荔浦芋膳食纤维的益生作用及主要活性成分研究

荔浦芋(Lipu taro)是广西荔浦市特有的国家地理标志产品,以粉糯口感和独特营养风味著称。一些报道将芋头称之为“植物胰岛素”,从某些方面来看,芋头是更适合糖尿病患者的主食。首先,芋头是一种中升糖指数(glycemic index,GI)的食物,其升糖指数低[1]。其次,芋头营养成分丰富,富含膳食纤维且具有饱腹感,芋头中的抗性淀粉和可溶性纤维形成黏稠凝胶,降低葡萄糖在胃肠道的吸收效率,可溶性纤维增加粪便量,刺激肠道蠕动,并作为益生元促进双歧杆菌和乳酸菌的增殖。芋头膳食纤维吸收水分后可占据胃腔并膨胀,延缓胃部时间,产生持续饱腹感,适合希望减重和控制热量摄入的人,对于需要控制体重的糖尿病人来说是非常友好的[2]。根据现有研究可知,荔浦芋中含有淀粉、多糖和蛋白质等物质,且荔浦芋球蛋白和水溶性多糖对糖代谢有调节作用[3-5],可能由于存在多糖和蛋白质,使得芋头能够成为糖尿病患者的主食。

人体中的有益菌有双歧杆菌属和乳杆菌属,大肠杆菌是人体内普遍存在且具有代表性的有害菌,膳食纤维可以促进有益菌的丰度,产出较多短链脂肪酸从而抑制有害菌的生长。本研究选取两歧双歧杆菌、青春双歧杆菌、德氏乳杆菌保加利亚亚种、鼠李糖乳酪杆菌及大肠杆菌作为研究对象。在60%～80%的成年人大肠中最丰富的双歧杆菌种类是青春双歧杆菌,已有研究将其视为能促进健康的细菌物种[6],两歧双歧杆菌在所有年龄段均能检出,婴儿期丰度最高,成人期稳定存在[7-8]。这2种双歧杆菌是人体肠道核心双歧杆菌,可高效发酵膳食纤维产短链脂肪酸。德氏乳杆菌保加利亚亚种作为一种公认安全的食品级益生菌,其遗传特性、生理功能和代谢途径已被深入研究,适合作为模型菌株进行研究,但其对胃酸和胆汁的耐受性较弱,难以长期定植[9]。鼠李糖乳酪杆菌对胃酸和胆汁耐受性较强,凭借其高效的膳食纤维代谢能力、稳定的肠道定植特性、明确的益生机制、标准化的研究体系和可靠的安全性,成为膳食纤维益生作用研究的理想益生菌模型[10]。这2种乳杆菌属经典菌株,能够利用膳食纤维并产生短链脂肪酸,益生特性明确且研究成熟;大肠杆菌可作为肠道条件致病菌指示菌,直观反映菌群平衡状态[11]。该组合可全面表征膳食纤维促有益、抑有害的核心益生作用,为膳食纤维益生机制研究提供可靠菌株模型。

多糖广泛存在于植物、动物和微生物中,包括淀粉、糖原、纤维素、果胶等多种形式,而膳食纤维则是多糖的一个特殊子集。值得关注的是,糖醛酸作为果胶类膳食纤维的核心功能性成分,其分子结构中的羧基基团可与益生菌分泌的果胶酶特异性结合,通过逐步降解为小分子寡糖为益生菌提供碳源,因此糖醛酸含量直接决定膳食纤维的益生菌利用效率,是评价其益生品质的关键指标[12]。通过外源性干预手段调控肠道菌群结构,已成为功能性食品开发与疾病预防的核心方向,益生元因能选择性促进肠道益生菌增殖、抑制有害菌生长,展现出广阔的应用前景[13]。

本研究选择高温酶法提取荔浦芋膳食纤维。该方法相较于传统提取法具有显著优势,可高效破坏植物细胞壁结构提升提取效率[14],同时有效保留糖醛酸等特征性活性成分,且能同步去除淀粉、蛋白等杂质提升产品纯度[15-16],为后续活性成分分析与菌群调控研究奠定优质原料基础。

膳食纤维的益生价值已得到广泛认可,但当前研究仍存在三大核心缺口:其一,多数研究仅以膳食纤维总含量为评价指标,缺乏对糖醛酸等特征性活性成分的定量分析,导致益生作用的物质基础模糊不清;其二,体外菌株培养的活性结果与动物体内菌群调控效应常存在脱节,缺乏“体外—体内验证”的系统性研究,机制解析深度不足[17]。基于此,以荔浦芋皮膳食纤维为研究对象,系统解决以下核心问题:a.明确荔浦芋膳食纤维基础成分;b.结合菌群多样性、物种组成分析和体外菌株增殖,阐明荔浦芋膳食纤维—菌群互作机制;c.明确SDF中活性成分,为功能性膳食纤维的精准开发提供实验依据与理论支撑。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

荔浦芋,广西荔浦隆赢食品科技开发有限公司;大肠杆菌(Escherichia coli)、德氏乳杆菌保加利亚亚种(Lactobacillus delrueckii subsp.lactis)、鼠李糖乳酪杆菌(Lacticaseibacillus rhamnosus)、两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)、青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentis),陕西云奇生物科技有限公司;高温α-淀粉酶(≥20 000 U/mL),中性蛋白酶(100 U/mg)、菊糖(纯度≥90%)、DEAE-52纤维素、D-半乳糖醛酸(≥98%),上海源叶生物技术有限公司;DNS试剂,北京索莱宝科技有限公司;ICR小鼠(4周龄,雄性,20～25 g),广州栢睿生物科技有限公司。其他试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

SCIENTZ-10N冷冻干燥机,宁波新芝生物科技股份有限公司;H/T16MM台式高速离心机,湖南赫西仪器装备有限公司;SHZ-88水浴恒温振荡器,江苏金怡仪器科技有限公司;Infinite E Plex多功能酶标仪,奥地利TECAN公司;EMS-30磁力搅拌恒温水浴锅,常州爱华仪器制造有限公司;PHS-25 pH计,上海仪电科学仪器股份有限公司;C-31厌氧培养罐,日本三菱公司;AN0025A厌氧产气袋,美国赛默飞世尔公司;MJ-Ⅱ霉菌培养箱,上海一恒科技有限公司;HL-2恒流泵,上海精科实业有限公司;G7162A示差折光检测器,Agilent Technologies;DAWN多角度激光光散射检测器,Wyatt Technology Co。

1.3 实验方法

1.3.1 膳食纤维的提取

提取流程:荔浦芋干浸泡1 h后放入打浆机中并加入适量的水,浆液倒入蒸煮桶内并按照1∶15(g∶mL)的料液比补加蒸馏水,煮沸后加入高温α-淀粉酶,30 min后使用碘溶液检测淀粉是否完全酶解,待酶解完全后冷却至45 ℃并加入中性蛋白酶恒温酶解3 h,然后沸水灭酶10 min,温度降低后使用160目滤布过滤浆液,滤液沸水浓缩至原体积的1/6,浓缩液冷却后在8 000 r/min下离心10 min,收集上清液并加入4倍体积的95%(体积分数)乙醇溶液,在4 ℃下静置醇沉8 h,沉淀用蒸馏水复溶后,经冷冻干燥得到可溶性膳食纤维(soluble dietary fiber,SDF)。滤渣使用蒸馏水浸洗4次,在55 ℃下烘48 h,烘干后的样品过80目标准筛得不溶性膳食纤维(insoluble dietary fiber,IDF)。

1.3.2 膳食纤维基础成分分析

蛋白质含量参考GB 5009.5—2025《食品安全国家标准食品中蛋白质的测定》测定;灰分含量参考GB 5009.4—2016《食品安全国家标准食品中灰分的测定》;总糖含量参考SNT 4260—2015《出口植物源食品中粗多糖的测定苯酚-硫酸法》测定;还原糖含量采用3,5-二硝基水杨酸法进行测定;糖醛酸含量采用硫酸-咔唑法测定,波长523 nm,以半乳糖醛酸为标准品绘制标准曲线。

1.3.3 小鼠实验与宏基因组测序

1.3.3.1 小鼠分组与喂养

挑选体重为20～25 g的32只小鼠,自由进食和饮水,喂养5 d适应环境。将32只小鼠随机分为4组,每组8只单笼恒温恒湿饲养,保证12 h光照及12 h黑暗循环条件。单只小鼠每日灌胃剂量与实验分组见表1。每只小鼠每日给样品量为37.5 mg,其中IDF组以200 μL 3 g/L羧甲基纤维素钠溶液为助悬介质制备混悬液灌胃;菊糖组与SDF组均采用200 μL无菌生理盐水配制后灌胃。空白对照组每只小鼠每日仅灌胃200 μL无菌生理盐水。羧甲基纤维素钠是动物实验常用混悬辅料,可稳定分散不溶性试样。每天喂1次,其他时间饲喂基础饲料。实验符合动物伦理委员会所制定的伦理学标准(GXU-2024-314)。

1.3.3.2 样品采集与测序

收集第14天的粪便。在给小鼠灌胃之前,轻压小鼠肠部,将粪便排入已灭菌的离心管中,密封后-80 ℃保存。小鼠粪便委托中科新生命(浙江)生物科技有限公司进行深度6 G的宏基因组检测。

1.3.4 体外单菌发酵

1.3.4.1 培养基制备

乳杆菌培养基(g/L):蛋白胨10、牛肉浸粉5、酵母浸粉4、K2HPO4 2、CH3COONa 5、柠檬酸三铵2、MgSO4 0.2、MnSO4 0.05、吐温-80 1 mL。

双歧杆菌培养基(g/L):胰蛋白胨10、酵母浸粉5、牛肉浸粉3、K2HPO4 2、MgSO4 0.2、MnSO4 0.05、L-半胱氨酸0.5、吐温-80 1 mL。

大肠杆菌培养基(g/L):胰蛋白胨10、NaCl 10。

1.3.4.2 生长曲线测定

将菌株在37 ℃厌氧培养罐中活化2次,然后进行发酵实验。添加供试碳水化合物作为唯一碳源进行实验,碳水化合物添加量为10 g/L,接种量1%,发酵培养在37 ℃的厌氧培养罐中进行,采用比浊法在不同时间间隔取样200 μL,并使用酶标仪在600 nm下测定乳杆菌、双歧杆菌、大肠杆菌的OD值。以培养时间为横坐标,吸光度为纵坐标,绘制生长曲线。供试碳水化合物分别为SDF、IDF和SDF经过DEAE-52分离后的组分,同时以不添加碳水化物做空白实验,以添加菊糖做阳性对照实验。

1.3.5 可溶性膳食纤维纯化分离

脱色、脱蛋白:可溶性膳食纤维配制为质量分数2%的溶液,调节pH值为4,活性炭添加量为0.6%,在40 ℃水浴锅中搅拌30 min,冷却至室温后离心,收集上清液,滤液使用Sevage法脱蛋白3次,挥干Sevage试剂后按1∶10(g∶mL)的比例加入AB-8型大孔树脂,在120 r/min、30 ℃摇床中振荡6 h后抽滤,滤液冷冻干燥得到脱色、脱蛋白后的可溶性膳食纤维。

分离:层析柱(3 cm×50 cm)中加入已活化的100 g DEAE-52填料,使用蒸馏水平衡层析柱。称量350 mg的样品,溶解在7 mL的蒸馏水中,用0.45 μm的水滤膜过滤,滤后的水溶液使用吸管吸取滤液加入到层析柱中,静置15 min后,使用0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mol/L的NaCl溶液梯度洗脱样品,恒流泵流速1 mL/min,每管9 min。采用苯酚-硫酸法在490 nm检测每管洗脱液吸光度,以吸光度为纵坐标,洗脱管数为横坐标做洗脱曲线。洗脱组分使用3 500 Da的透析袋透析48 h除盐,冷冻干燥。

1.3.6 分子质量的检测

通过高效液相分子排阻色谱联用激光光散射仪和示差检测器串联检测法检测。

色谱条件:仪器:安捷伦 1260 高效液相;色谱柱:色谱柱为Shodex Ohpak 806HQ (13 μm, 8.0 mm×300 mm)与Shodex Ohpak 804HQ (10 μm, 8.0 mm×300 mm)串联使用;流动相:0.2 mol/L NaCl;流速:1.0 mL/min;检测器:示差折光检测器和多角度激光光散射检测器;dn/dc(mL/g)=0.138 0。

样品前处理:精密称取多糖样品各10.0 mg,定容至1.0 mL,配制成10.0 mg/mL的样品溶液。所有溶液过0.22 μm的微孔滤膜,然后进高效液相分子排阻色谱分析。

单糖组成采用高效离子色谱法测定;色谱柱:Dionex CarbopacTM PA20 (3 mm×150 mm);流动相:A相(水)、B相(15 mmol/L NaOH)、C相(15 mmol/L NaOH+100 mmol/L CH3COONa);流速0.3 mL/min,柱温30 ℃,进样量25 μL;检测器:电化学检测器。

样品前处理:5 mg样品+3 mol/L三氟乙酸 2 mL,120 ℃水解3 h,氮吹吹干后加入5 mL水涡旋混匀,吸取10 μL加入990 μL去离子水,12 000 r/min离心5 min,取上清液过0.22 μm微孔滤膜。

实验所得到的数据均以“平均值±标准差”表示。Oringin 2022软件绘制生长曲线、多样性和物种组成图,SPSS 26.0软件进行单因素方差分析,P<0.05为差异显著,分子质量由ASTRA 8软件进行数据的收集和计算。

2 结果与分析

2.1 膳食纤维基础成分分析

由表2可知,SDF中总糖含量达(85.61±0.007 3)%,糖醛酸含量为(16.90±0.42)%,还原糖含量(29.89±0.44)%,高糖醛酸含量提示其易被肠道益生菌降解利用,为后续益生活性实验提供了物质基础依据。蛋白质含量仅为(0.79±0.079)%,灰分含量(1.96±0.035)%,低杂质特性为后续活性验证排除干扰。

IDF中蛋白质含量(0.48±0.031)%,灰分含量(5.43±0.18)%,杂质含量少,为后续实验排除干扰。

2.2 小鼠肠道微生物多样性分析

使用the Good’s coverage指数来分析样品的测序覆盖率,空白组、菊糖组、SDF组、IDF组的测序覆盖深度均大于99.9%,说明测序数据量合理。

α多样性主要由Shannon指数和Chao1指数表征,图1-a和图1-b用箱线图呈现Shannon指数和Chao1指数,Shannon指数反映菌群丰富度与均匀度、Chao1指数反映菌群物种丰富度,仅代表物种数量,与物种占比无关。IDF组的Shannon指数较空白组提升4.1%(P<0.05),说明该组小鼠肠道菌群丰富度和均匀度显著增加,生态结构更稳定,IDF组Chao1指数较空白组和菊糖组显著提升(P<0.05),说明摄入IDF能显著提升小鼠肠道菌群物种丰富度。SDF组与菊糖组的Shannon指数没有显著差异,推断该种来源SDF对小鼠肠道菌群的丰富度和均匀度的影响与菊糖类似,SDF组Chao1指数较空白组和菊糖组显著提升(P<0.05),说明摄入SDF能显著提升小鼠肠道菌群物种丰富度,WANG等[18]利用SDF喂养肥胖小鼠,增加了小鼠肠道微生物的α-多样性,本研究结果与其相同。

β多样性主要利用主坐标分析(principal coordinates analysis,PCoA)进行研究,用PCoA图呈现,由图1-c显示,不同组别之间清晰分离,SDF组和IDF组与空白组和菊糖组相比菌群结构有一定差异,证明该种来源的膳食纤维可改变小鼠肠道微生物组的组成。

2.3 小鼠肠道微生物群落结构分析

由图2-a可知,SDF和IDF显著提高厚壁菌门的相对丰度,空白组、菊糖组、SDF组、IDF组肠道微生物菌门厚壁菌门/拟杆菌门(F/B)的比例分别为40.45%、66.71%、106.45%、92.46%,说明荔浦芋来源的膳食纤维能够增加肠道微生物菌门F/B比值。荔浦芋SDF中含有(16.90±0.42)%的糖醛酸,其拟杆菌门相对丰度应该上升[19],但是图2-a中显示拟杆菌门相对丰度下降,推测可能是由于荔浦芋膳食纤维中含有较多还原糖,高还原糖膳食纤维通过快速发酵提供能量并改变菌群竞争格局,促进厚壁菌门增殖,导致F/B比值升高。结合β多样性结果,证实该组菌群结构向健康方向改变。HU等[20]发现小鼠摄入甘薯SDF后,其F/B比值增加,与本结论一致。

由图2-b可知,SDF和IDF与空白组和菊糖组相比,SDF和IDF能够提高乳杆菌属相对丰度,该结果与α多样性趋势完全呼应,与门水平结果一致。

2.4 不同碳源对乳杆菌、双歧杆菌及大肠杆菌生长的影响

SDF和IDF作为主要碳源时的取样时间参考陈韫慧等[21]绘制植物乳植杆菌生长曲线时的时间间隔,并稍加修改,最终采用比浊法在0、2、4、6、8、10、12、18、24、30 h测定乳杆菌、双歧杆菌的OD600值,大肠杆菌生长OD600值测至24 h。

2.4.1 以SDF和IDF作为碳源对两歧双歧杆菌和青春双歧杆菌生长的影响

图3-a、图3-b显示了两歧双歧杆菌和青春双歧杆菌生长情况,可以看出,在前8 h的对数生长期内,以SDF和菊糖为碳源的益生菌生长迅速,OD600值急剧升高。在8 h后进入生长稳定期,菌液浓度虽有所变化但相对缓和,趋于平稳,OD600值达到峰值。以IDF为碳源的益生菌生长情况与空白组接近。对比图3-a和图3-b可以看出,SDF和菊糖均能作为碳源被两歧双歧杆菌和青春双歧杆菌利用,且生长趋势相似,以IDF作为主要碳源培养这2种菌的生长趋势和空白组相似,说明SDF可以作为有效碳源被这2种菌株利用,但IDF不能作为有效碳源被这2种菌株利用。已有研究表明双歧杆菌能够发酵植物来源的寡糖和多糖[22],植物来源的多糖有作为益生元的潜力。

两歧双歧杆菌和青春双歧杆菌属于放线菌门,由图2-a可知,小鼠摄入SDF、IDF和菊糖后放线菌门相对丰度较空白组均有所下降,推测出现该情况是由于厚壁菌门优先利用该3种碳源,使得环境pH下降,抑制了放线菌门的菌种生长。

2.4.2 以SDF和IDF作为主要碳源对德氏乳杆菌保加利亚亚种和鼠李糖乳酪杆菌生长的影响

图3-c、图3-d显示了德氏乳杆菌保加利亚亚种和鼠李糖乳酪杆菌生长情况,可以看出,德氏乳杆菌保加利亚亚种在0～2 h出现生长延迟期,在2～8 h对数生长期内,以SDF、IDF和菊糖为碳源的益生菌生长迅速,在8 h后进入生长稳定期。鼠李糖乳酪杆菌在0～4 h出现生长延迟期,在4～12 h对数生长期内,以SDF、IDF和菊糖为碳源的益生菌生长迅速,在12 h后进入生长稳定期。以SDF和菊糖为碳源的益生菌峰值相似,以IDF为碳源的益生菌峰值明显低于以SDF和菊糖为碳源的益生菌峰值。对比图3-c和图3-d可以看出,SDF、IDF和菊糖均能作为主要碳源被德氏乳杆菌保加利亚亚种和鼠李糖乳酪杆菌利用,且生长趋势相似,说明SDF、IDF可以作为有效碳源被这2种菌株利用。德氏乳杆菌保加利亚亚种和鼠李糖乳酪杆菌均属于厚壁菌门,在单菌发酵实验中2种菌均能以SDF和IDF为主要碳源生长,与图2-a中厚壁菌门/拟杆菌门的比值SDF和IDF大于空白组的结论相对应。根据JOHN等[23]的研究,低聚果糖和菊糖能作为益生元被乳酸杆菌发酵,SDF和IDF被发酵后的2种乳酸杆菌的生长趋势与菊糖相同,所以SDF和IDF有作为益生元的潜力,且SDF益生效果大于IDF。

2.4.3 以SDF和IDF作为主要碳源对大肠杆菌生长的影响

图3-e显示了大肠杆菌生长情况,SDF、IDF和菊糖作为碳源的生长情况与空白组相似,但是峰值略高于空白组,出现该情况可能是由于SDF、IDF和菊糖3种碳源中均含少量葡萄糖,大肠杆菌以葡萄糖作为碳源生长且不能以SDF、IDF和菊糖作为碳源。根据CONWAY等[24]研究可知,大肠杆菌通常不能降解寡糖和多糖,纤维多糖降解主要由厌氧菌完成,所以大肠杆菌不能以SDF、IDF和菊糖作为主要碳源生长。

2.5 DEAE洗脱曲线与组分特征

采用DEAE-52纤维素柱层析纯化SDF的洗脱曲线如图4所示,经蒸馏水和5个不同浓度的NaCl溶液梯度洗脱后得到6个洗脱峰,它们分别是SDF-0.0(蒸馏水)、SDF-0.1(0.1 mol/L NaCl)、SDF-0.2(0.2 mol/L NaCl)、SDF-0.3(0.3 mol/L NaCl)、SDF-0.4(0.4 mol/L NaCl),SDF-0.5(0.5 mol/L NaCl)。图4中,0.0～0.4 mol/L NaCl溶液洗脱组分对应曲线峰型对称尖锐流畅,且无明显拖尾和多峰现象,说明相同洗脱峰对应的纯化组分性质比较相近[25],0.5 mol/L NaCl溶液洗脱组分有多个相近峰值,说明此处多糖极性存在一定差异。用蒸馏水洗脱获得的成分多为中性多糖,用NaCl溶液洗脱后的成分多为酸性多糖,经图4可知,SDF中有较多酸性多糖且酸性多糖主要由SDF-0.1、SDF-0.2、SDF-0.3组成,推测该3个洗脱组分富集了更多糖醛酸类成分,且其体外益生活性最优。

将SDF-0.1、SDF-0.2、SDF-0.3收集合并,合并后的混合组分后命名为SDF-0.3组分,将SDF-0.4和SDF-0.5收集合并,合并后的混合组分命名为SDF-0.5组分,SDF-0此刻起为SDF-0组分。

2.6 不同碳源对乳酸菌、双歧杆菌及大肠杆菌生长的影响

根据2.4节中5种菌的生长曲线可知,在12 h后5种菌均进入生长稳定期,故选择0、6、12、18、24、36 h时在600 nm处检测吸光度,大肠杆菌生长OD值测至24 h。供试碳水化合物分别为SDF-0组分、SDF-0.3组分和SDF-0.5组分。

2.6.1 以SDF的分离组分作为主要碳源对两歧双歧杆菌和青春双歧杆菌的生长影响

图5-a、图5-b显示了两歧双歧杆菌和青春双歧杆菌生长过程对不同碳源的利用情况,可以看出,两歧双歧杆菌不能以SDF-0组分和SDF-0.5组分为碳源生长,推测这2种组分中可能含有聚合度过高的糖类物质,两歧双歧杆菌缺乏木聚糖和高度分支多糖的降解酶系[26-27],其对木糖和阿拉伯糖的利用能力较弱,更擅长利用含半乳糖的底物,且两歧双歧杆菌代谢能力相对有限,主要利用简单糖类,对复杂多糖的降解能力较弱。

青春双歧杆菌不以SDF-0.5组分作为碳源生长但能以SDF-0组分作为碳源生长,这是因为青春双歧杆菌拥有丰富的α-淀粉酶、支链淀粉酶、阿拉伯呋喃糖苷酶和木聚糖酶,但对复杂多糖的摄取效率低[6],SDF-0.5组分中可能含有特殊修饰(如糖醛酸化)的多糖或聚合度过高的多糖,超出了青春双歧杆菌的最佳降解范围[28],使得青春双歧杆菌不能以SDF-0.5组分作为碳源生长。青青春双歧杆菌可利用植物来源的β-葡聚糖进行发酵,从青春双歧杆菌ATCC15703菌株中得到的3种β-葡萄糖苷酶可高效水解β-葡聚糖中的β-1,3/1,4-糖苷键[29]。推测SDF-0组分中含有抗性淀粉、麦芽低聚糖、β-葡聚糖,使得青春双歧杆菌能以SDF-0组分作为碳源生长。

2种双歧杆菌均能利用SDF-0.3组分,可能是因为该组分含有它们各自可利用的混合糖源。

2.6.2 以SDF的分离组分作为主要碳源对德氏乳杆菌保加利亚亚种和鼠李糖乳酪杆菌的生长影响

图5-c、图5-d显示了德氏乳杆菌保加利亚亚种和鼠李糖乳酪杆菌生长过程对不同碳源的利用情况,可以看出,鼠李糖乳酪杆菌不能以SDF-0组分和SDF-0.5组分为碳源生长,德氏乳杆菌保加利亚亚种不以SDF-0.5组分碳源生长但能以SDF-0组分作为碳源生长,2种乳杆菌均能利用SDF-0.3组分。

有研究从基因角度指出,德氏乳杆菌保加利亚亚种因长期适应乳品环境,丢失非必需代谢基因,仅保留葡萄糖、半乳糖、果糖、甘露糖的利用通路,根据德氏乳杆菌保加利亚亚种偏好葡萄糖、半乳糖等六碳糖,推测SDF-0组分中含有葡萄糖、半乳糖等六碳糖,并且由于德氏乳杆菌保加利亚亚种的基因组中缺乏编码木聚糖酶、阿拉伯呋喃糖苷酶等植物细胞壁降解酶的基因[30],限制了其对复杂膳食纤维的利用,推测SDF-0.5组分中主要含有高聚合度的酸性多糖。

鼠李糖乳酪杆菌碳源偏好阿拉伯糖、鼠李糖等五碳糖,但对木糖的发酵能力较弱或不能发酵,这是因为鼠李糖乳酪杆菌缺乏完整的木糖代谢途径,特别是木糖异构酶和木酮糖激酶[31]。鼠李糖乳酪杆菌不能利用SDF-0组分和SDF-0.5组分可能是由于多糖聚合度超过了鼠李糖乳酪杆菌所能利用多糖的限度或者是组分中含有较多的木糖。

2.6.3 以SDF的分离组分作为主要碳源对大肠杆菌的生长影响

图5-e显示了大肠杆菌生长过程对不同碳源的利用情况,大肠杆菌不能有效利用SDF-0组分、SDF-0.3组分和SDF-0.5组分,该结论与2.4.3节结果一致,且SDF-0.3组分和SDF-0.5组分对大肠杆菌生长可能具有抑制作用。

2.7 分子质量

SDF-0组分、SDF-0.3组分、SDF-0.5组分的平均分子质量与多分散指数见表3,SDF-0.3组分的PdI>10,说明该组分分子质量较为分散,SDF-0组分和SDF-0.5组分的分子质量分布较为集中。使用重均分子质量(Mw)和数均分子质量(Mn)衡量分子质量的大小。Mw大小受样品中大分子质量物质的影响较大,Mn大小主要受样品中小分子质量物质的影响。由表3可知,SDF-0.5组分的Mw最大,说明SDF-0.5组分中大分子片段的数量相比于其他样品更多。SDF-0.3组分的Mn最小,说明SDF-0.3组分中小分子片段的数量相比于其他样品更多。将各组分分子质量根据占比划分为3个区域,分别是10%、80%和10%。由表4可知,SDF-0和SDF-0.3组分主要由中小分子质量物质组成,SDF-0.5组分由较多的大分子质量物质组成。

综上,SDF-0.5组分主要由大分子质量的物质组成,SDF-0组分和SDF-0.3组分主要由中小分子质量的物质组成,与2.6.1节和2.6.2节结论一致。

2.8 单糖组成

由表5可知,SDF分离组分由8种单糖组成,其中,SDF-0组分主要由葡萄糖组成,SDF-0.3组分和SDF-0.5组分均由鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、甘露糖、半乳糖醛酸、葡萄糖醛酸组成。在3种SDF分离组分的单糖组成中,葡萄糖、半乳糖醛酸、半乳糖所占比例较大。葡萄糖可能来源于荔浦芋细胞壁纤维素在酶和高温的作用降解所得[32];半乳糖醛酸显示该种来源的膳食纤维中含有果胶[33];甘露糖、木糖可能是由于细胞壁中半纤维素在提取过程中降解所得[34]。SDF-0.3组分和SDF-0.5组分半乳糖醛酸含量较高,可能是因为高温下荔浦芋细胞壁中果胶成分在水的协助下溶出[35]。SDF-0.3组分和SDF-0.5组分均含有较多半乳糖醛酸和葡萄糖醛酸,显示该2种组分中含有酸性多糖。对SDF分离后的各组分做单糖检测后发现,0 mol/L洗脱液洗脱得到的组分中含有大量的葡萄糖,说明该种SDF可能主要来源于纤维素的酶解。果胶类多糖的益生活性核心依赖其特征性组分半乳糖醛酸的含量及结构修饰,SDF-0.3组分和SDF-0.5组分含有较多的半乳糖醛酸,符合果胶类膳食纤维的特征。

综上,SDF是一种果胶类膳食纤维,其分离的SDF-0组分含有大量的葡萄糖,SDF-0.3组分和SDF-0.5组分均含有较多半乳糖醛酸,该部分结论与2.6.1节和2.6.2节结论一致。

3 结论与讨论

本研究通过“成分检测-(体内-体外)验证-菌群解析-分离纯化-体外验证-分子质量+单糖组成联合分析”系统研究高温酶法提取的荔浦芋膳食纤维的益生活性及主要活性成分。研究发现,SDF和IDF中蛋白质和灰分含量较低,SDF中总糖(85.61±0.007 3)%、还原糖(29.89±0.44)%、糖醛酸(16.90±0.42)%。小鼠实验中,样品组与对照组相比,均能够增加肠道微生物的丰度和多样性,同时能够提高厚壁菌门和乳杆菌属的相对丰度。单菌发酵实验中,该来源的SDF能促进4株益生菌的生长,IDF可以促进2株乳杆菌生长,但不能促进2株双歧杆菌的生长;从SDF中分离的SDF-0.3组分有效促进4株益生菌的生长,对大肠杆菌的生长无促进作用,通过分子质量和单糖组成分析后发现,SDF-0.3组分有大量中、小分子质量的混合糖,且主要含有半乳糖醛酸、半乳糖和葡萄糖,符合果胶类膳食纤维的特征。

糖醛酸含量决定果胶膳食纤维的益生元潜力阈值,含量越高,其益生活性也会越好。该种来源SDF中糖醛酸含量(16.90±0.42)%,分离得到的SDF-0.3组分中,半乳糖醛酸质量比33.88%,具有较好的益生活性。果胶类膳食纤维的主链由α-(1→4) 糖苷键连接的D-半乳糖醛酸构成,含有羧基基团(—COOH)使其被肠道菌群识别、与肠上皮细胞相互作用[19]。此外,膳食纤维的益生活性也与糖醛酸的甲基酯化度(DE)、主链分支度相关,低酯化度(DE<30%)的果胶,因羧基充分暴露,益生活性显著高于高酯化度果胶[19]。果胶的阴离子羧基可与拟杆菌门细菌表面的阳离子受体结合,激活其基因组中多糖利用位点的表达,靶向促进有益菌增殖,抑制有害菌生长[19]。果胶被肠道菌群降解后,主要代谢产物为乙酸、丙酸、丁酸,是连接菌群与宿主益生活性的核心信号分子,其产量与糖醛酸含量呈正相关[12]。短链脂肪酸通过激活GPR41/43信号通路,抑制促炎因子(TNF-α、IL-6)分泌,促进抗炎因子(IL-10)表达,同时调节肠道蠕动,改善便秘或腹泻症状[12,19,22]。该研究为荔浦芋膳食纤维促进机体健康和预防疾病提供科学依据,也为荔浦芋的开发提供了新思路。但是研究也存在一些局限性,缺乏对主要活性成分“体外-体内”的系统性研究;缺乏对分离组分的糖苷键、基团、甲基酯化度、结构域进行鉴定,仅进行了分子质量和单糖组成的检测;缺乏短链脂肪酸含量的检测。后续,希望能够对SDF的分离组分进行体外-体内研究,明确SDF的作用机制,并对SDF-0.3组分的结构进行鉴定,完善对荔浦芋膳食纤维的研究。

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