山羊乳乳清蛋白热聚集对其乳铁蛋白活性影响

山羊乳为全球三大乳源之一,其产业规模持续扩大。2020年中国山羊乳产量已达219 881 t,年均增长率达3.25%,其中陕西地区贡献了全国80%的奶源[1],预计至2030年总产量将增长26%[2]。与牛乳相比,山羊乳具有脂肪球较小、酪蛋白比例较低、乳清蛋白含量较高等特点[3],富含α-乳白蛋白(α-lactalbumin, α-La)、β-乳球蛋白(β-lactoglobulin, β-Lg)、免疫球蛋白及乳铁蛋白(lactoferrin, LF)等功能成分。羊LF作为乳清中的核心功能性蛋白,其分子由两个通过α-螺旋桥连接的球状叶构成,每个叶通过分子内二硫键稳定结构,并可逆结合Fe3+。其中N叶主导抗菌活性,C叶则具有更高的铁亲和力,并介导细胞受体识别、免疫调节及铁吸收等关键功能,两结构域协同作用构成了LF多样化的生物学活性基础[4]。乳制品加工中的热处理(如巴氏杀菌、超高温灭菌)在保障微生物安全的同时,也不可避免地引发乳清蛋白质变性聚集。LF在过热条件下会发生不可逆变性,导致其铁结合能力与抗菌活性显著降低,进而损害产品的功能特性、营养品质与感官属性[5-6]。而LF作为高附加值功能糖蛋白,其热稳定性直接决定最终产品的功能保留程度。

目前,牛乳蛋白的热变性机制已有较系统研究,热处理促使乳清蛋白三维结构展开,疏水基团与活性巯基暴露,进而通过疏水相互作用与二硫键交换等机制引发交联聚集,β-Lg作为乳清主要蛋白,因含游离巯基成为热聚集的关键参与者[7]。然而乳蛋白存在明显的种属差异,羊乳LF在热处理中的结构响应及其与β-Lg、α-La等乳清蛋白之间的相互作用仍不明确,相较于牛乳,羊乳在乳清蛋白构象与胶束结构上具有更高的热敏性,由于羊乳中β-Lg与α-La比例更高[8],其游离巯基更易暴露,导致在加热过程中更倾向于发生硫醇/二硫键交换反应,使体系更易发生聚集。

值得注意的是,热处理不仅可能破坏LF维持构象的分子内二硫键,还会促使其参与分子间二硫交联,尤其是与含游离巯基的β-Lg通过巯基-二硫键交换反应形成异质聚集体。该过程将直接遮蔽LF的活性中心,破坏其铁结合区域与抗菌功能域的空间构象,导致其功能活性急剧下降[9]。目前,针对山羊乳体系中热诱导蛋白相互作用的机制研究仍然匮乏,尤其缺乏对LF与β-Lg共聚集行为及其对乳品质影响的系统解析,亟待从乳清蛋白热稳定性及组分间相互作用规律入手,为优化杀菌工艺提供理论依据。因此,本研究采用全乳-乳清蛋白双体系研究策略,通过全乳体系评估宏观稳定性,并通过分离乳清蛋白体系解析LF、β-Lg及α-La间的分子互作机制。综合运用zeta电位、扫描电镜、差示扫描量热法(differential scanning calorimetry, DSC)、圆二色谱、荧光光谱、竞争性ELISA及SDS-PAGE等技术,系统揭示蛋白热聚集行为,旨在为优化加工工艺、保留蛋白功能活性提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 原料与试剂

陕西富平采集山羊羊乳;浓盐酸、冰乙酸、(NH4)2S2O2、(NH4)2SO4、磷酸盐缓冲液干粉,北京化工厂有限责任公司;标准品牛α-La、LF,西安优博生物科技有限公司;标准品牛β-Lg、羊LF标品,美国Sigma公司;丙烯酰胺(acrylamide,AM)、甘氨酸(Gly),美国Amresco公司;N′ N-亚甲基双丙烯酰胺(C7H10N2O2)、考马斯亮蓝R-250,美国Sigma公司;十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate, SDS),普洛麦格生物技术有限公司;N,N,N′,N′-四甲基乙二胺(N,N,N′,N′-tetramethylethylenediamine, TEMED),美国Amersham公司;蛋白预染Marker,SMOBIO公司;乳铁蛋白多克隆抗体,上海友科生物科技有限公司;HRP-羊抗兔IgG,北京博奥森生物有限公司。

1.2 仪器与设备

XMTD-7000水浴锅,北京市永光明医疗仪器有限公司;BG-Power 3500电泳仪,北京百晶生物技术有限公司;GIS400凝胶成像分析系统,南京驰顺科技有限公司;Smart系列纯水仪,利康生物医药科技控股有限公司;30、50 kDa超滤离心管,美国Millipore公司;AKTA Purifier蛋白液相纯化色谱、CM-Sepharose Fast Flow色谱柱,美国GE公司;CTFD-10S冷冻干燥机,青岛永和创新电子科技有限公司;ZS90纳米粒度及Zeta电位仪,英国MALVERN公司;DSC7000X差示扫描量热仪,日本日立公司;FEI Q45环境扫描电子显微镜,美国FEI公司;Chirascan 圆二色光谱仪,英国应用光物理公司;FS5荧光光谱仪,英国爱丁堡公司。

1.3 实验方法

1.3.1 山羊乳乳清蛋白分离

将新鲜羊乳于4 ℃、2 713 ×g离心20 min进行脱脂,该过程重复2次后经纱布过滤去除脂肪层获得脱脂羊乳。用0.1 mol/L HCl溶液将脱脂羊乳pH值调节至4.1,室温静置1 h使酪蛋白沉淀,再次以2 713×g离心30 min,收集上清液即得羊乳清蛋白溶液。

利用超滤离心法分离α-La[10],选择50 kDa的超滤离心管,量取20 mL乳清,离心30 min后保留透过液,然后再利用30 kDa的超滤管二次离心30 min,利用不同孔径超滤离心管结合的方式获得的透过液,得到纯度为93.43%的羊α-La。

利用化学沉淀法分离β-Lg[11], 将羊乳清蛋白溶液用0.6 mol/L柠檬酸溶液调节pH值至3.1,45 ℃水浴1 h诱导残留酪蛋白聚沉,经离心(109×g,40 min)后取上清液,添加质量浓度为0.1 g/mL的NaCl溶液,4 ℃静置过夜,二次同条件离心后收集上清,即得纯度为96.70%的羊β-Lg。

采用弱阳离子交换柱CM-Sepharose Fast Flow对经0.45 μm滤膜预处理的羊乳清蛋白进行分离,流动相A为pH 7.0的0.02 mol/L 磷酸盐缓冲液(PB缓冲液),流动相B为含1 mol/L NaCl的A相溶液,以1 mL/min流速进行线性梯度洗脱,得到纯度为94.98%的LF[12]。

1.3.2 样品热处理

对脱脂羊乳样品以及分离得到的羊乳清蛋白分别进行恒温水浴加热63 ℃/30 min;75 ℃/10 min;85 ℃/15～20 s、100 ℃/120 s、油浴锅加热121 ℃/4 s杀菌工艺处理,同时设置空白对照。

全乳体系用于模拟实际热加工过程,评估羊乳整体的热稳定性、蛋白聚集行为及宏观热力学性质;而通过对1.3.1节分离得到的羊乳LF、β-Lg、α-La进行单独及混合热处理,模拟乳体系的热处理强度,以研究乳清蛋白组分间的相互作用。

1.3.3 热处理对蛋白质聚集的影响

1.3.3.1 热处理羊乳zeta电位及粒径分析

使用纳米粒度仪分别对不同热处理羊乳进行了zeta电位及粒径分析。羊乳样品分别使用超纯水稀释10倍及20倍,均设定溶质与溶剂的折光系数分别为1.45和1.33,平衡时间为120 s,温度为25 ℃。

1.3.3.2 热处理羊乳微观结构分析

不同热处理羊乳与等体积的体积分数为2%的戊二醛固定液(以0.1 mol/L PB缓冲液配制,pH 7.2)混合,吸取2 μL固定1 h后的样品滴于洁净硅片上,自然晾干。采用超纯水轻柔冲洗硅片连续3次,再次干燥后对样品进行喷金处理,随后于环境扫描电镜下进行形貌观察。

1.3.3.3 热处理羊乳及羊乳清蛋白热力学性质分析

采用DSC仪分析不同热处理羊乳及羊乳清蛋白的热变性行为。精确称取10 mg样品于密闭铝制坩埚中,以空坩埚作为参比。扫描速率10 ℃/min,温度范围30～260 ℃,样品重复3次。

1.3.3.4 热处理对羊乳清蛋白二级结构影响分析

用远紫外圆二色谱分析羊乳清蛋白二级结构,pH值7.0,0.01 mol/L PB缓冲液溶解乳清蛋白至0.2 mol/L。用圆二色谱仪测不同热处理羊乳清蛋白溶液的CD值,温度(20±0.5) ℃,扫描波长190～250 nm,频率10.0 mm/min,PB缓冲液为空白对照。样品池光程1 mm,灵敏度10 mdeg/cm。

1.3.3.5 热处理羊乳清蛋白表面疏水性分析

采用外源荧光探针8-苯胺-1-萘磺酸(8-anilino-1-naphthalenesulfonic acid, ANS)测定羊乳清蛋白表面疏水性。将样品溶解于pH 2.0、0.05 mol/L的Gly-HCl缓冲液中,配制质量浓度分别为0.05、0.1、0.2、0.4、0.8 mg/mL的蛋白溶液。取2 mL样品溶液,加入20 μL 8 mmol/L的ANS溶液,避光反应3 min后,使用荧光光谱仪测定荧光强度。参数设置为激发波长390 nm,发射波长470 nm,狭缝宽度5 nm。

1.3.4 羊LF免疫活性分析

采用间接竞争ELISA评价热处理对羊LF免疫活性的影响。以CBS(2.93 g NaHCO3+1.59 g Na2CO3,定容 1 L,pH 9.6)稀释LF至优化后条件1.562 μg/mL包被96孔板(100 μL/孔,4 ℃过夜),PBS-T(500 mL 0.01 mol/L PBS+Tween-20 250 μL)洗板3～5次,以封闭液(明胶0.1 g/10 mL PBS)37 ℃ 封闭1 h。羊乳清样品及纯化LF样品稀释后,与一抗(兔抗LF,多抗,1∶80 000,PBS 稀释)预孵育后上板,洗板后加HRP-羊抗兔IgG(按1∶10 000稀释于PBS,依据信号强度可在1∶8 000～1∶15 000间微调)37 ℃孵育30 min,洗板后用TMB显色(A液:柠檬酸 2.10 g/1 L;B液:Na2HPO4·12H2O 7.163 g/100 mL;显色液:A 2.43 mL+B 2.57 mL+TMB 母液(10 mg/5 mL 无水乙醇)0.5 mL+水 5 mL+质量分数为30%的H2O2 2.1 μL 现配),以 2 mol/L H2SO4(10 mL 质量分数为98%的H2SO4加90 mL 水)终止,在 450 nm 读取 OD。采用Logit拟合标准曲线,样品浓度由曲线反算并乘以稀释倍数得到;以免疫活性保留率 (immunoreactivity retention rate, RA)表达热处理组与未处理对照的差异,其计算如公式(1)所示:

式中:RA,羊乳LF免疫活性保留率,%;Ccontrol,未热处理对照组LF的换算原浓度,μg/mL;Csample,热处理后的样品组中LF的换算原浓度,μg/mL。

1.3.5 羊乳清蛋白间相互作用分析

为从分子层面探究羊乳LF与主要乳清蛋白在热处理下的相互作用,采用还原与非还原SDS-PAGE分别分析羊乳LF与主要乳清蛋白β-Lg、α-La在不同热处理下的样本,同时以商业易得、性质明确的牛乳清蛋白标准品作为参照,以分析羊乳样品热处理及乳清蛋白互作情况及羊乳蛋白在热聚集行为上可能存在的种属特性,以比较2种不同来源乳清蛋白的热反应特征。分别配制质量浓度125 g/L分离胶(15 mL)和质量浓度50 g/L的浓缩胶(6 mL)。样品与5×上样缓冲液按体积比4∶1混合,其中还原组(+β组)添加质量分数为5%的β-巯基乙醇(β-mercaptoethanol),非还原组(-β组)不加还原剂。电泳采用两阶段电压:90 V(浓缩胶)和180 V(分离胶)。利用分离得到的羊乳α-La、β-Lg与LF冻干样本分别按照质量分数比例α-La,4%;β-Lg,12%;LF,0.08%在50 mmol/L的非还原性Tris-HCl缓冲液(pH值 6.8)中溶解混匀,标品牛α-La和β-Lg与LF分别按质量分数比例α-La,3.5%;β-Lg,10%;LF,0.08%在50 mmol/L的非还原性Tris-HCl缓冲液(pH值 6.8)中溶解混匀,热处理条件同1.3.2节。

1.4 数据分析与处理

所有实验重复3次,使用Origin 2021软件作图,并用SPSS软件进行显著性分析(P<0.05)。

2 结果与分析

2.1 热处理对蛋白质聚集的影响

2.1.1 热处理羊乳zeta电位分析

如图1所示,随热处理强度升高,羊乳zeta电位绝对值由未处理样的20.9 mV显著下降:63 ℃/30 min、75 ℃/10 min和85 ℃/15 s处理组分别降至约16.3、15.1、14.1 mV,且组间差异显著(P<0.05),并在100 ℃/120 s及121 ℃/4 s处理后进一步降至约11 mV,表明蛋白表面电荷减少、静电排斥作用减弱。与此同时,乳液平均粒径随热处理强度增大而增加,由未处理样的203.5 nm增大至280 nm。Zeta电位下降与粒径增大共同说明热诱导的蛋白质变性与聚集显著削弱了胶体静电稳定屏障,导致体系稳定性降低,更易发生聚集与沉淀。

2.1.2 扫描电镜观察羊乳

根据扫描电镜观察结果(图2),不同热处理羊乳均有规则球状结构,但聚集形态存在显著差异。未处理羊乳中呈类球形均匀分散,表面光滑、颗粒间界限清晰,体系处于天然分散状态。当加热至63 ℃/30 min 和75 ℃/10 min时,背景中小颗粒增多,仅出现轻微聚集和胶束间黏附现象。当处理温度达到85 ℃/15 s时,体系中连续状或片状结构显著增加,可能是热诱导交联加剧,形成初步凝胶化形貌。100 ℃/120 s 及121 ℃/4 s后,团聚体明显增大并呈现不规则致密块状结,表明蛋白质易于发生大尺度聚集,与zeta电位及粒度分析中稳定性下降结论一致。综合比较不同热处理条件下的微观结构变化,63 ℃/30 min 和75 ℃/10 min处理样品仅呈轻度聚集,仍保持良好分散性和结构完整性。

2.1.3 热处理脱脂羊乳及乳清DSC分析

为探究热处理对蛋白质热稳定性的影响,并区分全乳复杂体系与乳清简化体系的差异,进行了DSC分析。如图3所示,不同热处理条件下,脱脂羊乳与乳清体系在DSC曲线中呈现明显差异。全乳体系中α-La 与β-Lg的变性峰分别位于40.9 ℃和80.8 ℃,LF的特征变性区间[13](65～75 ℃)被酪蛋白胶束包埋及体系能量缓冲效应掩盖,未形成独立吸热峰,说明在全乳环境中LF并未直接暴露于热诱导解折叠过程。而在乳清简化体系中,β-Lg变性温度显著前移(80.8 ℃至70.6 ℃),α-La亦前移至35.0 ℃,表明缺乏酪蛋白相保护后乳清蛋白自身稳定性下降,使体系整体更易达到触发聚集的临界条件。随着热处理强度提升,两体系的热行为出现进一步分化。全乳中63 ℃/30 min处理提高了β-Lg表观变性温度(至94.0 ℃),推测与酪蛋白参与形成吸热性复合结构有关,表现出部分热稳定化效应;而在乳清体系中,高强度处理(121 ℃/4 s)使β-Lg变性温度进一步下降至64.2 ℃,说明其三维构象发生不可逆塌陷,进入协同聚集更易发生的构象状态。综合DSC结果可见,LF的热变性呈明显的体系依赖性,其失稳并非由自身热敏性单独触发,而是由乳清体系中β-Lg与α-La的先行失稳放大所驱动,而全乳环境则具有缓冲保护效应,使乳清体系较全乳更易诱导LF进入不可逆构象破坏过程。

2.1.4 不同温度热处理羊乳清蛋白圆二色谱分析

蛋白质二级结构由肽键顺序及能级跃迁决定,其变化可通过圆二色谱特征峰解析。图4为圆二色谱图谱,实验数据经背景校正后,采用CDNN软件拟合计算热处理羊乳清蛋白二级结构含量。

由表1可知,未处理样品中α-螺旋含量最高(9.60%),经85 ℃/15 s处理后降至最低(7.70%),而100 ℃/120 s后回升至9.50%。β-折叠含量在63 ℃/30 min处理时达到峰值,100 ℃时最低;无规卷曲在85 ℃/15 s时含量最低,100 ℃时显著上升至35.6%,反映蛋白结构松散性增强。β-转角与无规卷曲随热处理强度呈现先降后升的动态变化,63～85 ℃范围内无规卷曲下降提示蛋白构象趋于紧密。这些变化主要源于热处理引起的氢键断裂、蛋白质聚合及结构重排。绵羊乳巴氏杀菌后α-螺旋与β-折叠含量也降低[14]。进一步研究发现85 ℃/15 s处理使α-螺旋下降1.90%,且β-转角与无规卷曲变化可能与β-Lg含量较高所导致的结构重组有关。α-螺旋和β-折叠的减少通常伴随着LF构象稳定性的下降,尤其在85 ℃以上处理中,二级结构破坏加剧,可能导致其铁结合区域构象改变,引起活性降低[15]。而无规卷曲的增加进一步表明LF结构趋于松散,功能域空间排列受损,抗菌与免疫调节功能随之减弱。因此,二级结构的变化可作为LF热稳定性的重要结构依据,并为控制热处理以保留其活性提供参考。

2.1.5 不同温度热处理羊乳清蛋白表面疏水性分析

采用ANS荧光法测定羊乳清蛋白表面疏水性,结果显示,未处理蛋白与ANS结合后荧光峰由509 nm红移至541 nm,荧光强度最低为10 260.99。由图5经不同热处理后,ANS-蛋白复合物均发生蓝移,表明疏水区域极性降低。随着热处理强度增加,荧光强度逐渐上升,100 ℃/120 s处理组达最高值36 806.91,且高温处理组(100 ℃与121 ℃)峰位明显蓝移至495 nm,说明蛋白三级结构展开,疏水基团暴露,促进了ANS结合与蛋白分子间疏水相互作用[16]。与此同时,LF在经过高温热处理,如85 ℃以上,特别是100 ℃与121 ℃处理后,其空间构象发生显著改变,活性通常随温度升高和处理时间延长而下降。

2.2 羊LF免疫活性分析

通过竞争性ELISA对不同热处理条件下羊乳清体系与纯化羊LF体系的LF浓度与免疫活性保留率(表2、图6)分析可知,LF免疫活性保留率呈低温短暂上升、整体随温度升高持续下降的规律。63 ℃/30 min 时两体系RA均显著升高,归因于轻度加热诱导的有限构象松弛使埋藏表位暴露,从而提高抗体结合能力[17]。随着温度升高,乳清体系出现更早和更明显的下降,一方面源于LF自身构象稳定性受损,另一方面乳清中物质对其表位产生基质性遮蔽,导致免疫学可识别度额外降低。在85 ℃条件下,纯化LF体系RA仍接近对照值(≈100%),说明在无基质干扰时其骨架结构尚具较高耐热性;但乳清体系已明显下降,进一步证实LF所处体系也是LF热失活的主要驱动因素。当热处理升至100 ℃及121 ℃时,两体系RA均急剧下降,此时已发生不可逆构象破坏,如β-折叠解体及铁结合域拆解后聚集[18],乳清体系因复合/交联效应进一步放大失活幅度。

2.3 热处理对蛋白质聚集的影响

图7显示,未处理羊乳酪蛋白(αs-CN、β-CN、κ-CN)及乳清蛋白(β-Lg、α-La、LF)条带清晰;热处理后酪蛋白无显著变化,乳清蛋白中α-La、β-Lg条带减弱(因热致蛋白变性聚沉)。121 ℃/4 s处理组β-Lg及酪蛋白条带最浅,LF消失且泳道显著拖尾,推测高温引发乳蛋白交联形成大分子聚集体,无法进入凝胶所致。

2.3.1 LF与β-Lg间相互作用分析

热处理导致了乳中清蛋白的聚集,为排除乳体系基质干扰并明确羊LF是否与α-La/β-Lg发生共价交联,采用分离纯化的蛋白质在热处理下相互作用,通过非还原及还原SDS-PAGE分析乳清蛋白互作情况及羊乳蛋白在热聚集行为上可能存在的种属特性。

图8显示热处理下LF与β-Lg的SDS-PAGE结果,随加热强度增加,两者迁移由清晰条带逐渐转为高分子量连续拖尾区,且在非还原条件(-β)(图8-a)下表现更明显。63 ℃/30 min 与 75 ℃/10 min 仅轻度上移;85 ℃/15 s 后拖尾区加深;至100 ℃/120 s及121 ℃/4 s 时,即便在还原条件(+β)(图8-b)下仍存在弥散性迁移带,说明体系已出现不可逆型聚集。在非还原条件(图8-c)下,牛β-Lg在85 ℃以上即展现出强烈的二硫键交联聚合趋势;而在还原条件(图8-d)下,虽然二硫键被大量打断使得条带有所恢复,但100 ℃/120 s和121 ℃/4 s的高强度处理后,凝胶上仍残留明显的弥散性痕迹,说明牛乳中同样存在难解聚的不可逆共价聚集。这与既往研究结论相符,即牛β-Lg在65～90 ℃即可进入二硫键主导的聚集初级阶段,且在超高温灭菌条件下其游离巯基会快速暴露并参与交联[19-20]。本研究进一步说明,在羊乳清体系中,该二硫键供体特性不仅使β-Lg自身聚集,也可与LF形成共价复合体,从而降低LF活性。与牛β-Lg相比,羊β-Lg具有更多的游离巯基,使LF在更低热强度下即进入不可逆聚合阶段,说明LF的热失活由外源共价交联主导,而非其自身失稳。

2.3.2 LF与α-La间相互作用分析

由图9-a可知,经85 ℃/15 s处理,LF条带变浅,其他加热处理的羊乳LF条带均消失,且在点样孔处有大分子蛋白的产生,而热处理后羊α-La稳定性较好,并未发生明显变化,图9-b可见,羊α-La与LF在121 ℃/4 s热处理后,LF条带消失;其他热处理条件下条带并未发生明显变化,在LF与α-La共存体系中,热处理后出现条带上移和带型加宽,但在还原条件下可恢复为单体条带,说明两者之间不存在显著的二硫键或其他共价交联。随温度升高,高分子量迁移区逐渐增强,但仍保持可还原性,进一步表明该互作主要为非共价聚集。进一步聚焦牛乳体系(图9-c和图9-d),在非还原(-β)及还原(+β)条件下,牛α-La同样表现出极高的热稳定性,且牛LF与α-La的聚集行为也具有高度的可逆性,表明其互作方式依然以非共价结合为主,但羊乳体系中α-La的疏水区暴露能力更强、参与聚集的临界温度更低。

2.3.3 乳清蛋白间相互作用分析

如图10-a所示,在羊乳非还原条件(-β)下,100 ℃/120 s处理组中LF条带明显减弱并在上样孔处出现大分子聚集体,表明LF在该阶段已开始形成高分子共价聚集物。121 ℃处理组中LF与β-Lg条带几乎完全消失,但未形成明显凝胶状沉淀带,提示在高热下两者更倾向形成分子质量分布弥散的可溶性共价聚合物。在还原条件(+β)图10-b下,121 ℃组LF单体条带完全缺失,表明其共价交联已不可逆,单体结构完整性遭到破坏,且该条件下结构已经失活。同时,随着热处理温度≥70 ℃,β-Lg发生构象展开并暴露活性巯基,而α-La结构松弛后暴露疏水区促进LF富集,两者形成化学交联和疏水聚集的双通道协同作用,从而提高LF参与热聚集的概率,这与表面疏水性增强可促进蛋白聚集结构形成的规律一致[21]。牛乳对照进一步验证了羊乳的种属差异性。由图10-c和图10-d可知,牛LF在100 ℃乃至121 ℃高温胁迫下,非还原条件仍维持清晰主带,未出现羊乳(图10-a)条带消失及上样孔大量聚集的现象,且还原后可完全恢复至单体。这证实牛乳中高温诱导的交联以可逆性二硫键或非共价作用为主,不涉及羊乳体系的早期不可逆共价交联崩塌。牛LF的失活在更大程度上受自身构象失稳,牛LF在72～75 ℃条件下可保持较高结构完整性[22-23],而显著聚集通常出现在≥80 ℃。同样在65～75 ℃下牛LF与乳清蛋白间的交联仍处于早期阶段,多为可逆复合体[24];真正的不可逆失活多发生于超高温灭菌或高热条件,牛LF主要在接近120 ℃才进入不可逆构象破坏阶段[25]。本研究中,羊LF在75～100 ℃即出现明显带型衰减,并在121 ℃完全失活,说明其临界温度显著低于牛乳。

以上研究表明牛乳体系中LF失活遵循自身影响,而羊乳则受到体系诱导影响,即LF是否失活取决于β-Lg与α-La的交联。且羊β-Lg游离巯基含量更高、更易通过二硫键形成聚集,因此羊LF不可逆复合形成更早、更不可逆。这一结果说明牛乳数据不能直接外推至羊乳体系,加工参数应基于羊乳自身蛋白互作特性重新设定。本研究结果进一步明确,75 ℃/10 min是避免进入不可逆复合阶段的关键工艺参数条件。

3 结论

本研究对加热处理下山羊乳聚集物的产生进行了分析,系统揭示了羊乳LF在热处理过程中的三阶段失活机制,并明确了75 ℃/10 min为最佳羊乳LF保活窗口,可有效避免β-Lg游离巯基暴露所诱导的二硫键交联,从而最大程度减缓LF活性的降低。相较高温处理(100 ℃及121 ℃),低温处理更能保持LF的天然构象及免疫活性,乳清体系中LF免疫活性保留率下降显著高于纯LF,说明失活不仅取决于热处理强度本身,热处理下由于β-Lg、α-La等蛋白互作导致乳清蛋白聚集物的产生也是羊LF活性保留率下降的主因。本研究从体系稳定性、二级/三级结构变化到分子互作机制3个层面揭示了羊乳LF热失活的特征规律,为羊乳产品热加工参数的设定提供了依据。未来,可进一步探索温和加热结合非加热技术策略以抑制β-Lg诱导的过度聚集,从而为提升高活性羊乳功能制品的加工提供新的思路与方向。

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