藜麦(Chenopodium quinoa Willd.)作为联合国粮农组织认定的“全营养食品”,其蛋白质组成与人体需求高度匹配,且富含酚类化合物、黄酮及非淀粉多糖(non-starch polysaccharides, NSP)等生物活性成分[1]。NSP主要以阿拉伯木聚糖和β-葡聚糖构成,同时还含有阿拉伯半乳糖、果胶、纤维素等少量其他多糖物质。NSP具有降血糖、降血脂、抗氧化、抗肿瘤、免疫调节、缓解便秘、调节肠道功能等多种生理功能[2],在改善人类健康,预防因膳食引发的慢性疾病,如糖尿病、心血管疾病等方面具有显著作用。在现有的研究中,多针对NSP的制备、功效及应用进行研究,在预处理时,将蛋白等非多糖成分去掉。但目前研究发现谷物籽粒中的非淀粉多糖多与蛋白以结合态形式存在。而且大量研究已证实蛋白质和多糖会通过分子间相互作用形成复合物,在功能特性上展现出更优异的协同效应,远超单一组分的生物活性[3]。灵芝多糖[4]制备中,脱蛋白后降低了多糖的抗氧化能力。石雪等[5]研究也发现脱蛋白后的紫皮石斛多糖的自由基清除率低于未脱蛋白组。目前,在多糖制备纯化过程中,多利用三氯乙酸(trichloroacetic acid,TCA)沉淀法和Sevage法对其进行脱蛋白处理,这种处理方式会导致不同程度的糖苷键损失(1.14%～64.05%)[6]。糖苷键是多糖与蛋白质协同功能的关键媒介,对多糖的降血糖活性、生物活性有着重要意义[7]。不同的脱蛋白方式可能导致特定生物活性(免疫调节、抗肿瘤、抗氧化)的降低,相关蛋白质并非仅仅是惰性杂质。相反,它们对于赋予或增强这些活性的特异性和效力至关重要。这意味着功能实体通常是复合物,而非分离的多糖,在蛋白质与多糖相互作用下才能更好地发挥协同作用。为明确藜麦非淀粉多糖与蛋白的协同作用,本实验在酶联合热水浸提法提取藜麦非淀粉多糖的基础上,通过耐高温α-淀粉酶和中性蛋白酶对藜麦进行脱淀粉和脱蛋白处理,并运用傅里叶变换红外光谱(Fourier transform infrared spectroscopy,FTIR)、GC-MS、扫描电镜(scanning electron microscope,SEM)和X射线衍射(X-ray diffraction,XRD)等多种表征手段,解析藜麦非淀粉多糖与蛋白协同作用在脱蛋白前后结构变化规律;进一步在结构变化规律的基础上,通过测定持油力、膨胀力、起泡性、乳化性及DPPH自由基、ABTS阳离子自由基清除率等指标,阐明发挥其功能特性的影响。研究成果将为藜麦非淀粉多糖的高值化利用提供理论依据,并为开发新型天然食品或作为食品添加剂奠定技术基础。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
藜麦,玥晨农业科技有限公司;耐高温α-淀粉酶(40 000 U/g)和中性蛋白酶(50 U/mg),上海麦克林生化科技股份有限公司;DC蛋白测定试剂盒,美国Bio-Rad伯乐公司;本研究中使用的所有试剂和化学品均为分析级。
1.2 主要仪器设备
Nicolet iS5型FTIR仪,美国赛默飞世尔科技有限公司;D8 Advance XRD仪,德国布鲁克有限公司;Quorum SC 762溅射镀膜仪,日本Hitachi公司;ZEISS Sigma 500扫描电子显微镜、ZEISS Gemini SEM 300扫描电子显微镜,德国卡尔蔡司有限公司;TESCAN MIRA LMS扫描电子显微镜,捷克布尔诺泰思肯有限公司;凝胶渗透色谱仪(gel permeation chromatograph,GPC)、2414折射率探测器(high performance size exclusion chromatography, HPSEC),美国沃特世公司;6890 N/MSD 5973 GC-MS,安捷伦科技有限公司;恒温水浴锅,常州国华电器有限公司;DAWN HELEOS多角度激光散射仪、TSK G5000PW色谱柱,美国怀雅特技术公司;MB90ZH水分测定仪,上海平轩科学仪器有限公司;磁力搅拌器,上海京工实业有限公司;FW 100型高速粉碎机,天津泰斯特仪器有限公司;高速分散器,宁波新芝生物科技有限公司;离心机,湖南湘仪实验室仪器开发有限公司;RE-52 AA旋转蒸发器,上海亚荣生化仪器厂;INFINITE E PLEX酶标仪,帝肯奥地利有限责任公司;Zetasizer Nano ZS90马尔文激光颗粒计数仪,英国马尔文仪器有限公司;生化培养箱,上海森信实验仪器有限公司;ADVANTEC混合纤维素酯膜过滤器,日本Toyo Roshi Kaisha, Ltd。
1.3 试验方法
1.3.1 藜麦非淀粉多糖(quinoa non-starch polysaccharides,QNSP)与脱蛋白藜麦非淀粉多糖(deproteinized QNSP,D-QNSP)的制备
参考李楠等[8]方法并进一步修改。于150 mL锥形瓶中准确称取9.0 g藜麦粉,即料液比为1∶12(g∶mL)加入108 mL蒸馏水,在52 ℃下提取3 h。拿出冷却,将溶液pH值调节到6.0,按谷粉质量1%加入耐高温α-淀粉酶,在95 ℃水浴锅中进行酶解去淀粉30 min,碘液检测不含淀粉为止,冷却至室温后,溶液在4 000 r/min离心15 min。收集上清液,部分加入3倍体积95%乙醇(体积分数),醇沉12 h。收集沉淀冷冻干燥,得到QNSP。上述其余部分上清液调溶液的pH值为7.0,加入10%的中性蛋白酶(10 mg或100 mL),60 ℃水浴1 h,水浴温度100 ℃灭酶20 min,冷却至室温后4 000 r/min离心15 min。收集样液,旋蒸后加入3倍体积95%(体积分数)的乙醇,4 ℃醇沉12 h。收集沉淀冷冻干燥,得到D-QNSP。
1.3.2 QNSP与D-QNSP得率
藜麦非淀粉多糖得率按照公式(1)计算:
得率
(1)
式中:m1,藜麦粉质量,g;m2,藜麦非淀粉多糖质量,g。
1.3.3 藜麦非淀粉多糖的化学组成
采用苯酚-硫酸法(以D-葡萄糖为标准)测定QNSP和D-QNSP中的总糖含量[9]。利用Lowry法(以牛血清白蛋白为标准)测定其蛋白质含量[10]。采用磺胺酸/羟二苯法(以葡萄糖醛酸为标准)测定糖醛酸含量[11]。
1.3.4 FTIR测定
本研究采用KBr压片法制备样品,将藜麦非淀粉多糖样品充分研磨,将藜麦非淀粉多糖样品研磨后与KBr混合压片,在400～4 000 cm-1波数范围内进行FTIR扫描,以鉴定其主要官能团。
1.3.5 分子质量测定
藜麦非淀粉多糖在蒸馏水(2.0 mg/mL)中溶解,用3.0 μm混合纤维素酯膜过滤器过滤。将0.5 mL的样品溶液加载到TSK G 5000PW柱(7.5 mm×600 mm)多角度激光散射系统和折射率探测器。HPSEC系统利用0.15 mol/L NaNO3和质量分数0.02% NaN3作为流动相,流速0.4 mL/min。采用ASTRA 5.3软件(Wyatt Technology Corp)计算平均分子质量(Mw)。
1.3.6 单糖组成
分别称取3.0 mg QNSP和D-QNSP粉末样品加入0.5 mL 4 mol/L三氟乙酸(trifluoroacetic acid,TFA),在100 ℃下水解6 h。水解产物用硼氘化钠(NaBD4)还原,然后用乙酸酐乙酰化。单糖组成分析采用GC-MS分析,配备HP-5MS毛细管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)。
1.3.7 SEM观察
将QNSP及D-QNSP样品分别黏附于导电胶上,使用Quorum SC 762溅射镀膜仪以10 mA电流进行喷金处理,随后通过SEM观察样品形貌,其加速电压为3 kV。每个样品均重复拍照3次,以有效排除样品自身干扰及仪器系统误差,确保观测结果的准确性和可靠性。
1.3.8 XRD分析
将QNSP及D-QNSP冻干样品置于载玻片上,使用XRD仪测定,扫描角度5°～90°,扫描速率2°/min,光源为Cu-Kα射线,管电压40 kV,电流40 mA。
1.3.9 持油力
称取一定质量的QNSP及D-QNSP粉末于15 mL的离心管中,加入10 mL色拉油在离心管中后,涡旋20 min,5 000 r/min离心20 min,测湿重。持油力按公式(2)计算:
持油力
(2)
式中:m1,样品质量,g;m2,样品吸油后质量,g。
1.3.10 水分含量
样品中水分含量的测定方法参照GB 5009.3—2016《食品安全国家标准 食品中水分的测定》进行测定。
1.3.11 溶解度
分别取QNSP及D-QNSP 1.0 g加入100 mL蒸馏水中,使用磁力搅拌器搅拌1 h使其充分溶解,离心(4 000 r/min、20 min)去除沉淀。取上清液至恒质铝盒内,于105 ℃烘干至恒重。溶解度按公式(3)计算:
溶解度
(3)
式中:m1,样品烘干后的质量,g;m2,初始样品质量,g。
1.3.12 膨胀力
分别称取QNSP及D-QNSP 1.0 g于干燥的10 mL量筒中,记录此时刻度V0,加入8 mL蒸馏水,混合均匀后室温静置18 h,记录膨胀后的体积V1按公式(4)计算膨胀力:
(4)
式中:Csw,膨胀力;V1,样品膨胀后的体积,mL;V0,样品初始体积,mL;m,样品质量,g。
1.3.13 粒径和电位的测定
将QNSP及D-QNSP溶于蒸馏水中配制3 mg/mL的多糖溶液,测定前过水系膜0.22 μm用纳米粒度和电位分析仪测定样品的粒径大小和电位。
1.3.14 起泡性及其泡沫稳定性
温度为25 ℃,pH值为7,配制质量分数为1%、2%、3%、4%、5%的QNSP及D-QNSP溶液,研究质量分数条件下起泡性及泡沫稳定性的影响。配制质量分数2%,温度25 ℃,pH值为3、5、7、9、11的QNSP及D-QNSP溶液,研究pH值对起泡性及泡沫稳定性的影响。
称取QNSP及D-QNSP粉末配制成溶液,取溶液10 mL置于50 mL的离心管中,在高速分散器中10 000 r/min的转速搅打1 min,记录泡沫体积,停止搅打后,将样品静置30 min,随后记录泡沫体积,体积之比可视为泡沫稳定性(foam stability,FS)。起泡能力(foam capability,FC)按公式(5)计算,FS按公式(6)计算:
(5)
(6)
式中:V1,初始泡沫体积,mL;V0,样品溶液体积,mL;V2,30 min后泡沫体积,mL。
1.3.15 乳化性及其乳化稳定性
在温度为25 ℃,pH值为7,配制质量分数为1%、2%、3%、4%、5%的QNSP及D-QNSP的样液,分别取10 mL样液,并加入色拉油10 mL于高速分散器中2 800 r/min乳化2 min后1 300 r/min离心5 min,记录乳化层体积,实验重复3次确保准确性。研究质量分数对其乳化性和乳化稳定性的影响。配制质量分数2%,温度25 ℃,pH值为3、5、7、9、11的QNSP及D-QNSP溶液,研究pH值对其乳化性及乳化稳定性的影响。
将制备好的乳化样品转移至80 ℃恒温水浴锅中进行热处理,持续30 min。随后立即对样品进行冰水浴冷却处理,持续15 min,最后,将冷却后的样品在1 300 r/min离心5 min。EC和ES分别按公式(7)和(8)计算:
(7)
(8)
式中:V1,初始乳化体积,mL;V0,样品溶液体积,mL;V2,保持乳化层体积,mL。
1.3.16 DPPH自由基清除能力的测定
参考DPPH自由基清除法,使用体积分数为95%乙醇配制浓度为0.1 mmol/L的DPPH溶液。取2 mL不同浓度的待测样品进行实验(0.312 5、0.625、1.25、2.5、5.0、10.0 mg/mL)向样品中加入2 mL DPPH溶液,充分混匀后于避光环境中静置反应30 min。随后,以5 000 r/min的速度离心5 min,取上清液于517 nm波长处测定吸光度。将蒸馏水代替样品溶液进行空白组调零。使用维生素C作为阳性对照组,每个样品重复测定3次,取平均值。依据公式(9)计算DPPH自由基清除率:
DPPH自由基清除率
(9)
式中:A0,空白组吸光值,2 mL蒸馏水加入2 mL DPPH溶液;A1,样品组吸光值,2 mL不同浓度待测样品加入2 mL DPPH溶液;A2,体积分数为95%乙醇代替DPPH反应液所得吸光值,2 mL不同浓度待测样品加入2 mL体积分数为 95%乙醇溶液。
1.3.17 ABTS阳离子自由基清除能力的测定
依据ABTS阳离子自由基清除方法,以蒸馏水作为溶剂分别制备7 mmol/L的ABTS溶液和2.5 mmol/L的过硫酸钾溶液,将2种溶液各自定容至10 mL容量瓶中。随后将上述2种溶液转移至烧杯内充分混合,在避光环境下静置反应12 h,制得ABTS储备液。取该储备液并采用体积分数为95%乙醇溶液进行稀释为734 nm下OD值为0.70±0.02,即得到ABTS工作液。取1 mL不同浓度待测样品(0.312 5、0.625、1.25、2.5、5.0、10.0 mg/mL)与2 mL ABTS工作液置于5 mL离心管中充分混合均匀,于避光条件下反应10 min。使用紫外可见分光光度计在734 nm波长处测定吸光值记为A1。以体积分数为95%乙醇替代样品溶液进行相同操作,测得吸光值记为A0;另以体积分数为95%乙醇替代ABTS工作液,按同样流程测定吸光值记为A2。实验以维生素C作为阳性对照,每个样本平行操作3次。ABTS阳离子自由基清除率的计算如公式(10)所示:
ABTS阳离子自由基清除率
(10)
式中:A0,为空白组吸光值,1 mL体积分数为 95%乙醇加入2 mL ABTS工作液;A1,为样品组吸光值,1 mL不同浓度待测样品加入2 mL ABTS工作液;A2,1 mL不同浓度待测样品加入2 mL体积分数为 95%乙醇溶液。
1.3.18 统计分析
所有实验设置3次平行样本,数据以“平均值±标准差”呈现。统计分析使用GraphPad Prism 9.0软件完成,以P<0.05为显著差异,具有统计学意义。
2 结果与分析
2.1 QNSP和D-QNSP的化学成分和结构表征
2.1.1 QNSP和D-QNSP的化学成分
表1结果显示为QNSP和D-QNSP的得率和化学成分。将藜麦非淀粉多糖脱蛋白后,D-QNSP中蛋白质含量显著降低7.26%,总糖含量增加2.36%。原本与蛋白质结合的藜麦非淀粉多糖在经中性蛋白酶水解后,蛋白质含量显著降低7.26%,总糖含量有所增加2.36%。QNSP和D-QNSP得率和化学成分的变化和CAO等[12]研究结果相似。脱蛋白后,使多糖中更多的侧链单糖(如阿拉伯糖、半乳糖)得以暴露,同时导致与蛋白链接的游离糖醛酸,含量上升。脱蛋白的主要作用在于处理断开蛋白质-多糖间的非共价键或共价键,因此多糖主链糖苷键骨架未破坏,分子质量相对稳定。
表1 QNSP和D-QNSP的提取率、化学成分、单糖分析、重均分子质量
Table 1 Extraction rate, chemical composition, monosaccharide analysis, and weight-average molecular weight of QNSP and D-QNSP
多糖产率/%总糖/%蛋白质/%糖醛酸/%单糖组成/%单糖相对含量/%单糖保留时间/min重均分子质量/kDaQNSP5.28±0.3579.56±3.2511.21±0.381.81±0.21鼠李糖0.30±0.0230.54半乳糖醛酸0.77±0.0936.803葡萄糖96.02±0.8950.092半乳糖0.75±0.0953.468木糖0.23±0.0454.958阿拉伯糖1.33±0.1363.75215.21±0.85D-QNSP6.12±0.7581.92±1.973.95±0.122.09±0.24鼠李糖0.53±0.0530.54半乳糖醛酸1.60±0.1536.912葡萄糖92.80±0.8250.23半乳糖1.43±0.1253.625木糖0.56±0.0655.108阿拉伯糖2.28±0.1563.84828.97±1.24
2.1.2 QNSP和D-QNSP的结构表征
2.1.2.1 QNSP和D-QNSP的FTIR分析结果
从图1可知,QNSP和D-QNSP均具有糖类物质的吸收峰,在红外光谱分析中:QNSP在3 376.81 cm-1处、D-QNSP在3 363.47 cm-1处的吸收峰,归因于糖类分子内或分子间O—H和N—H的伸缩振动[13]。D-QNSP峰值明显降低表明N—H伸缩振动(蛋白质特征)减少;QNSP于2 928.96 cm-1呈现的吸收峰及D-QNSP在2 934.67 cm-1处显示的吸收峰,则源于亚甲基(—CH2)中C—H的伸缩振动;QNSP在1 656.86 cm-1处出现的吸收峰发生红移与D-QNSP在1 658.76 cm-1相比,推测可能由藜麦非淀粉多糖中N—H的伸缩振动所致多糖与蛋白通过N—H作用力链接呈现出结合态[14];QNSP在1 640 cm-1处的吸收峰可能是C
O伸缩振动,而D-QNSP此处峰值明显减弱表明有效的去除了蛋白质组分。QNSP在1 630 cm-1处的吸收峰是反映蛋白质二级结构最显著的振动带与蛋白质酰胺I带吻合,1 540 cm-1处的吸收峰属于蛋白质酰胺II带的特征位置。QNSP在1 151.83 cm-1出现的吸收峰及D-QNSP 在1 150.87 cm-1出现的吸收峰,可能是因为C—O—C伸缩振动导致的此处出现明显吸收峰,是糖苷键的特征峰,表明多糖链中存在典型的糖苷键连接;QNSP于877.40 cm-1处呈现的吸收峰与D-QNSP 在879.30 cm-1处显示的吸收峰,均归属于β-D-吡喃糖C—H变角振动的特征吸收峰。这一光谱特性揭示,该非淀粉多糖结构中存在β-D-吡喃葡萄糖环,且葡萄糖分子通过β-糖苷键形式实现连接。该实验结果与MA等[15]研究结果相似,研究显示在895 cm-1处的最小吸收峰与β-D-吡喃葡萄糖的特征吸收峰相对应,说明藜麦中β-葡聚糖的基本结构主要是β-D-吡喃葡萄糖链接。酰胺Ⅰ、Ⅱ、带的共存及其与脱蛋白后的显著差异,明确证明QNSP中存在通过静电作用与多糖结合的蛋白质成分。
图1 QNSP与D-QNSP的FTIR透射光谱
Fig.1 FTIR transmission spectra of QNSP and D-QNSP
2.1.2.2 QNSP和D-QNSP的分子质量分析
如图2所示,QNSP在洗脱时间为17.12～21.43 min时出现了一个对称的单峰,说明QNSP的分子分布相对均匀,出峰时间晚,说明分子构象致密[16],平均分子质量为(15.21±0.85) kDa。D-QNSP在洗脱时间为16.93～21.51 min时也出现了一个单峰但相较于QNSP略宽,轻微右移拖尾,反映分子质量分布增大,存在构象舒展,可能与脱蛋白后分子链伸展,体积增大有关。D-QNSP的分子分布同样相对均匀,是一种均质的非淀粉多糖。有研究表明,谷物非淀粉多糖的分子质量范围为102～106 Da,具体取决于非淀粉多糖的来源。另外研究发现,QNSP的平均分子质量比D-QNSP的平均分子质量低,这可能是由于蛋白质与多糖通过共价键或非共价作用(如氢键、疏水作用)结合糖链形成致密折叠结构的复合物,加入酶脱蛋白导致释放出原本被包裹或束缚的多糖链,打开多糖链原有的空间构象如螺旋或折叠结构。QNSP的平均分子质量在合理范围值内。此外,YANG等[17]的研究结果表明,分子质量较低且结构较为紧密的多糖通常展现出更优的生物活性,因此本研究中相较于D-QNSP,低分子质量、结构紧密的QNSP具有较高的抗氧化活性。
a-QNSP的分子质量;b-D-QNSP的分子质量
图2 分子质量
Fig.2 Molecular weight
2.1.2.3 QNSP和D-QNSP的单糖组成分析
在本研究中,使用GC-MS分析了QNSP和D-QNSP的单糖组成。如表1和图3所示,QNSP的主要单糖是由葡萄糖(96.02±0.89)%、阿拉伯糖(1.33±0.13)%、半乳糖醛酸(0.77±0.09)%、半乳糖(0.75±0.09)%、鼠李糖(0.30 ±0.02)%和木糖(0.23±0.04)%组成;然而,这些组成在D-QNSP中有所不同,其中葡萄糖(92.80±0.82)%有所下降,而阿拉伯糖(2.28±0.15)%、半乳糖醛酸(1.60±0.15)%、半乳糖(1.43±0.12)%、鼠李糖(0.53±0.05)%和木糖(0.56±0.06)%单糖组成含量有所上升。QNSP和D-QNSP的单糖组成变化较小,脱蛋白前后本身结构未发生变化,因蛋白酶的降解作用去除了与多糖共价或非共价结合的蛋白质,从而使这些原本被遮蔽的单糖充分暴露,同时导致主链葡萄糖的相对占比下降。经酶联合提取后的藜麦非淀粉多糖的单糖组成结果与MA等[15]研究结果相似,研究显示藜麦β-葡聚糖(quinoa β-glucan,QBG)主要由葡萄糖(Q+:93.34%,Q-:95.52%)组成,还含有少量的阿拉伯糖(Q+:4.43%,Q-:3.15%)和木糖(Q+:2.23%,Q-:1.34%)。脱蛋白后,阿拉伯糖(4.43±0.35)%和木糖(2.23±0.25)%的含量略有增加,而葡萄糖(93.34±0.73)%的含量略有下降。
a-单糖标准品的GC-MS色谱图;b-QNSP的GS-MS色谱图;c-D-QNSP的GS-MS色谱图
图3 单糖组成
Fig.3 Monosaccharide composition
2.1.2.4 QNSP和D-QNSP的表观形貌观测
如图4所示,QNSP的表面较为饱满,可能反映了其原始结构的特性。QNSP的颗粒较小,呈不规则块状聚集体,表面较为粗糙,有明显的孔洞和不规则形态,显示出一定的颗粒聚集现象,表面存在明显的蛋白附着,非淀粉多糖与蛋白质可能存在结合态。而D-QNSP的表面则较为空洞,呈多孔海绵状网络,结合XRD图谱结晶峰的弥散现象这可能是由于结合蛋白在非淀粉多糖的表面有效去除,去除后表面变得更均一,减少了粗糙的结构,使多糖链得以充分舒展并有序排列。D-QNSP的颗粒则相对大一些,形状更为规则,表面显得更加致密,大孔洞较少,小孔洞相对较多,与脱去蛋白后原蛋白质分子留下的空间相关,且分布不规则,但颗粒分布较为均匀。这种形态和表面特性的差异则有可能影响QNSP和D-QNSP的物理和化学性质,进而影响了它们的应用潜力。
a-D-QNSP;b-QNSP
图4 藜麦非淀粉多糖(QNSP和D-QNSP)的扫描电镜形貌
Fig.4 Morphology of scanning electron microscopy of quinoa non-starch polysaccharide (QNSP and D-QNSP)
2.1.2.5 QNSP和D-QNSP的XRD分析结果
如图5所示,QNSP和D-QNSP的XRD图谱均展现出多个显著衍射峰,这意味着二者均具有晶体结构特征,这表明两者都具有晶体结构。衍射峰的位置和强度在QNSP和D-QNSP之间存在差异,这反映了它们晶体结构的不同,脱蛋白前复合物的结晶度相对较高,进而稳定复合物的构象。在较低2θ角度范围内(约10°～20°),多糖-蛋白复合物可能具有一定的结晶结构或有序排列区域。QNSP的衍射峰对应β-折叠构象,但D-QNSP的衍射峰,可能稍微向高角度偏移,说明其晶面间距减小,晶体结构更加紧密,蛋白质的去除导致多糖的结晶度下降或有序结构被破坏。随着2θ角度的增加,两者的衍射强度均逐渐减弱,但D-QNSP在高角度范围内的衍射强度可能相对更低,这进一步支持了其晶体结构在高角度范围内较弱或不存在的观点。去除蛋白质后,多糖分子链的有序排列区域得以释放,晶面间距可能增大,2θ角度减小,对应峰左移,反映结晶度或结晶结构的完整性提升。QNSP和D-QNSP之间的晶体结构差异可能源于它们的化学结构、分子排列或晶体缺陷等方面的不同。脱蛋白后结晶度减弱,导致功能衰减这些差异可能进一步影响它们的物理和化学性质,如溶解度、热稳定性等。
a-QNSP;b-D-QNSP
图5 藜麦非淀粉多糖的XRD图谱
Fig.5 X-ray diffraction pattern of quinoa non-starch polysaccharide
2.2 两种藜麦非淀粉多糖的理化性质和抗氧化活性
2.2.1 QNSP和D-QNSP的理化性质
2.2.1.1 QNSP和D-QNSP的水分含量、持油力、膨胀力和溶解度
测定非淀粉多糖的理化特性,如水分含量、溶解性、持油性和膨胀力等,能为其在食品领域的应用提供重要参考。如表2所示,QNSP的溶解度达78.30%,而D-QNSP的溶解度达到86.37%,非淀粉多糖中含有不溶于水的戊聚糖及其他杂质,影响了其完全溶解。持油性这一指标衡量了物质对油脂的结合能力,QNSP吸附油脂较高于D-QNSP约0.40 g/g,这一特性不仅能减少人体对脂肪的吸收,还有助于改善食品的口感,持油力的增加可以提升食品的贮藏稳定性[18]。QNSP的膨胀力可达到0.33 mL/g,D-QNSP的膨胀力可达到0.25 mL/g,因此具有被开发为辅助减肥的代餐产品潜力。脱蛋白处理可能改变QNSP的表面电荷,影响其在水中的溶解性和聚集行为。在QNSP脱蛋白后溶解性提升,糖醛酸增加可能导致分子间氢键增强形成更大的颗粒。
表2 QNSP和D-QNSP的水分含量、持油力、膨胀力和溶解度
Table 2 Water content, oil holding power, swelling power and solubility of QNSP and D-QNSP
样品水分含量/%持油力/(g/g)膨胀力/(mL/g)溶解度/%粒径/nm电位/mVQNSP5.24±0.016.10±0.050.33±0.0678.30±0.25204.97±3.65-27±0.91D-QNSP5.22±0.025.70±0.090.25±0.0486.37±0.32374.76±4.33-20±0.56
2.2.1.2 QNSP和D-QNSP的起泡性和起泡稳定性
起泡性及其起泡稳定性是决定产品感官品质、质构特征及功能性的关键指标。如图6-a所示,不同百分浓度QNSP起泡性和起泡稳定性的影响呈现出显著差异(P<0.05)。整体趋势表明,随着2种多糖浓度的增加,QNSP和D-QNSP的起泡性、起泡稳定性均显著提升,当质量分数为5%时,起泡能力和起泡稳定性均达到峰值,分别是64.33%和58.53%。相比D-QNSP的起泡性及其起泡稳定性均明显降低,在质量分数2%时QNSP比D-QNSP起泡性升高17.50%,起泡稳定性升高19.41%。脱蛋白处理后,D-QNSP的起泡性、起泡稳定性普遍低于QNSP,可能与分子间作用力变化相关,脱蛋白处理可能破坏这一相互作用,导致起泡性能下降,蛋白质与多糖形成协同作用,增强起泡的稳定性,这一结果与张权等[19]研究结果一致。研究发现,多糖与大豆分离蛋白复合后,大豆分离蛋白的结构进一步折叠,主要通过非共价键或共价键与多糖相互作用。这些复合物的泡沫稳定性均高于单一的大豆分离蛋白,且随着多糖浓度的增加而增加[20]。
a-QNSP;b-D-QNSP
图6 不同质量分数条件下QNSP和D-QNSP起泡性及其起泡稳定性变化
Fig.6 Changes of foamability and its foamability stability of QNSP and D-QNSP at different concentrations
注:不同大写字母代表稳定性组别显著性差异,不同小写字母代表起泡性组别显著性差异(P<0.05)(下同)。
如图7-a所示,不同pH值对QNSP起泡性和起泡稳定性均有显著影响(P<0.05)。实验结果表明,在pH 7时QNSP展现了最优的泡沫性能,其起泡性能与起泡稳定性达到峰值,表明此条件下QNSP具有最优的泡沫性能,这是因为在中性条件下非淀粉多糖的溶解度和界面活性较好,有助于提高泡沫的稳定性。而在pH 5时,QNSP和D-QNSP起泡性高,但稳定性低,可能是因为此时pH值接近QNSP体系中蛋白质的等电点,导致蛋白质溶解度下降,影响气-液界面吸附能力[21]。可以看出在强酸强碱条件下不利于QNSP形成稳定泡沫。已有研究表明,非淀粉多糖在pH 7条件下的溶解度和界面活性较佳,有助于提高泡沫的稳定性。如图7-b所示,pH 7时D-QNSP的起泡性和起泡稳定性仍然具有显著性(P<0.05),但与QNSP相比,pH 7相同条件下D-QNSP起泡性显著降低,D-QNSP起泡稳定性也有所降低。
a-QNSP;b-D-QNSP
图7 不同pH值条件下QNSP和D-QNSP起泡性及其起泡稳定性变化
Fig.7 Changes of foamability and its foamability stability of QNSP and D-QNSP at different pH values
2.2.1.3 乳化性和乳化稳定性
在食品生产加工过程中,加入非淀粉多糖可以对其附加值有所提升,乳化性及其稳定性是决定液态或半固态食品均一性、感官特性及保质期的核心参数。是确保食品品质、投入工业生产的关键性指标。
如图8所示,QNSP及D-QNSP的乳化性随着质量分数的增大而升高,而乳化稳定性则在质量分数2%时达到峰值,然后开始随着质量分数的升高而降低(P<0.05)。QNSP相比较D-QNSP的乳化性高出1.84%。而QNSP和D-QNSP乳化稳定性均在质量分数2%条件下达到峰值,QNSP相比较D-QNSP的乳化稳定性提高0.95%。QNSP的乳化性和乳化稳定性相比D-QNSP具有上升趋势。这可能是由于蛋白质与多糖的协同作用,增强了乳液的稳定性。研究表明,藜麦醇溶蛋白具有良好的乳化性(943.32 m2/g)和乳化稳定性(54.68%)。因此,蛋白质的存在可能增强了QNSP的乳化性能[22]。而经过脱蛋白处理后,D-QNSP的乳化性和乳化稳定性可能有所下降。这可能是由于缺乏蛋白质的界面活性作用,导致乳液的稳定性降低。
a-QNSP;b-D-QNSP
图8 不同质量分数条件下QNSP和D-QNSP的乳化性及其稳定性变化
Fig.8 Changes emulsification and its stability of QNSP and D-QNSP at different concentrations
根据图9所示,不同pH值条件对QNSP的乳化性和乳化稳定性具有显著影响(P<0.05)实验结果表明,QNSP乳化性和乳化稳定性随pH值升高均呈现先上升后下降的趋势,并在pH 7条件下达到峰值。在pH 3的酸性条件下可能导致QNSP结构变化,降低其在油水界面的吸附能力,使乳化性及其稳定性下降。随着pH值升高至5,QNSP与D-QNSP乳化性及其稳定性有所提升。可能归因于QNSP在该pH值下的溶解性和界面吸附能力增强。pH 7条件下QNSP与D-QNSP具有最佳的界面活性和溶液稳定性。pH 9条件下乳化性及其稳定性又下降,说明QNSP与D-QNSP在弱碱性环境中的乳化能力有所减弱,但仍保持一定稳定性。pH 11条件下可能由于强碱条件下破坏QNSP分子结构,导致乳液难以稳定。
a-QNSP;b-D-QNSP
图9 不同pH值条件下QNSP和D-QNSP乳化性及其稳定性变化
Fig.9 Changes of emulsification and its stability of QNSP and D-QNSP at different pH conditions
在未脱蛋白处理的样品中,QNSP含有相对较高蛋白质含量,这些蛋白质可能与多糖协同作用,相关研究显示,蛋白质与多糖的相互作用可提升乳液的乳化及稳定性能。蛋白质作为天然表面活性剂,可降低油水界面张力,在界面形成稳定吸附层以维持乳液稳定[23]。鉴于QNSP在乳化性能测试中表现出优异的界面活性,可考虑将其作为食品级稳定剂或增稠剂应用于含乳食品体系,通过调控界面吸附层结构提升产品的贮藏稳定性与感官品质。
2.2.2 QNSP和D-QNSP的抗氧化活性
通过QNSP和D-QNSP体外DPPH自由基清除率测定可知(图10-a),QNSP和D-QNSP的质量浓度为0.312 5～10 mg/mL。研究发现,QNSP与D-QNSP均具备清除DPPH自由基的能力。在浓度变化过程中,QNSP对DPPH自由基的清除效能跟随浓度增加呈增长趋势,而D-QNSP的清除效果虽随浓度上升有所提升,但其增长幅度明显较缓。D-QNSP的DPPH自由基清除活性降低可能与脱去蛋白有关,部分蛋白通过清除自由基直接参与抗氧化,脱去蛋白破坏其多糖-蛋白结合态结构。该实验结果与林冰洁等[24]结果相似,研究显示这可能破坏多糖中的结构进而影响糖蛋白保留程度,从而影响活性。
a-DPPH自由基;b-ABTS阳离子自由基
图10 藜麦非淀粉多糖(QNSP和D-QNSP)对DPPH自由基、ABTS阳离子自由基的清除率
Fig.10 DPPH and ABTS cationic radical scavenging rates of quinoa non-starch polysaccharide (QNSP and D-QNSP)
本研究显示,QNSP与D-QNSP均具有一定的ABTS阳离子自由基清除活性(图10-b),在质量浓度0.312 5～10 mg/mL 区间,实验数据表明,QNSP与D-QNSP对ABTS阳离子自由基的清除效能呈现浓度依赖性增强趋势。随着样品浓度逐步提升,二者的抗氧化活性均显著增强,且与维生素C阳性对照的抗氧化能力接近。D-QNSP的ABTS阳离子清除活性低于QNSP,可能由于脱蛋白后,非淀粉多糖内部的糖苷键断裂过多,失去部分能与ABTS阳离子自由基结合的基团,这和谭翠[25]的研究结果相似,在不同发酵时长的大麦β-葡聚糖在ABTS阳离子自由基清除活性上存在显著差异,这一现象或归因于发酵过程中β-D-G链过度断裂,致使部分可与ABTS阳离子自由基结合的活性基团缺失导致。
3 结论
本研究以藜麦为原料,揭示了QNSP与其天然共存的蛋白质组分之间存在显著的协同增效作用,打破传统多糖研究中将蛋白质视为“杂质”去除的常规范式。对QNSP与D-QNSP近行对比研究结果表明D-QNSP中蛋白质含量显著降低,而相对的总糖含量有所增加,脱蛋白未改变藜麦非淀粉多糖内部的官能团,但改变了其单糖组成的含量并提高了分子质量。结果表明多糖-蛋白通过N—H作用力连接呈现出较高的生物活性。脱蛋白处理使藜麦非淀粉多糖的表面变得更加空洞,小空洞较多,减少粗糙度,破坏了多糖-蛋白结合态,多糖进行舒展排列。通过结构特性来分析QNSP在脱去蛋白质后其结构破坏导致链伸展分子质量增加、表观颗粒较大、结晶度下降,有序结构被破坏。QNSP与D-QNSP均具有一定的持油力、膨胀力、起泡性、乳化性以及抗氧化活性。通过脱蛋白后分子质量增大、粒径增大、电位减小推测QNSP中蛋白质有足够的正电荷与非淀粉多糖负电荷中和,多糖与蛋白质通过静电作用、氢键、疏水相互作用等形成复合物,这些相互作用直接影响复合物的构象和理化、功能特性。比较研究分析结合态下的未进行脱蛋白处理的QNSP拥有较好的理化性质与抗氧化性。后期会进一步深入解析两者相互作用及机理。这些发现有助于深入了解藜麦非淀粉多糖的理化性质及其结构特性,在健康功效上,复合结构可能提供了更多的活性位点,为今后将藜麦非淀粉多糖作为食品膳食补充剂提供了数据支持。
[1] TANG Y, LI X H, ZHANG B, et al.Characterisation of phenolics, betanins and antioxidant activities in seeds of three Chenopodium quinoa Willd.genotypes[J].Food Chemistry, 2015, 166:380-388.
[2] VASQUEZ-OREJARENA E, SIMONS C T, LITCHFIELD J H, et al.Functional properties of a high protein beverage stabilized with oat-β-glucan[J].Journal of Food Science, 2018, 83(5):1360-1365.
[3] LI X F, DE VRIES R.Interfacial stabilization using complexes of plant proteins and polysaccharides[J].Current Opinion in Food Science, 2018, 21:51-56.
[4] CÖR ANDREJ
D, KNEZ Ž, KNEZ MAREVCI M.Antioxidant, antibacterial, antitumor, antifungal, antiviral, anti-inflammatory, and nevro-protective activity of Ganoderma lucidum:An overview[J].Frontiers in Pharmacology, 2022, 13:934982.
[5] 石雪, 唐明华.紫皮石斛和铁皮石斛中多糖提取工艺及抗氧化活性研究[J].云南民族大学学报(自然科学版), 2025, 34(1):20-26.SHI X, TANG M H.Study on the extraction technology and antioxidant activity of polysaccharide from Dendrobium devonianum and Dendrobium officinale[J].Journal of Yunnan University of Nationalities (Natural Sciences Edition), 2025, 34(1):20-26.
[6] 何思辰, 陈凌利, 陈慧, 等.不同脱蛋白方法对青钱柳多糖的结构和抗氧化活性的影响[J].食品工业科技, 2023, 44(16):81-89.HE S C, CHEN L L, CHEN H, et al.Effect of different protein removal methods on the structure and antioxidant activity of the Cyclocarya paliurus polysaccharides[J].Science and Technology of Food Industry, 2023, 44(16):81-89.
[7] 杨玉洁, 刘静宜, 谭艳, 等.多糖降血糖活性构效关系及作用机制研究进展[J].食品科学, 2021, 42(23):355-363.YANG Y J, LIU J Y, TAN Y, et al.Progress in understanding the structure-activity relationship and hypoglycemic mechanism of polysaccharides[J].Food Science, 2021, 42(23):355-363.
[8] 李楠, 闫智超, 孙元琳, 等.裸燕麦β-葡聚糖的提取工艺及其理化性质研究[J].食品研究与开发, 2021, 42(8):81-86.LI N, YAN Z C, SUN Y L, et al.Study on extraction technology and physicochemical properties of naked oat β-glucan[J].Food Research and Development, 2021, 42(8):81-86.
[9] DUBOIS M, GILLES K A, HAMILTON J K, et al.Colorimetric method for determination of sugars and related substances[J].Analytical Chemistry, 1956, 28(3):350-356
[10] LOWRY O, ROSEBROUGH N, FARR A L, et al.Protein measurement with the folin phenol reagent[J].Journal of Biological Chemistry, 1951, 193(1):265-275.
[11] FILISETTI-COZZI T M C C, CARPITA N C.Measurement of uronic acids without interference from neutral sugars[J].Analytical Biochemistry, 1991, 197(1):157-162.
[12] CAO R A, MA N, PALANISAMY S, et al.Structural elucidation and immunostimulatory activities of quinoa non-starch polysaccharide before and after deproteinization[J].Journal of Polymers and the Environment, 2022, 30(6):2291-2303.
[13] CUI Y M, HAN X D, HUANG X, et al.Effects of different sources of β-glucan on pasting, gelation, and digestive properties of pea starch[J].Food Hydrocolloids, 2023, 135:108172.
[14] LIU H B, LI Y, YOU M L, et al.Comparison of physicochemical properties of β-glucans extracted from hull-less barley bran by different methods[J].International Journal of Biological Macromolecules, 2021, 182:1192-1199.
[15] MA N, LI R, YOU S G, et al.Fermentation enrichment, structural characterization and immunostimulatory effects of β-glucan from Quinoa[J].International Journal of Biological Macromolecules, 2024, 267(Pt 1):131162.
[16] LEE J, LI C S, SURAYOT U, et al.Molecular structures, chemical properties and biological activities of polysaccharide from Smilax glabra rhizome[J].International Journal of Biological Macromolecules, 2018, 120:1726-1733.
[17] YANG B, ZHAO M M, SHI J, et al.Effect of ultrasonic treatment on the recovery and DPPH radical scavenging activity of polysaccharides from Longan fruit pericarp[J].Food Chemistry, 2008, 106(2):685-690.
[18] 李开凤, 李迪, 蒋忠桂, 等.不同提取方式对柠檬皮果胶结构、理化特性和功能活性的影响[J].食品工业科技, 2025, 46(20):266-276.LI K F, LI D, JIANG Z G, et al.Effects of different extraction methods on the structure, physicochemical properties, and functional activity of pectin from Citrus limon(L.)Burm.f.Peel[J].Science and Technology of Food Industry, 2025, 46(20):266-276.
[19] 张权, 陈洁, 曾茂茂, 等.制造过程对可溶性大豆多糖结构和产物起泡性的影响[J].食品与机械, 2020, 36(7):33-38.ZHANG Q, CHEN J, ZENG M M, et al.Effect of processing parameters on the structure of soybean polysaccharide and its foaming properties[J].Food &Machinery, 2020, 36(7):33-38.
[20] HAN Y M, ZHU L, ZHANG H, et al.Characteristic of the interaction mechanism between soy protein isolate and functional polysaccharide with different charge characteristics and exploration of the foaming properties[J].Food Hydrocolloids, 2024, 150:109615.
[21] VAN DE VONDEL J, JANSSEN F, WOUTERS A G B, et al.Air-water interfacial and foaming properties of native protein in aqueous quinoa (Chenopodium quinoa Willd.) extracts:Impact of pH- and heat-induced aggregation[J].Food Hydrocolloids, 2023, 144:108945.
[22] 刘乐, 李艳, 连加达, 等.藜麦醇溶蛋白的氨基酸组成、抗氧化性与乳化性研究[J].食品与发酵工业, 2022, 48(13):181-187.LIU L, LI Y, LIAN J D, et al.Amino acid composition, antioxidant activity and emulsion properties of quinoa prolamine[J].Food and Fermentation Industries, 2022, 48(13):181-187.
[23] LIU Y Q, WU Q Z, ZHANG J, et al.Food emulsions stabilized by proteins and emulsifiers:A review of the mechanistic explorations[J].International Journal of Biological Macromolecules, 2024, 261:129795.
[24] 林冰洁, 毛肇洁, 余远, 等.藜麦麸皮多糖的提取及理化性质和活性研究[J].食品科技, 2021, 46(8):171-178.LIN B J, MAO Z J, YU Y, et al.Extraction, physicochemical properties and activity of quinoa husk polysaccharide[J].Food Science and Technology, 2021, 46(8):171-178.
[25] 谭翠. 发酵大麦β-葡聚糖的抗氧化作用研究[D].镇江:江苏大学, 2021.TAN C.Study on the antioxidant effect of fermented barley β-glucan[D].Zhenjiang:Jiangsu University, 2021.