美拉德反应是还原糖与氨基酸或蛋白质在加热条件下发生的复杂化学反应,又称非酶褐变反应[1]。该反应不仅在食品风味和色泽的形成中发挥着重要作用(如在饼干烘焙中,氨基酸与还原糖的反应物使饼干呈现金黄色与独特香味)[2],还可利用美拉德反应制备各类香精,用于提高相关产品的风味(如以山楂为原料,添加甘氨酸后可生成具有甜味、果味的香精)[3]。然而,美拉德反应在形成理想风味与色泽时,也会产生一系列具有潜在健康风险的危害物[4-5]。目前发现多数危害物属于杂环类结构,超过30多种杂环产物被确认具有遗传毒性、致突变性或致癌性。流行病学研究也表明,摄入含有杂环类产物的食品,可能增加人体结肠癌、前列腺癌或乳腺癌的风险[6-8]。尽管杂环结构类的危害物已引起广泛关注,但氨基酸与糖反应所产生的杂环产物种类繁多、含量低及结构复杂,已成为食品安全领域中亟待解决的关键问题。
糖类与氨基酸的种类繁多,其反应路径和产物差异显著[9]。葡萄糖是食品中最常见的还原糖之一,既是食品的重要组成成分(鲜肉葡萄糖含量最高可达7.2 mg/g),又是应用广泛的食品添加剂(如普通肉制品加工时会添加0.3%～0.5%葡萄糖,火腿、香肠加工时会添加0.5%～2%的葡萄糖),它在食品加工中起着关键作用[10-11]。在众多氨基酸中,丝氨酸和甲硫氨酸因侧链结构特殊,在热反应中表现出独特的反应特性。丝氨酸侧链含有羟基,在加热反应中易发生脱水反应,可促进杂环产物生成[12]。甲硫氨酸作为含硫氨基酸,是噻吩、噻唑等含硫杂环产物的重要前体[13],且其美拉德反应活性较高[14]。丝氨酸和甲硫氨酸通过美拉德反应生成的吡咯、吡嗪、呋喃等杂环物质,能够赋予食品烤香、坚果香、肉香等风味,可作为天然食品的增香剂[15],同时也可作为制备风味香精的关键原料[16]。此外,丝氨酸在美拉德反应中生成的杂环抗氧化产物,能高效抑制脂质氧化,可作为抗氧化剂来延长食品的货架期[17]。由此可见,目前关于丝氨酸与甲硫氨酸参与美拉德反应的研究主要聚焦于杂环产物对风味形成的影响。尽管对丝氨酸/甲硫氨酸-葡萄糖有关的反应体系开展了部分美拉德产物或少数特定杂环产物的研究,但尚未对反应体系中杂环产物的种类与结构进行系统性及宏观性解析。此外,针对该类杂环产物的毒理学评价仍较缺乏。鉴于食品加工中可能形成的杂环产物数量庞大,传统毒性评估方法要求高、效率低,因而有必要借助计算毒理学方法对其进行高效预测。
Discovery Studio软件中的TOPKAT模块可通过对化合物的结构参数实现毒性预测。目前该模块已广泛应用于药物研发、环境风险评估及食品安全等领域[18-19]。相较于周期长、成本高的体内动物实验,该模块具备快速、经济等优势,且预测准确率可达85%以上[20]。适用于大规模化合物的毒理学初步筛选。
因此,本文以丝氨酸/甲硫氨酸-葡萄糖反应体系为研究对象,借助静电场轨道阱超高分辨质谱仪(Q-Exactive Orbitrap HRMS)及Van Krevelen图等可视化分析方法,系统研究丝氨酸/甲硫氨酸-葡萄糖体系中杂环产物的生成规律及组成,运用计算毒理学方法对产物进行初步的毒性评估,以期为阐明热加工食品中杂环类危害物的形成机制及其安全性评价提供数据支持与方法参考。
1 材料与方法
1.1 实验材料
丝氨酸、甲硫氨酸,北京建强伟业科技有限公司;葡萄糖,国药集团化学试剂有限公司;氨基酸混合标准液,日本富士胶片和光纯药株式会社;氨基酸衍生试剂盒,月旭科技(上海)股份有限公司;甲醇(质谱级)、乙腈(质谱级),赛默飞世尔科技有限公司;纯净水,杭州娃哈哈集团有限公司;正己烷(色谱纯),西陇科学股份有限公司。
1.2 仪器与设备
KH-50反应釜,苏州晟华仪器科技有限公司;ME4002E/02电子天平,梅特勒-托利多(上海)有限公司;PHS-3E型pH计,上海仪电科学仪器股份有限公司;Mixer涡旋振荡器、Q Exactive静电场轨道阱超高分辨质谱仪,赛默飞世尔科技有限公司;FL970荧光分光光度计,天美仪拓实验室设备(上海)有限公司;DHG-9070A电热鼓风干燥箱,中仪国科(北京)科技有限公司;LC-20AT高效液相色谱仪,岛津制作所;Chemdraw 20.0软件,美国Cambridge Soft公司;Discovery Studio软件,美国BIOVIA公司。
1.3 实验方法
1.3.1 氨基酸与葡萄糖反应体系的建立
定量反应体系:将丝氨酸/甲硫氨酸(0.1、0.1、0.1、0.2、0 mmol)分别与葡萄糖(0、0.1、0.2、0.1、0.1 mmol)按物质的量比为1∶0、1∶1、1∶2、2∶1、0∶1溶于10 mL纯净水中,将所得混合溶液转移至反应釜内,于180 ℃条件下加热0.5 h。反应结束后,冰水浴快速冷却,样品备用。
定性反应体系:分别将丝氨酸/甲硫氨酸(0.2 mmol)与葡萄糖(0.1 mmol)按物质的量比2∶1溶于10 mL纯净水中。将所得混合溶液转移至反应釜内,180 ℃加热0.5 h。反应结束后,冰水浴快速冷却,样品备用。
1.3.2 氨基酸含量的检测
采用氨基酸衍生试剂盒对样品进行衍生处理,按照操作要求对衍生试剂进行稀释,然后加入到160 μL的样品中进行衍生反应,最后加入正己烷停止反应,取下层液体备用。
将衍生的样品稀释10倍,经混合纤维素滤膜过滤(0.22 μm),取10 μL滤液进行高效液相色谱仪分析。色谱柱使用月旭Amino Acid色谱柱(250 mm×4.6 mm, 5 μm),柱温40 ℃,流速1.0 mL/min。流动相A为0.1 mol/L醋酸钠溶液(pH 6.50)∶乙腈=93∶7(体积比),流动相B为水∶乙腈=20∶80(体积比)。采用紫外检测器,检测波长254 nm。洗脱程序见表1。
表1 流动相梯度洗脱程序
Table 1 Mobile phase gradient elution program
时间/minA/%B/%0.01100.00.01193.07.013.988.012.01485.015.02966.034.03230.070.0350.0100.0420.0100.045100.00.060100.00.0
1.3.3 葡萄糖含量的测定
参照文献[21]的方法并稍作修改,将制备好的样品经过混合纤维素滤膜(0.22 μm)过滤后,采用高效液相色谱仪进行检测。色谱柱为月旭Ultimate XB-NH2氨基柱(250 mm×4.6 mm,5 μm),柱温40 ℃,流速1.0 mL/min,流动相为乙腈∶水=70∶30(体积比),采用等度洗脱,检测器为示差折光检测器,进样量10 μL。
1.3.4 荧光强度的测定
参照文献[22]的方法,采用荧光光谱法测定丝氨酸/甲硫氨酸-葡萄糖反应体系荧光强度。激发波长347 nm,发射范围为400～600 nm。光电倍增管电压650 V,扫描速度240 nm/min,狭缝宽度5 nm。相同条件下以葡萄糖溶液、丝氨酸溶液、甲硫氨酸溶液作对照,比较荧光强度,评估荧光产物的生成情况。
1.3.5 反应体系中杂环产物的测定
取制备好的丝氨酸/甲硫氨酸-葡萄糖反应溶液,用甲醇稀释20倍,经过有机系滤膜(0.22 μm)过滤,取1 μL滤液注入Q-Exactive Orbitrap HRMS进行分析。
1.3.5.1 质谱条件
采用全扫描/数据依赖二级质谱扫描模式,主要质谱参数设置如下:离子源为电喷雾离子源,离子化模式为正离子,离子源温度300 ℃,喷雾电压3.2 kV,离子传输管温度350 ℃,辅助气加热温度300 ℃,鞘气流速30 L/min,辅助气流速10 L/min。一级全扫描质荷比范围50～750(m/z),分辨率60 000半峰全宽(full width at half maximum,FWHM),自动增益控制目标值1×106,最大注入时间100 ms。数据依赖二级质谱扫描分辨率15 000 FWHM,自动增益控制目标值1×105,最大注入时间50 ms,每个扫描周期内最多选择5个丰度最高的母离子进行碎裂,母离子隔离窗口3.0(m/z),采用阶梯归一化碰撞能量进行碎裂,能量值30 eV,数据采集使用Xcalibur 4.0软件。
1.3.5.2 数据处理
将高分辨质谱原始数据导入Compound Discoverer 3.3软件,依据仪器采集的精确分子质量(误差<5 ppm)拟合元素组成,并与ChemSpider及mzCloud在线数据库进行比对,mzCloud数据库涵盖化合物的多级碎片质谱信息,可以对化合物进行鉴别并通过碎片信息进一步确认其结构。
1.3.6 杂环产物的毒性预测
采用ChemDraw 20.0软件绘制杂环产物的化学结构式,并保存为SDF格式文件。将SDF文件导入Discovery Studio软件,选定目标化合物后运用TOPKAT毒理学预测模块,对目标化合物进行致突变性、潜在发育毒性、大鼠口服半数致死量(lethal dose 50%,LD50)、大鼠吸入半数致死浓度(lethal concentration 50%,LC50)、大鼠长期口服最低可见有害作用水平(least observed adverse effect level,LOAEL)以及大鼠皮肤致敏性等6项关键毒理学数据进行预测。
1.3.7 数据统计分析
每项实验重复3次,结果以“平均值±标准差”表示。采用SPSS 20.0软件进行方差分析(ANOVA)和邓肯(Duncan test)统计分析。分析样本间的差异,P<0.05表示样本间有显著性差异。绘图软件为Origin 2021。
2 结果与分析
2.1 氨基酸-葡萄糖体系中反应物的变化规律
为了证明氨基酸、葡萄糖在反应中的变化规律,测定了不同物质的量比氨基酸与葡萄糖的反应后剩余量。由图1可知,当氨基酸与葡萄糖物质的量比为1∶1和1∶2时,丝氨酸分别降至总量的18%和11%,甲硫氨酸分别降至总量的14%和7%。可见,葡萄糖可显著促进丝氨酸和甲硫氨酸的消耗,且随着葡萄糖量的升高而减少。当氨基酸与葡萄糖物质的量比为1∶1和2∶1时,丝氨酸分别使葡萄糖降至26%和23%,甲硫氨酸分别使葡萄糖降至43%和17%。上述结果表明,随着丝氨酸和甲硫氨酸浓度的升高,葡萄糖的剩余量显著降低。以上结果证实,氨基酸与葡萄糖之间存在显著的相互作用,且随着氨基酸与葡萄糖物质的量比的升高,两者之间的反应加快,加剧了两者的消耗。本结果与以往研究中糖与氨基酸反应的研究结论一致,证明了葡萄糖与氨基酸之间的相互作用是两者被消耗的主要原因[23]。此外,对比丝氨酸与甲硫氨酸对葡萄糖的消耗发现,丝氨酸对葡萄糖的消耗程度高于甲硫氨酸,这一现象可能与2种氨基酸的结构有关。
图1 氨基酸与葡萄糖含量的变化
Fig.1 Changes in the contents of amino acids and glucose
注:不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。
2.2 反应产物荧光强度的分析
为探究丝氨酸/甲硫氨酸-葡萄糖反应产物的荧光特性差异,对各反应物的生成特征进行了分析。如图2所示,葡萄糖、甲硫氨酸均未产生明显的荧光信号,主要原因是2种物质无荧光共轭体系结构。而丝氨酸中出现微弱荧光且发射峰发生偏移,可能是其在加热时发生了分子间环化,缩合生成了二酮哌嗪类化合物[24]。相比之下,丝氨酸/甲硫氨酸-葡萄糖反应体系均在发射波长约450 nm处出现显著的荧光信号,其中丝氨酸-葡萄糖的荧光强度是甲硫氨酸-葡萄糖的2倍。由此可见,丝氨酸/甲硫氨酸-葡萄糖发生美拉德反应生成了荧光杂环产物,主要由氨基酸的氨基与葡萄糖降解的羰基化合物间的反应引起。先前研究也指出,美拉德反应伴随Strecker降解可生成具有荧光的吡嗪类杂环产物[25]。该研究中丝氨酸-葡萄糖反应产生的较强荧光,正是氨基与羰基发生反应生成大量杂环产物的直接体现,这与之前的研究保持一致[26]。此外,可能由于丝氨酸结构中的羟基增强了氨基的亲核性,使其与葡萄糖的反应更加强烈,生成了更多的荧光产物。甲硫氨酸的硫醚键虽然具有一定的给电子性,但其侧链较大的空间位阻在一定程度上阻碍了反应进行,导致对氨基的亲核性远小于丝氨酸中羟基对氨基的亲核性,降低了荧光产物的形成。由此可见,荧光强度的显著增强是甲硫氨酸/丝氨酸-葡萄糖发生美拉德反应生成产物的重要标志。
图2 丝氨酸/甲硫氨酸-葡萄糖反应产物的荧光光谱
Fig.2 Fluorescence spectra of serine/methionine-glucose reaction products
2.3 杂环产物的数量分布及元素组成特征分析
采用Q-Exactive Orbitrap HRMS对丝氨酸/甲硫氨酸-葡萄糖反应中形成杂环产物进行分析,数据显示,丝氨酸-葡萄糖反应体系中共生成198种杂环产物,按元素组成可分为单氮原子CHON(27种)和多氮原子CHON1+x(171种)两类(图3-a),其中主要生成CHON1+x类杂环产物的主要原因是,丝氨酸分子所含的羟基结构,可极大促进分子内的多次脱水缩合及环化反应。甲硫氨酸-葡萄糖反应体系中共生成159种杂环产物,可分为单氮原子CHON(12种)、含硫原子CHONS(5种)、多氮原子CHON1+x(114种)及含硫原子CHON1+xS(28种)四类(图3-b),与丝氨酸-葡萄糖反应体系相比,其分类更为复杂。甲硫氨酸分子中硫原子的引入,使得产物中出现了CHONS和CHON1+xS两类含硫杂环,这也证实了甲硫氨酸参与了含硫杂环的构建[27-28]。此外,甲硫氨酸-葡萄糖反应生成CHON1+x类杂环产物数量少于丝氨酸-葡萄糖体系,这可能是因为硫原子空间位阻效应,在一定程度上抑制杂环产物的生成,进而导致其数量减少。上述结果表明,2个体系所生成的杂环产物的数量及元素组成分类有显著差异,氨基酸结构差异影响了杂环产物的反应路径,影响了反应产物的分布特征。
a-丝氨酸与葡萄糖;b-甲硫氨酸与葡萄糖
图3 丝氨酸/甲硫氨酸-葡萄糖反应体系中杂环产物的数量及元素组成
Fig.3 Quantity and elemental composition of heterocyclic products in the serine/methionine-glucose reaction system
2.4 杂环产物的可视化分析
2.4.1 丝氨酸与葡萄糖反应体系的Van Krevelen图
丝氨酸-葡萄糖反应中杂环产物的整体分布如图4-a所示,可以观察到所生成的杂环产物主要分布在O/C比值为0.0～0.4,H/C比值为0.8～1.6的范围内,且分布比较集中。这种分布趋势说明,杂环产物的核心骨架相似,同源性较高。此外,反应产物逐渐向原点方向偏移,表明反应主要以脱水、脱氢反应为主,向不饱和的杂环结构转化。按照N原子的个数对杂环产物进行分类(图4-b),结果显示杂环产物主要以2个N原子(橙色点)和3个及以上N原子(蓝色点)的杂环产物为主。以上数据可进一步说明,丝氨酸产生了丰富的含氮化合物,与葡萄糖降解产生的中间体(如活性α-二羰基化合物)发生连续缩合环化形成杂环产物。进一步按结构对杂环产物进行分类(图4-c),五元氮杂环(橙色点)和六元氮杂环(红色点)占主导,主要以吡咯(2,5-二甲基-吡咯-3-羧酸甲酯)、吡嗪(2,5-二甲基吡嗪、2,5-二乙基-3,6-二甲基吡嗪等)、吡啶类(2,6-二乙酰基吡啶、2-羟基吡啶等)为代表。相比之下,喹啉(8-氨基-喹啉-6-醇)、吲哚(1H-吲哚-3-基(吡啶-2-基)甲醇、N-[2-(6-羟基-5-甲氧基-1H-吲哚-3-基)乙基]乙酰胺等)苯并稠合氮杂环(蓝色点)及恶唑等特殊杂环(绿色点)较少。这一分布特征表明,丝氨酸-葡萄糖反应主要生成简单杂环产物,复杂杂环产物生成数量较少。复杂杂环产物产生较少的原因在于,需经多次脱氢、环化缩合来形成稳定的共轭π键体系。结合上述分析,丝氨酸提供含N结构物质,其羟基可促进脱水缩合,含氮化合物与葡萄糖形成的中间体经亲核加成形成环状骨架,再通过脱氢芳构化生成稳定的多氮杂环,并逐步由简单单环向复杂的苯并稠合氮杂环结构转化。
a-整体分布;b-含N原子个数分类;c-结构分类
图4 丝氨酸-葡萄糖反应体系中杂环产物的Van Krevelen图
Fig.4 Van Krevelen diagram of heterocyclic products in the serine-glucose reaction system
a-整体分布;b-含N原子个数分类;c-含S原子分类;d-结构分类
图5 甲硫氨酸-葡萄糖反应体系中杂环产物的Van Krevelen图
Fig.5 Van Krevelen diagram of heterocyclic products in the methionine-glucose reaction system
2.4.2 甲硫氨酸与葡萄糖反应的Van Krevelen图
甲硫氨酸-葡萄糖反应体系生成的杂环产物分布如图5-a所示,尽管与丝氨酸-葡萄糖反应体系具有相似性,但数据点分布更为分散,这表明产物结构较丝氨酸-葡萄糖差异大。按N原子个数分析发现,它也以2个N原子(橙色点)与和3个及以上N原子(蓝色点)的杂环产物为主(图5-b),与丝氨酸-葡萄糖反应体系相同。然而,如图5-c所示,含S原子的杂环产物明显少于不含S原子的杂环产物,这能够说明甲硫氨酸分子中硫醚键的引入不是该体系生成杂环产物的主要路径,说明杂环产物的差异主要体现在生成了含S原子的杂环产物。进一步的结构分类分析显示(图5-d),五元和六元氮杂环依然占主导,体系中也发现了噻唑(2-氨基-6-硝基苯并噻唑)、噻吩(3,4-二甲基噻吩)等特殊的含硫杂环结构和少量的苯并稠合氮杂环。这些结果证明,甲硫氨酸分子中硫醚键使得杂环产物具有多样性,更重要的是衍生了区别于丝氨酸体系的反应路径。
通过Van Krevelen图可以直观观察到2个体系在杂环产物的分布差异。2个体系均以氨基酸与葡萄糖降解的活性中间体发生亲核加成、脱水缩合、脱氢环化的核心路径生成杂环产物;而杂环产物的差异是由于氨基酸的结构不同:丝氨酸的羟基促进氨基与葡萄糖降解中间体的亲核反应,从而加速杂环产物的生成,使得产物分布更集中;甲硫氨酸-葡萄糖反应体系分布较分散,硫醚键的引入衍生了新的反应路径,从而生成了含S杂环产物,极大地丰富了产物的结构多样性(图6)。
图6 氨基酸-葡萄糖反应中杂环产物的生成机制
Fig.6 Formation mechanism of heterocyclic products in the amino acid-glucose reaction
两者之间的差异可通过2个不同杂环产物的反应途径进一步说明(图7)。如丝氨酸的氨基与二羰基化合物(2,3-戊二酮)的羰基亲核加成,脱水生成亚胺中间体;该中间体脱羧、双键重排为α,β-不饱和亚胺,水解后得到α,β-不饱和酮与游离氨基片段;两分子的α,β-不饱和酮缩合环化形成二聚体,经氧化脱氢生成吡嗪类杂环产物[9]。甲硫氨酸的氨基与二羰基化合物(甲基乙二醛)的羰基通过亲核加成形成含硫中间体,该中间体脱羧后经脱氢环化得到含硫杂环产物[29]。
图7 杂环产物形成的途径
Fig.7 Pathways for the formation of heterocyclic products
由以上分析可知,氨基酸的结构决定了反应途径的不同,直接影响了杂环产物的生成。这一发现为理解不同氨基酸结构下杂环产物的生成提供了理论参考。
2.5 杂环产物的毒性预测分析
采用Discovery Studio(TOPKAT)软件对丝氨酸/甲硫氨酸-葡萄糖反应生成的所有杂环产物进行了毒理学评价。其中致突变性、潜在发育毒性及皮肤致敏性的预测结果以概率数值表示,当预测值>0.7时,说明该化合物有较高毒性,在实际检测中很可能得到阳性结果;大鼠口服LD50>15 g/kg表示无毒性,5 g/kg
分析结果如表2所示,在丝氨酸-葡萄糖反应体系生成的198种杂环产物中,发现10种综合毒性较强的化合物,其中9种杂环产物致突变性和潜在发育毒性均接近1,另外1种产物致突变性较高,但潜在发育毒性较低。表明它们有较强的致突变性和发育毒性,可能对生物体遗传物质造成损伤,进而引发基因突变、染色体畸变。此外,在大鼠口服LD50评价指标中,有6种产物在0.05 g/kg
表2 丝氨酸-葡萄糖反应体系中杂环产物的相关毒性
Table 2 Toxicity of heterocyclic products in the serine-glucose reaction system
序号结构式名称致突变性潜在发育毒性皮肤致敏性大鼠口服LD50/(g/kg)大鼠吸入LC50/[g/(m3·H)]大鼠LOAEL/(mg·kg)1N-(双环丙基甲基)-4,5-二氢-2-恶唑胺1.0001.0000.9102.5 0.200689.122-甲酰胺基哌嗪1.0001.0000.0000.6950.50435.93N-亚硝基脯氨酸1.0001.0000.9930.49810.050.441-羟基-3-异丙基-6,7,8,8a-四氢吡咯并[1,2-a]吡嗪-4(3H)-酮1.0001.0001.0001.40.389147.45L-哌啶-2-羧酸1.0000.9971.0000.83910.0230.362-(1-甲基-5-硝基-1H-咪唑-2-基)丙-2-醇1.0000.0010.0004.30.80513.672-亚氨基-1-咪唑烷乙酸1.0001.0000.03010.010.04.584-((3,4-二氢-2H-吡咯-5-基)氨基)丁酸1.0001.0000.01410.010.049.8
续表2
序号结构式名称致突变性潜在发育毒性皮肤致敏性大鼠口服LD50/(g/kg)大鼠吸入LC50/[g/(m3·H)]大鼠LOAEL/(mg·kg)93-氨基-8-甲基-1,3-二氮司苯 [4.5]十烷-2,4-二酮1.0001.0000.0000.1070.101331.7103-甲氧基-N,4-二甲基-2-氧代咪唑烷-1-甲酰胺0.8991.0000.0000.5480.15330.2
由表3可知,甲硫氨酸-葡萄糖反应体系生成的159种杂环产物中,发现有6种综合毒性较强的化合物。这6种产物的毒性程度与丝氨酸-葡萄糖反应体系杂环产物的毒性程度相似,其中5种产物表现出了较高的致突变性和潜在发育毒性,3种产物表现出了较高的皮肤致敏性。在大鼠吸入LC50和大鼠口服LD50指标中,这6种杂环产物均显示具有轻微及以上毒性。这些产物之所以有较高的毒性,主要归因于它们的共轭多氮杂环骨架和刚性平面结构。该结构容易嵌入DNA双螺旋造成物理损伤,而环上的氮原子使分子具有亲电活性,在代谢过程中能与DNA或蛋白质等生物大分子发生共价结合,从而引发致突变、致癌及氧化应激等多种毒性效应。该结果也与现在含氮杂环化合物结构-毒性关系的研究结论一致[30]。这些结果可为产物的毒理学特性评价提供参考依据,然而,若要对其毒理性质做出准确、全面的判定,仍需开展系统且深入的毒理学实验评估。
表3 甲硫氨酸-葡萄糖反应体系中杂环产物的相关毒性
Table 3 Toxicity of heterocyclic products in the methionine-glucose reaction system
序号结构式名称致突变性潜在发育毒性皮肤致敏性大鼠口服LD50/(g/kg)大鼠吸入LC50/[g/(m3·H)]大鼠LOAEL/(mg/kg)1N-甲基-N-(4-氧代-4-(吡啶-3-基)丁基)亚硝酰胺1.0000.0050.9980.26510.088.221,3-噻嗪烷-4-羧酸1.0000.9910.3462.110.0263.431-苯基-3-吡唑烷酮0.0001.0000.9810.1563.744.944-氨基硫代氧甲基-1-哌嗪羧酸乙酯1.0001.0000.0001.23.81.1
续表3
序号结构式名称致突变性潜在发育毒性皮肤致敏性大鼠口服LD50/(g/kg)大鼠吸入LC50/[g/(m3·H)]大鼠LOAEL/(mg/kg)5 3-烯丙基-5-异丁基-2-硫代咪唑啉-4-酮1.0000.9971.0000.102.751.961,1′-(1,4-丁烷二基)二(2-氨基-1,5-二氢-4H-咪唑-4-酮)0.9661.0000.0003.40.1330.177
3 结论
本研究通过构建丝氨酸/甲硫氨酸-葡萄糖反应体系,揭示了氨基酸结构差异对杂环产物生成的主要影响。研究发现,丝氨酸/甲硫氨酸-葡萄糖反应体系分别生成了198、159种杂环产物。丝氨酸-葡萄糖产物分为CHON、CHON1+x两类;甲硫氨酸-葡萄糖产物分为CHON、CHON1+x、CHONS、CHON1+xS四类。2个体系都以CHON1+x为主要产物,但氨基酸产生的含氮片段与葡萄糖降解中间体发生亲核反应,经脱氢环化生成结构稳定的吡咯、咪唑、吡嗪、吡啶类等杂环产物。丝氨酸的羟基能够促进亲核反应,生成更多的杂环产物;甲硫氨酸的硫醚键促进了含S杂环产物(如噻唑、噻吩)的生成,但也在一定程度上由于空间位阻抑制了杂环产物的生成。此外,利用Discovery Studio软件对生成的杂环产物进行初步毒性评估,结果显示其中16种具有较高的致突变性、潜在发育毒性、皮肤致敏性;大鼠口服LC50及大鼠吸入LC50均在轻度及以上毒性。通过研究丝氨酸/甲硫氨酸-葡萄糖体系中杂环产物的生成规律及组成,并结合计算毒理学方法进行初步的毒性评估,为热加工食品中杂环类危害物的形成机制及安全性评价提供科学依据。然而,本研究也存在一定局限性,尚未在真实食品中预测得到的化合物进行实际检测与毒性验证。后续可针对真实食品中这些杂环产物进行分析,并通过毒理学实验验证,为热加工食品的安全性评估提供更具实际指导意义的科学支撑。
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