纳豆是一种发酵豆类食品,起源于中国,盛行于日本,其含有氨基酸、维生素、多糖、多酚等多种成分,具有溶血栓、抗肿瘤、降血压、预防骨质疏松等多种生理活性[1]。在浸泡、蒸煮后的黄豆中接种纳豆枯草芽孢杆菌,发酵一定时间后黄豆表面产生菌膜,搅拌黄豆产生白色黏稠状拉丝,这是纳豆区别于其他豆制品的标志性特征[2]。纳豆枯草芽孢杆菌在发酵过程中可合成纳豆激酶,该酶属于丝氨酸蛋白酶,能溶解血栓,预防心血管疾病[3]。同时,纳豆菌在生长繁殖过程中会分解蛋白质,生成氨基酸态氮和挥发性盐基氮等,两者的含量可在一定程度上反映纳豆品质[4-5]。
纳豆仅以豆、水和纳豆枯草芽孢杆菌为原料制成,不添加其他物质。纳豆的制备过程包括大豆浸泡、蒸煮、接种、发酵、后熟等,浸泡环节的泡豆水质、浸泡温度、浸泡时间等直接影响豆制品的品质[6]。相较于浸泡时间、温度等研究较充分的因素,水质对豆制品品质的相关研究较为匮乏,其潜在作用不容忽视。软水(硬度为0～50 mg/L)制备的豆制品中蛋白质利用率更高,且色泽、口感更佳[7]。钟桂兴等[8]采用不同水样制备豆腐,研究发现硬度较高的水样会抑制大豆蛋白溶出,导致豆腐凝胶网络结构不够紧密,影响豆腐整体的品质。此外,水样中适量的金属离子(Ca2+、Mg2+、Na+等)对纳豆激酶活性有积极影响[9]。但尚无研究系统阐述泡豆水的离子浓度对纳豆品质的潜在影响。因此,明确不同泡豆用水对纳豆品质的影响,得到制备纳豆的最佳泡豆水参数,对企业优化生产工艺、提高产品质量并保障生产批次稳定性具有重要的现实指导意义。
本文通过市政供水复配不同比例的反渗透水,以降低市政供水的电导率,制备不同离子浓度的泡豆用水,对其pH值、电导率、硬度、金属离子浓度进行检测,探究不同离子浓度泡豆水对纳豆的感官评分、质构、色泽、纳豆激酶、氨基酸态氮、挥发性盐基氮等指标的影响,得到最适纳豆生产的泡豆用水及参数,为企业提供产业优化的理论支持。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
纳豆芽孢杆菌剂、黄豆,燕京中发生物技术有限公司;蚓激酶,中国药品生物制品检定所;凝血酶、纤维蛋白原,中国食品药品检定研究院;铬黑T指示剂、0.05 mol/L EDTA溶液、氯化铵、氨水,上海麦克林生化科技股份有限公司。
1.2 仪器与设备
纯水仪,骇思仪器科技(上海)有限公司;CTAH-260变温发酵培养箱,上海思派瑞环境试验设备有限公司;高压灭菌锅,浙江新丰医疗器械有限公司;TA-touch质构仪,上海腾拔仪器科技有限公司;电感耦合等离子体质谱仪,安捷伦科技有限公司;pH仪、DDSJ-308F电导率仪,雷磁(上海)科技有限公司。
1.3 实验方法
1.3.1 纳豆发酵实验
泡豆水制备:取一定量的市政供水复配不同比例的一级反渗透水,得不同水样备用。
纳豆制备:浸泡一定时间的大豆沥干水分于121 ℃灭菌锅中蒸煮30 min,取出冷却,接种0.02 mL/g的菌液至豆子表面,放置于培养箱中分段发酵,4 ℃后熟24～48 h,取部分纳豆用于感官品评,剩余纳豆置于-20 ℃条件下储存备用。
1.3.2 泡豆用水检测
硬度测定:参考GB/T 5750.4—2023《生活饮用水标准检验方法 第4部分:感官性状和物理指标》的检测方法,采用EDTA滴定法测定水样硬度。准确称取2.35 g氯化铵,去离子水溶解后加入35 mL浓氨水,去离子水定容至100 mL得到氨-氯化铵缓冲液(pH=10)。称取100 mL水样于锥形瓶中,沿内壁加入5 mL氨-氯化铵缓冲液和6滴铬黑T指示剂,充分摇动。边摇边滴加0.05 mol/L EDTA溶液直至水样变成浅蓝色。水样硬度的计算如公式(1)所示:
(1)
式中:C,水的硬度,mg/L;C0,EDTA的浓度,mol/L;M0,CaCO3的摩尔质量,g/mol;ΔV,消耗EDTA溶液的体积,mL;V,水样体积,mL;1 000,单位换算。
pH值测定:使用pH仪测定水样的pH值。
电导率测定:使用电导率仪测定水样的电导率值。
金属离子检测:参考国标GB/T 5750.6—2023《生活饮用水标准检验方法 第6部分:金属和类金属指标》,采用电感耦合等离子体质谱仪检测水样中的Ca2+、Mg2+、Fe3+、Na+、Mn2+、Zn2+的浓度。
1.3.3 吸水率和膨胀率测定
称取一定质量的黄豆,洗净晾干,加入3倍体积水样室温浸泡18 h[10]。结束后用于测定黄豆的吸水率和膨胀率,计算分别如公式(2)和公式(3)所示:
吸水率
(2)
式中:g0,浸泡前质量,g;g1,浸泡结束后大豆质量,g。
膨胀率
(3)
式中:V0,浸泡前大豆体积,mL;V1,浸泡后大豆体积,mL。
1.3.4 感官评定
选择后熟结束的纳豆进行感官实验。选择9名受过感官培训的人员对纳豆进行评价,以色泽(10分)、气味(10分)、口感(10分)、黏连性(10分)制定评定标准[11],见表1。
表1 纳豆的感官评分标准
Table 1 Sensory scoring criteria for natto
得分(分)色泽(10分)气味(10分)口感(10分)黏连性(10分)7～10金黄色,有明显光泽有纳豆制品特有的香味,稍许氨味酥软,湿润黏液很多,拉丝多,细长,黏性好4～6浅黄色,有光泽略带氨味酥软,较湿润黏液多,拉丝较多,细长,黏性较好0～3暗黄色,光泽不明显氨味较重较酥软,较干黏液较多,拉丝粗短,黏性一般
1.3.5 纳豆色泽测定
采用色差仪测定纳豆色泽。取适量纳豆紧密放置于5号密封袋中,使用色差仪测定纳豆的L*值、b*值和a*值。
1.3.6 纳豆菌数测定
称取5 g纳豆放置于45 mL无菌生理盐水中,涡旋2 min,制成0.1 g/mL的菌悬液,梯度稀释得到不同稀释倍数的菌悬液。吸取2～3个适宜稀释倍数的菌悬液各1 mL于无菌平皿内,使用涂布棒将菌液均匀涂在平板内,37 ℃倒置培养24 h,选取菌落总数在30～300 CFU之间、无蔓延菌落生长的平板计数,每克样品活菌数的计算如公式(4)所示[11]:
纳豆芽孢杆菌活菌数=A×稀释倍数
(4)
式中:A,适宜菌数平皿的平均菌落数值。
1.3.7 纳豆激酶测定
采用纤维蛋白平板法检测纳豆激酶活性[12]。以1∶17的体积比称取0.01 mol/L磷酸盐缓冲液(pH=7.8)和9 g/L NaCl溶液混合制成工作液。以工作液为溶剂制备质量浓度为1.5 mg/mL纤维蛋白原液和15 g/L琼脂糖液。以9 g/L NaCl溶液为溶剂制备1 mL中含有1 BP的凝血酶溶液和不同单位的蚓激酶标准溶液。取0.6 g纳豆切碎,加入20 mL 9 g/L NaCl溶液于离心管中,室温、300 W超声波处理30 min,12 000 r/min室温离心10 min,得上清液。量取39 mL纤维蛋白原液,55 ℃、39 mL 15 g/L琼脂糖溶液和3 mL凝血酶溶液混匀并倒入直径为14 cm塑料培养皿中,室温冷却,打孔备用。取蚓激酶标准品和样品各10 μL,分别点在孔中,37 ℃恒温培养箱孵育18 h后测量溶圈直径。以蚓激酶标准溶液单位数的对数为横坐标,蚓激酶标准品溶圈两垂直直径乘积的对数为纵坐标,得标准曲线回归方程。将样品溶圈两垂直直径乘积的对数带入方程,计算样品中纳豆激酶活性。
1.3.8 氨基酸态氮测定
参考GB 5009.235—2016《食品安全国家标准 食品中氨基酸态氮的测定》,采用酸度计法检测纳豆的氨基酸态氮。取5 g纳豆碎于具塞锥形瓶中,加入100 mL 80 ℃蒸馏水,放置在磁力搅拌器上1 000 r/min,80 ℃搅拌30 min,8 000 r/min离心10 min取样品上清液。量取20 mL上清液和60 mL水混匀,用NaOH溶液滴定至pH值为8.2,再加入10.0 mL甲醛溶液混匀,NaOH溶液继续滴定至pH值为9.2,记下加入甲醛后消耗NaOH溶液的体积。该步骤在通风橱进行。以水溶液为空白,氨基酸态氮含量的计算如公式(5)所示。
(5)
式中:X,试样中氨基酸态氮的含量,g/100 g;ΔV,加入甲醛后消耗NaOH溶液的体积,mL;c,NaOH溶液的浓度,mol/L;0.014,与1.00 mL NaOH溶液[c(NaOH)=1.000 mol/L]相当的氮质量,g;m,样品的质量,g;V1,样品上清液的取用量, 20 mL;V2,样品上清液的总体积, 100 mL;100,单位换算系数。
1.3.9 挥发性盐基氮测定
参考GB 5009.228—2016《食品安全国家标准 食品中挥发性盐基氮的测定》,采用扩散皿法测定纳豆中的挥发性盐基氮。称取2 g纳豆样品,切碎后加入20 mL去离子水,涡旋均匀,放入摇床室温振荡30 min,4 ℃、10 000 r/min离心10 min取上清液备用。称取10 g阿拉伯胶加10 mL水混匀,再加5 mL甘油和5 g碳酸钾,研匀得水溶性胶。加入3 mL 20 g/L硼酸溶液和3滴甲基红和亚甲基蓝混合指示剂于扩散皿中央内室,在皿外室准确加入3 mL样品上清液,快速加入3 mL饱和碳酸钾溶液,立刻平推磨砂玻璃盖严密,轻轻转动,37 ℃孵育2 h。此时,硼酸吸收大量挥发性盐基氮,颜色变为亮绿色,用0.01 mol/L HCl溶液滴定吸收挥发性盐基氮的硼酸溶液至变色终点,记录消耗盐酸的体积。挥发性盐基氮的计算如公式(6)所示:
(6)
式中:X,试样中挥发性盐基氮的含量,mg/100 g;ΔV,消耗盐酸的体积,mL;c,盐酸标准滴定溶液的浓度,mol/L;14,滴定1.0 mL 1 mol/L盐酸相当的氮的质量,g/mol;m,样品质量,g;V,吸取上清液的体积,mL;V0,样品上清液总体积,mL;100,单位换算系数。
1.3.10 全质构检测
参考林咏珊[13]的检测方法并略作修改。将3颗纳豆放到仪器操作台中,使用质构仪测定纳豆的全质构。仪器设置参数见表2。
表2 全质构设置参数
Table 2 Full texture setting parameters
参数数值单位测试探头P/36—触发力5gf测试速度1mm/s形变量50%—
注：“—”表示无此相关单位(表3同)。
1.3.11 拉丝检测
每盒纳豆搅拌30圈后取3颗纳豆放到仪器操作台中,使用质构仪对纳豆拉丝进行测定。仪器设置参数见表3。
表3 拉丝测试设置参数
Table 3 Wire drawing test setting parameters
参数数值单位测试探头P/36—触发力5gf移动高度15mm测试速度1mm/s压缩目标5mm
1.4 统计分析
每组实验进行3次及以上平行。采用SPSS软件开展单因素方差分析,使用GraphPad 5.0软件进行结果可视化。
2 结果与分析
2.1 泡豆用水的电导率、硬度、pH值、金属离子浓度的结果
如表4所示,市政供水的硬度较高,为中硬水(150～300 mg/L),反渗透水硬度未检出。市政供水的pH值为7.89,为弱碱性,而反渗透水的pH值为6.42,为弱酸性。电导率反映了水样中的离子含量。Ca2+、Mg2+、Fe3+、Na+、Mn2+、Zn2+是水样中的主要金属离子。通过市政供水中复配不同比例的反渗透水,以降低市政供水的硬度、电导率等,以便得到适宜企业生产的泡豆用水。
表4 泡豆用水的参数
Table 4 Parameters for soaking bean water
组别反渗透水∶市政供水的比例总硬度(以CaCO3计)/(mg/L)pH值电导率/(μS/cm)Ca2+/(mg/L)Mg2+/(mg/L)Na+/(mg/L)Mn2+/(μg/L)Fe3+/(μg/L)Zn2+/(μg/L)1100%反渗透水06.428.83——————29∶122.56.8961.85.191.683.596.7011.924.2138∶1256.9473.25.191.823.977.111.746.8448∶2407.2611311.573.858.2413.8422.8710.657∶242.57.11116.39.683.196.7712.0719.3810.7267∶3627.40160.314.054.669.8717.3026.6617.0672∶1757.5517817.455.6111.9121.5431.9421.4189∶5807.5718518.096.0212.7322.1333.3722.9293∶2907.5920720.336.7714.3224.8237.1026.17102∶31357.70305.430.4210.1721.4736.9053.8940.82111∶21507.7438333.8111.323.9140.7159.9746.56121∶41807.8041540.5113.5628.6248.9870.6755.4613100%市政供水2257.8948450.4216.9635.8661.0586.9569.84
注：“—”表示该项指标无数据。
2.2 泡豆用水对大豆吸水率和膨胀率的影响
黄豆含水量低、质地坚硬且内部蛋白质排列紧密,直接蒸煮易出现外层软烂内层坚硬的现象。浸泡一定时间后,水分通过渗透作用进入黄豆内部,黄豆内的可溶性物质也通过扩散作用析出[14]。此时大豆充分吸收水分而膨胀,内部结构舒展,有助于纳豆形成特有的软而不烂、弹性适宜的口感。如图1所示,不同离子含量的泡豆用水对大豆的吸水率和膨胀率影响不显著(P>0.05)。这可能是因为大豆通过渗透作用吸水和膨胀,其内部的淀粉、蛋白质、可溶性糖等形成高渗透压环境,而不同水样(如Ca2+、Mg2+、Na+等离子)的渗透压差异较小,不足以改变大豆的吸水和膨胀上限[15]。综上,纳豆泡豆水的差异不会引起大豆浸泡的差异,需进一步探究其对发酵纳豆品质的影响。为快速筛选得到较适宜纳豆发酵的泡豆水的水质参数范围,选用4组水样进行后续实验。
a-吸水率;b-膨胀率
图1 泡豆用水对大豆的吸水率和膨胀率分析
Fig.1 Analysis of the water absorption rate and expansion rate of soybeans when soaking beans
注:ns表示差异不显著(下同)。
2.3 泡豆用水对纳豆色泽的影响
如图2所示,泡豆用水中金属离子含量等增加引起了纳豆的白度下降、红度和黄度上升(P<0.05),表明水样中微量金属离子通过渗透作用进入黄豆,使不同组黄豆产生差异,进而使纳豆色泽发生变化[16]。如图2-d所示,不同水样发酵成的纳豆色泽变化细微,消费者难以通过肉眼判别,对纳豆品质的影响可忽略不计。
a-L*值;b-a*值;c-b*值;d-纳豆外观
图2 泡豆用水对纳豆色泽分析
Fig.2 Analysis of the color of natto affected by the water used for soaking soybeans
注:*表示显著性P<0.05;**表示显著性P<0.01;***表示显著性P<0.001;****表示显著性P<0.000 1(下同)。
a-色泽;b-气味;c-口感;d-黏连性
图3 泡豆用水对纳豆感官评定的结果
Fig.3 Results of sensory evaluation of natto affected by soaking water for soybeans
2.4 泡豆用水对纳豆感官评定的影响
如图3所示,纳豆的感官评分随着泡豆用水电导率的增加而降低。这表明低电导率的泡豆用水发酵的纳豆感官品质好。其中。色泽的感官评分整体差异不大,这与色泽的结果一致(图2)。纳豆的口感、气味和黏连性随水样电导率的增加而降低,这可能是因为水样中的金属离子影响了纳豆整体品质。基于此,后续实验选择低电导率(8.83～178 μS/cm)的泡豆用水发酵纳豆。
2.5 泡豆用水对纳豆中芽孢杆菌数量的影响
纳豆枯草芽孢杆菌菌数是衡量纳豆品质的重要指标之一,其活菌数越多,纳豆品质越好[1]。如图4所示,泡豆用水中金属离子含量增加,纳豆枯草芽孢杆菌数量呈现先增加后减少的趋势。这表明泡豆用水中金属离子有助于纳豆芽孢杆菌生长繁殖,但到一定浓度后抑制纳豆菌生长。这可能是因为菌体生长过程需要适量的Ca2+、Mg2+、Mn2+等离子,但达到一定浓度后,促进作用被抑制[17]。
图4 泡豆用水对纳豆中枯草芽孢杆菌菌数的影响
Fig.4 Effect of soaking water on the number of Bacillus subtilis in natto
2.6 泡豆用水对纳豆中纳豆激酶活性的影响
纳豆激酶具有溶血栓、预防骨质疏松等多种功能,是纳豆发挥保健功能的核心成分,也是衡量纳豆品质的重要指标之一[3]。纳豆激酶是纳豆菌发酵的产物,发酵条件适宜,纳豆菌生长繁殖良好,纳豆激酶活性高,纳豆品质更优[5]。如图5所示。随泡豆用水的硬度、电导率的增加,纳豆激酶活性呈现先增加再降低的“倒U形”曲线。这表明适当的金属离子浓度对纳豆激酶活性有促进作用。与电导率为484 μS/cm的市政供水相比,电导率小于113 μS/cm的泡豆用水浸泡大豆后发酵纳豆的纳豆激酶活性更好(P<0.05)。这可能是因为低水平的金属离子可以通过激活纳豆枯草芽孢杆菌代谢促进纳豆激酶活性,而高水平的金属离子会抑制纳豆菌活性而干扰纳豆激酶活性[18]。为精准评价纳豆品质,后续选用电导率为8.83～185 μS/cm的泡豆用水发酵纳豆,并增设1组实验组。
图5 泡豆用水对纳豆中纳豆激酶活性分析
Fig.5 Analysis of nattokinase activity in natto by soaking the beans in water
2.7 泡豆用水对纳豆中氨基酸态氮含量的影响
氨基酸态氮来源于纳豆中蛋白质的酶解产物,赋予了纳豆独特的鲜味和发酵香味[19]。氨基酸态氮可作为评判纳豆风味、发酵程度的重要依据,其含量较低代表纳豆发酵不完全,而含量高于某一限值则表示纳豆发酵过度[20]。如图6所示,泡豆用水中金属离子浓度增加,其发酵纳豆中氨基酸态氮含量呈现先增加再减少的趋势。这表明适量金属浓度有利于纳豆中氨基酸态氮的形成。当泡豆用水的电导率为61.8 μS/cm时,纳豆中氨基酸态氮的含量最高,与反渗透水发酵纳豆中氨基酸态氮含量差异显著(P<0.05)。产生这种现象的原因可能是适量金属离子刺激了纳豆枯草芽孢杆菌的生长繁殖,产生了更多的蛋白酶,加速了蛋白质分解,进而产生更多的氨基酸态氮[21],这与纳豆激酶和纳豆菌数(图4和图5)的结果一致。当泡豆用水的电导率高于61.8 μS/cm时,纳豆中氨基酸态氮含量缓慢下降。这可能是因为大豆中金属离子浓度增加,纳豆菌活性下降,蛋白分解速率降低[19]。
图6 泡豆用水对纳豆中氨基酸态氮含量分析
Fig.6 Analysis of amino acid nitrogen content in natto using water for soaking beans
2.8 泡豆用水对纳豆中挥发性盐基氮含量的影响
挥发性盐基氮是纳豆中氨、胺类等物质的总称,是纳豆中刺激性气味(氨味、臭味)的主要来源,也是判断纳豆是否新鲜、腐败变质的关键指标,其含量越低纳豆品质越好[22]。如图7所示,泡豆用水的电导率与纳豆中挥发性盐基氮含量呈现正相关。与市政供水发酵纳豆中挥发性盐基氮含量相比,电导率低于113 μS/cm时,纳豆中挥发性盐基氮含量显著降低(P<0.05)。这可能是因为微量金属离子激活了纳豆中的脱氨酶和脱羧酶,这2种酶分别催化氨基酸脱去氨和羧,形成氮和胺类物质,进而形成挥发性盐基氮[23]。
图7 泡豆用水对纳豆中挥发油盐基氮含量分析
Fig.7 Analysis of the content of volatile oil basic nitrogen in natto using water for soaking beans
2.9 泡豆用水对纳豆全质构的影响
采用质构仪对纳豆质地进行客观描述,通过全质构检测模拟纳豆在口腔中咀嚼的过程,得到硬度、弹性、咀嚼性、内聚性等物理特性指标参数,并与消费者的感官体验直接关联[24]。硬度反映了消费者感官上的“软硬程度”,是纳豆品质的关键指标之一。弹性对应消费者感官上的“弹牙性”,影响了消费者的咀嚼愉悦度[24]。咀嚼性反映了咀嚼纳豆至吞咽所需要的能力,直接影响了消费者的感官体验。内聚性反映了纳豆内部结构的紧密程度,是纳豆品质的关键指标之一。如图8所示。泡豆用水的硬度与纳豆的硬度、弹性、咀嚼性、内聚性呈正相关。这表明泡豆用水的电导率升高,纳豆不仅内部结构更紧密,而且口感变硬、弹性增强且咀嚼难度增加。这可能是因为金属离子与大豆内部的蛋白质、多糖等发生交联反应,使得纳豆结构更紧实,从而影响纳豆的硬度、弹性和咀嚼性等指标[25]。
a-硬度;b-弹性;c-咀嚼性;d-内聚性
图8 泡豆用水对纳豆的全质构分析
Fig.8 The full texture analysis of natto using water for soaking beans
2.10 泡豆用水对纳豆中拉丝特性的影响
采用质构仪单压模式量化纳豆拉丝特性,得到黏力和黏附性的数值。黏力反映了纳豆拉丝的强度,黏附性反映了拉丝的黏附能力,与纳豆品质呈正相关。如图9所示,纳豆拉丝的黏力和黏附性随泡豆用水电导率的增加而增加,到达某一临界值后呈下降趋势。当电导率高于160.3 μS/cm后,纳豆拉丝的拉力和黏附性显著降低(P<0.05)。这可能是因为适宜离子浓度有利于纳豆枯草芽孢杆菌生长繁殖,进而影响分泌酶活性的差异[8]。这与纳豆枯草芽孢杆菌的结果一致(图4)。
a-黏力;b-黏附性
图9 泡豆用水对纳豆的拉丝特性分析
Fig.9 Analysis of the stringing characteristics of natto by soaking beans in water
3 结论与讨论
本文探讨了泡豆用水对纳豆色泽、质构、拉丝、氨基酸态氮、挥发性盐基氮和纳豆激酶的影响。泡豆用水电导率为8.83～113 μS/cm时,纳豆中纳豆枯草芽孢杆菌菌数多,纳豆激酶活性高,氨基酸态氮含量高且挥发性盐基氮含量少,纳豆感官品质被显著改善。未来可进一步分析泡豆水中金属离子对纳豆品质的影响,精准调控泡豆水参数,为纳豆枯草芽孢杆菌的生长代谢及活性酶生成创造环境,进而定向改善纳豆的感官品质、营养特性及功能价值。此外,纳豆生产企业可通过调节纳豆泡豆水的电导率,有效减低不同批次产品间的品质波动,提升生产过程中的标准水平。本研究为企业优化纳豆生产工艺,产品品质精准管控提供了坚实的理论依据和可行的应用基础。
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