae sp.nov.and Bifidobacterium aemilianum sp.nov., from the carpenter bee (Xylocopa violacea) digestive tract[J].Systematic and Applied Microbiology, 2019, 42(2):205-216.
[23] POKUSAEVA K, FITZGERALD G F, VAN SINDEREN D.Carbohydrate metabolism in Bifidobacteria[J].Genes &Nutrition, 2011, 6(3):285-306.
[24] BRITO I L.Examining horizontal gene transfer in microbial communities[J].Nature Reviews Microbiology, 2021, 19(7):442-453.
[25] ARNOLD B J, HUANG I T, HANAGE W P.Horizontal gene transfer and adaptive evolution in bacteria[J].Nature Reviews Microbiology, 2022, 20(4):206-218.
[26] 马昕玮. 分离自母婴肠道及母乳的长双歧杆菌的比较基因组学研究[D].呼和浩特:内蒙古农业大学, 2023.MA X W.Comparative genomics of Bifidobacterium longum isolated from maternal and infant intestinal tract and breast milk[D].Hohhot:Inner Mongolia Agricultural University, 2023.