在功能性食品研究领域,纳豆是拥有千年历史积淀的传统发酵食品[1],凭借其独特的营养组成与生物活性物质,已成为国际研究热点。大量临床前研究及流行病学调查表明,纳豆中富含的维生素K2、异黄酮、γ-聚谷氨酸等成分[2-4]可通过多靶点协同作用机制,具有显著的改善机体代谢、调节免疫功能及预防慢性疾病的潜力,为亚健康状态的干预与慢性病防治提供了新的膳食策略[5]。值得关注的是,纳豆发酵产物中富含的纳豆激酶[6],是一种丝氨酸纤维蛋白溶解酶,具有很强的纤维蛋白溶解活性,其溶栓机制突破传统药物限制,不仅能够直接水解交联的纤维蛋白生成小肽与氨基酸,还可以将尿激酶原转变成尿激酶,并与纤溶酶原激活剂一起作用于纤溶酶原,将其转变成纤溶酶,从而形成双重溶栓效应[7-8]。同时,因口服生物利用度高[9]、作用持久且安全性良好[10],纳豆激酶作为功能性产品在心血管疾病防治领域极具应用潜力[11-13]。

枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis),行业上习惯称作纳豆菌或纳豆芽孢杆菌,是纳豆发酵过程中的核心微生物,其代谢特性与功能挖掘是提升产品品质与拓展应用领域的关键科学问题。现有研究表明,不同来源的枯草芽孢杆菌在发酵中呈现显著的代谢异质性,直接影响纳豆的感官评价和纳豆激酶的产量[14-15]。通过高通量筛选技术,结合基因工程与发酵工艺优化,构建高产纳豆激酶菌株,已成为提升产品功效的重要策略[16-17]。此外,纳豆菌发酵时会产生表面活性素等抗菌肽等物质[18],如唐海峰等[19]发现枯草芽孢杆菌中bacilosarcin B,可通过破坏病原菌细胞膜完整性、干扰DNA代谢等机制,抑制水产养殖中常见的病原菌。这些发现为开发新型生物抑菌剂提供了理论依据,推动其在食品保鲜、生物防治等交叉领域的创新应用。

我国在纳豆及相关产品研究领域已取得阶段性成果,但仍存在菌株性能不足、发酵工艺标准化程度低等问题。在感官接受度、纳豆激酶的活性水平等核心指标上,亟需通过系统的菌株选育、发酵参数优化及质量控制体系构建实现突破。本研究聚焦于高产纳豆激酶枯草芽孢杆菌菌株选育、菌株功能深度挖掘与应用,推动纳豆产业以科技为支撑的发展路径,在功能性食品研发、生物医药转化、绿色农业应用等具体领域加快成果落地,让科技力量为大健康产业添力赋能。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 菌株资源

选取20株自行分离的纳豆发酵用B.subtilis菌株,其中1株保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心,保藏编号为CGMCC 34222,另外19个样品保藏于中国工业微生物菌种保藏管理中心,保藏编号CICC 10023、CICC 10260、CICC 10262、CICC 10263、CICC 10446、CICC 10453、CICC 10454、CICC 10455、CICC 10456、CICC 10457、CICC 10458、CICC 10460、CICC 10461、CICC 20637、CICC 20642、CICC 21076、CICC 22118、CICC 22122和CICC 23916,所选菌株均来源于纳豆或纳豆相关产品,且其分类学地位明确。

1.1.2 主要仪器

2000型分光光度计,尤尼柯(上海)仪器有限公司;BHG-8082型恒温培养箱、THZ-98C恒温振荡培养箱,上海一恒科学仪器有限公司;AL104分析天平,梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司;HH-3A水浴锅,常州国华电器有限公司;MGISEQ-200高通量基因测序仪,华大智造股份有限公司。

1.1.3 试剂与培养基

凝血酶、纤维蛋白原,大连美仑生物技术有限公司;蚓激酶,上海源叶生物科技有限公司,均符合实验标准。

大豆酪蛋白肉汤(tryptic soy broth,TSB)培养基(g/L):胰酪蛋白胨17、大豆蛋白胨3、葡萄糖2.5、NaCl 5、K2HPO4 2.5,pH 7.3±0.2。

麦芽汁琼脂培养基(g/L):麦芽浸出物30、蛋白胨3、琼脂15,pH 7.0±0.2。

纤维蛋白平板:琼脂糖溶液(15 g/L)5 mL,纤维蛋白原溶液(1.5 g/L)5 mL,凝血酶(100 U/mL)100 μL。

1.2 实验材料

1.2.1 高产纳豆激酶菌株初筛

将目标菌株接种于TSB培养基,于37 ℃、180 r/min恒温摇床振荡培养至稳定期。将培养物转移至无菌离心管,4 ℃、8 000 r/min离心10 min,收集上清液作为待检样液。

采用纤维蛋白平板法[20]测定纳豆激酶活力,使用灭菌的3 mm打孔器在纤维蛋白平板上规则布孔,以校准微量进样器吸取10 μL样液精准加样。将平板置于37 ℃恒温培养箱,避光静置培养18 h后,依据透明圈尺寸及清晰度筛选高活性菌株。

1.2.2 模拟发酵实验与评价

制备不同浓度的蚓激酶标准品溶液进行酶活力测定,以酶活力对数为横坐标,两垂直直径乘积对数为纵坐标,通过数据分析构建出标准曲线,结果如图1所示,其方程为y= 0.452 1x-1.176 1,决定系数R2=0.990 6,表明标准曲线的拟合程度极佳。

以筛选出的优势菌株进行纳豆模拟发酵,具体操作如下:大豆浸泡12～16 h,120 ℃高压灭菌30 min;将培养至指数末期的菌种以2%接种量接种至大豆中;发酵阶段:诱导期38 ℃,8 h,主发酵期50 ℃,7 h;4 ℃后熟24～48 h。发酵产物经浸提后测定纳豆激酶活力,并依据T/CNLIC 0036—2021《纳豆》从色泽、拉丝、口感、气味这4个维度进行感官评价(表1)。

1.2.3 菌株抑菌性能分析

将枯草芽孢杆菌(CGMCC 34222、CICC 10460、CICC 23916、CICC 21076和CICC 20642)接种于TSB液体种子培养基,37 ℃、200 r/min摇床恒温培养18 h,备用。

将白假丝酵母(Candida albicans)接种于麦芽汁琼脂培养基,用打孔器在麦芽汁琼脂培养基上打出直径为6 mm的小孔,将10 μL枯草芽孢杆菌发酵液加入小孔中,在28 ℃培养24～48 h,测量抑菌圈直径。

1.2.4 菌株基因组特征分析

围绕纳豆菌株的多元性能展开,综合考量纳豆激酶活力、发酵效能与抑菌活性指标,筛选出性能优异的枯草芽孢杆菌CGMCC 34222和CICC 10460菌株。采用BGI高通量测序平台完成该菌株全基因组序列测定。随后,运用MUMmer[21]、BLAST[22]等生物信息学工具,将CGMCC 34222和CICC 10460菌株基因组与NCBI数据库中纳豆相关菌株基因组进行全面比对,鉴定单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)位点,并系统解析菌株间的遗传变异特征。同时,依托COG(直系同源蛋白数据库,http://www.ncbi.nlm.nih.gov/COG/)与KEGG(京都基因和基因组百科全书,http://www.genome.jp/kegg/)这两大功能注释数据库,对菌株全基因组进行深度解析,明确与代谢、发酵及抑菌相关的关键功能基因。最后,采用antiSMASH[23]对2株菌的次生代谢物生物合成基因簇进行系统鉴定与功能注释。通过其特异性算法整合基因组序列数据,实现对完整型(含所有必需功能模块)及部分型(缺失非必需功能模块)基因簇的精准识别与功能注释,解析细菌次级代谢产物合成机制。

1.2.5 响应面优化纳豆发酵条件

综合现有文献报道及前期项目实践经验,接种量、发酵温度与发酵时间对发酵过程及产物特性具有显著影响[24],因此,将其作为本次响应面优化实验的3个核心考察因素。以感官评价为响应值,同时测定对应的纳豆激酶活力,设计3因素3水平的响应面实验,实验因素及水平如表2所示。这一选择源于上述参数对发酵过程及产物特性具有显著影响,同时与前期项目中观察到的各因素同目标指标间的密切关联性,能够为后续借助响应面法构建数学模型、探寻最优工艺条件,提供兼具科学性与实际贴合度的研究基础。

2 结果与分析

2.1 高产纳豆激酶菌株筛选结果

2.1.1 菌株初筛结果

20株菌株的纳豆激酶活力透明圈结果(图2)显示,枯草芽孢杆菌CGMCC 34222、CICC 20642、CICC 10460、CICC 21076和CICC 23916的透明圈较明显,直径均大于20 mm,纳豆激酶活力在10 000 U/mL以上,明显高于其他菌株。

2.1.2 模拟发酵验证

根据1.2.2节中蚓激酶标准曲线,对初筛得到的优势菌株模拟发酵产物进行纳豆激酶活力测定和分析,结果显示,CGMCC 34222菌株发酵生产的纳豆,其纳豆激酶活力表现尤为突出,经测定达到75 794 U/g(表3)。感官评价结果表明,采用菌株CGMCC 34222和CICC 10460感官评价分值较高,其中菌株CGMCC 34222发酵的纳豆色泽金黄,口感无苦涩,略湿润,拉丝状态好,氨味较淡,有助于提升产品市场接受度(表4)。

2.2 菌株抑菌性能分析

抑菌实验结果表明,枯草芽孢杆菌CGMCC 34222、CICC 20642、CICC 10460、CICC 21076和CICC 23916对白假丝酵母的抑制效果存在明显差异。其中,菌株CGMCC 34222在培养基表面形成了直径约为25 mm的显著抑菌圈,较其他菌株表现出更强的抗真菌活性(图3)。抑菌效果表明,菌株CGMCC 34222能够通过代谢产物抑制白假丝酵母的生长,推测其可能合成具有抗菌或抗真菌活性的蛋白类或小分子物质。

2.3 菌株基因组特征分析

2.3.1 全基因组测序数据分析

枯草芽孢杆菌CGMCC 34222和CICC 10460全基因组测序圈图如图4所示,CGMCC 34222测序结果共获得100个Contig,基因组大小为4 095 838 bp,N50长度为72 266 bp,GC含量为43.30%,Q30值95.57%,注释得到4 357个基因。CICC 10460测序结果共获得78个Contig,基因组大小为4 088 803 bp,N50长度为95 494 bp,GC含量为43.32%,Q30值95.63%,注释得到4 344个基因。该结果从基因组组装完整性(Contig数、N50)、序列特征(GC含量)、测序质量(Q30)及基因功能注释情况等方面,系统呈现了枯草芽孢杆菌的全基因组测序信息,数据指标清晰且完整。

2.3.2 SNP差异分析

结合表5呈现的基因组SNP差异分析结果可见,枯草芽孢杆菌CGMCC 34222与NCBI公共数据库中纳豆相关基因组序列进行比对时,SNP差异数量均超过30。这一结果表明,枯草芽孢杆菌CGMCC 34222的基因组具有鲜明的遗传独特性,其遗传信息组成与其他纳豆相关菌株存在较大差异。

进一步分析发现,菌株CGMCC 34222编码纳豆激酶的丝氨酸蛋白酶基因出现特异性变异。在Serine protease基因所示序列有2个关键位点发生鸟嘌呤(G)和胞嘧啶(C)的碱基替换,导致非同义突变并引起对应氨基酸序列的改变,氨基酸分别由精氨酸和丙氨酸突变为甘氨酸。这一分子层面的结构变异可能改变蛋白质活性中心或底物结合位点,从而影响酶的催化效率和底物特异性,为解释菌株展现出的高酶活力及优异发酵适应性方面的表型提供了的重要遗传学证据,并为后续功能机制研究与菌株改良提供了潜在靶点。

2.3.3 CGMCC 34222功能基因注释

综合KEGG与COG注释结果(图5、图6),菌株CGMCC 34222呈现多维度功能特征。在KEGG注释中,其代谢相关通路较为丰富,涵盖碳水化合物代谢、氨基酸代谢等核心代谢途径,凸显基础物质代谢的多样化功能;同时,环境适应相关通路(如药物抗性、免疫相关通路)的明确注释,提示其具备应对复杂环境挑战的潜力;此外,涉及细胞生长死亡、信号传导等通路,表现出对生命活动调控的重要潜在作用。COG注释结果与KEGG分析相互印证。碳水化合物、氨基酸的转运与代谢等功能占比突出;细胞周期、信号转导等功能的分布,与细胞生命活动的精密调控密切相关;而存在的一般功能预测及未知功能注释,表明仍有部分功能有待深入挖掘。

整体而言,该菌株既展现出代谢、细胞调控等多方面功能潜力,亦存在值得探索的未知空间。综上,其不仅代谢功能丰富,涉及多种生命活动调控通路,兼具环境适应潜力,且部分功能需进一步明确,为深入研究其生理特性与生态功能奠定重要基础。

2.3.4 CGMCC 34222耐药基因和毒力基因分析

使用数据库CARD和软件RGI,以Perfect和Strict算法为筛选标准,ResFinder数据库以序列相似性≥90%,序列覆盖度≥60%,作为筛选标准。结果共检测到6种抗生素耐药相关基因:aadK、mphK、tmrB、vmlR、ykkC和ykkD(表6)。aadK基因与氨基糖苷类抗生素和链霉素抗生素耐药相关,与CARD和ResFinder数据库中参考序列相似度≥90%和覆盖度为100.00%。mphK与大环内酯类抗生素耐药相关,与CARD和ResFinder数据库中参考序列相似度≥90%和覆盖度为100.00%。tmrB与核苷类抗生素耐药相关,与CARD数据库中参考序列相似度≥90%和覆盖度为100.00%。vmlR与林可酰胺类、链阳霉素抗、链阳霉素A、链阳霉素B、核苷类和截短侧耳素抗生素耐药相关,与CARD数据库中参考序列相似度≥90%和覆盖度为100.00%。ykkC、ykkD与氨基糖苷类、四环素类和酰胺醇类抗生素耐药相关,与CARD数据库中参考序列相似度≥90%和覆盖度为100.00%,上述6种基因均为枯草芽孢杆菌中常见的耐药基因,不存在安全性方面的风险。

以VFDB数据库中序列经实验验证的setA为分析数据集,以序列相似性≥80%、序列覆盖度≥70%作为筛选标准。结果显示,未检测到毒力相关基因。使用VirulenceFinder数据库进行毒力基因检测,以数据库默认参数序列相似性≥90%、序列覆盖度≥60%作为筛选标准。结果显示,未检测到毒力相关基因。

2.3.5 CGMCC 34222抗菌肽基因分析

基于全基因组数据,利用生物信息学预测手段,鉴定、注释及次生代谢物生物合成基因簇分析结果如表7所示,其中Region 3为核糖体合成和翻译修饰后修饰的核糖体肽化合物(ribosomally synthesized and posttranslationally modified peptides,RiPPs),其具有多种抗菌功能,可以通过靶向结合细菌外膜蛋白等方式,抑制细菌生长、阻止细菌外膜蛋白装配或阻碍肽出口通道等,从而发挥抗菌作用[25]。Reaior 2是硫肽类,属于核糖体合成和翻译修饰后修饰的核糖体肽化合物,与枯草芽孢杆菌中已知的环肽亚硫菌素A具有较高的相似度[26]。Region 1是Ⅲ型聚酮合酶(Type Ⅲ polyketide synthases,T3PKS)。Region 4是萜烯类化合物。Region 5是非核糖体肽金属基团。

2.3.6 响应面优化

本研究通过3因素3水平响应面法来确定纳豆固态发酵条件工艺,实验设计及结果如表8所示。利用Design-Expert 13软件对表8中感官评价的数据进行多元回归拟合分析,得到以感官评价为响应值(Y)的回归模型方程为:Y=31.48-0.125A+1.5B+0.075C+1.6AB-0.05AC-0.4BC-0.415A2-2.97B2-0.415C2。如表9所示,响应面回归模型极显著(P<0.01),模型失拟项不显著(P=0.090 4>0.05),且模型的决定系数R为98.21%,表明模型选择适当,且可信度较高,模型与实验拟合良好,试验误差小,因此可以用此模型预测分析。

根据表9中的F值大小,可以看出3个因素对纳豆感官评价影响的主次顺序为:温度>接种量>发酵时间,根据P值,可以看出发酵温度B、温度与接种量的交互作用AB以及B2对纳豆感官得分具有极显著的影响(P<0.01)。

利用Design Expert 13软件作出各因素间的交互作用对纳豆感官得分影响的响应面曲面图及等高线图,如图7所示。温度B与接种量A间的交互作用对纳豆激酶活力的影响呈现抛物面型关系,出现极大值,另外2个因素间交互作用的等高线呈椭圆形,表明影响显著,但发酵时间C与接种量A、发酵时间C与发酵温度B的交互作用,对纳豆感官评价的影响均不显著(P>0.05)。根据模型拟合出最佳发酵条件:接种量2.78%,温度46.67 ℃,发酵时间6.67 h,在该条件下预测值为31.71分。考虑操作的方便性,将上述发酵条件调整为:温度47 ℃,接种量2.8%,发酵时间6.6 h进行验证试验。在此条件下的纳豆感官得分为31.4分,与预测值相近,较初始感官品评有很大提升。由此可见,可以利用响应面分析法对纳豆发酵条件进行优化。

发酵条件优化实验结果表明(图8),在纳豆发酵过程中,温度、时间与接种量均与响应值纳豆激酶活力及纳豆感官评价呈负相关关系。其中,温度对两者的影响最为显著,其作用强度远超时间与接种量2因素。值得注意的是,在上述优化得出的最佳发酵条件下,纳豆激酶活力可达到105 157 U/g,较出初始酶活力提高了38%,展现出良好的发酵效果。同时,从图5可以看出,若想进一步提升纳豆激酶的酶活力,可适当降低培养温度。经软件预测,当温度调控至40 ℃时,纳豆激酶活力可达到约300 000 U/g。这一结论为纳豆激酶口服液等相关产品的生产工艺优化提供了切实可行的指导方向。

3 结论与讨论

本研究聚焦高产纳豆激酶枯草芽孢杆菌选育、功能挖掘及基因组特征分析。结果显示,菌株CGMCC 34222在功能和应用等方面表现突出。首先,CGMCC 34222发酵纳豆的纳豆激酶活力可达75 794 U/g,显著优于其他菌株,且其发酵纳豆气味淡雅,能够提升产品的市场接受度,为纳豆的工业化生产提供了优质的菌株资源。其次,CGMCC 34222对白假丝酵母具有显著抑制效果,为新型生物抑菌剂的开发提供了潜在途径,有望推动纳豆菌在食品保鲜、生物防治等交叉学科领域的创新应用。此外,基于全基因组数据分析表明CGMCC 34222具有独特性,与纳豆相关菌株的基因组在SNP位点差异数均超30个,且其编码纳豆激酶的基因存在2个碱基替换引发的非同义突变,这可能是菌株高酶活力及优良发酵适应性的重要遗传基础。在耐药和毒力基因检测中,CGMCC 34222含有6种常见抗生素耐药相关基因,但未检测到毒力相关基因,为其安全性评估和合理应用提供了重要参考依据。通过以接种量、发酵温度、发酵时间为核心考察因素,感官评价为响应值优化纳豆固态发酵条件,最终模型拟合最佳条件为接种量2.78%、温度46.67 ℃、时间6.67 h,调整后验证试验感官得分为31.4分,与预测值接近,且此条件下纳豆激酶活力达105 157 U/g,表明该响应面优化方法有效。

综上,本研究成功选育出高产纳豆激酶且具多重功能的枯草芽孢杆菌CGMCC 34222,为纳豆产业发展提供关键支撑。后续将进一步优化发酵工艺、剖析抑菌活性物质机制、加强菌株安全性长期监测,推动纳豆产业在功能性食品、生物医药、绿色农业等领域可持续发展。

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LIU Hongqiang1, FU Xiaofen2, LIN Geer1, AN Yi2, TANG Tengfei1, YU Xuejian1, SUN Sijia1, ZHAI Lei1, MENG Qingmin2,YAO Su1*

1(China National Research Institute of Food and Fermentation Industries Co.Ltd., China Center of Industrial Culture Collection, Beijing 100015, China)

2(Beijing Yanjing Zhongfa Biologic Technology Co.Ltd., Beijing 101300, China)

ABSTRACT High-performance multifunctional strains are critical for innovation in the natto industry.This study aimed to screen Bacillus subtilis strains with high nattokinase productivity and systematically conduct functional analysis and application development of the selected strains.Through specific screening of Bacillus subtilis, an outstanding strain CGMCC 34222 with high nattokinase yield was identified, and the nattokinase activity reached 75 794 U/g, accompanied by excellent sensory properties, including a subtle aroma and prominent stringiness.Functional analysis revealed that this strain exhibits significant inhibitory activity against Candida albicans, with an inhibition zone diameter of approximately 25 mm, thereby demonstrating its potential for developing novel biological antimicrobial agents.Genomic characterization indicated that the single nucleotide polymorphisms of strain CGMCC 34222 were significantly different from those of known natto-related strains.Notably, the serine protease gene encoding nattokinase contains specific variations, which are hypothesized to underlie its high enzymatic activity.Subsequent optimization of fermentation conditions via response surface methodology determined the optimal parameters:2.8% inoculation, 47 ℃, and 6.6 h fermentation time.Under these optimized conditions, the nattokinase activity reached 105 157 U/g, with the highest sensory score.The strain CGMCC 34222 in this study serves as a critical basis for the industrial application of natto in functional foods, biomedicine, and green agriculture.

Key words Bacillus subtilis;nattokinase;strain breeding;function mining;functional application

DOI：10.13995/j.cnki.11-1802/ts.044386

引用格式：刘红强,付晓芬,林格儿,等.高产纳豆激酶枯草芽孢杆菌菌株的选育、功能挖掘与应用研究[J].食品与发酵工业,2026,52(13):30-38.LIU Hongqiang, FU Xiaofen, LIN Geer, et al.Breeding, functional mining and application of high-yield nattokinase-producing strains of Bacillus subtilis[J].Food and Fermentation Industries,2026,52(13):30-38.

第一作者：硕士,工程师(姚粟正高级工程师为通信作者,E-mail:su.yao@china-cicc.org)

收稿日期：2025-09-02,改回日期:2025-11-26