牛肉富含蛋白质、B族维生素、脂肪酸及多种微量元素(铁、锌、硒等),是全球第三大肉类消费品。肉色是消费者评判牛肉新鲜度与品质的关键感官指标,并最终主导其购买决策[1]。在美国,每年因色泽劣变导致的牛肉废弃量约达1.95亿kg,由此造成的经济损失高达约37.3亿美元[2]。相比于整肉,肉糜因组织结构破坏和氧气暴露增加,更易发生失色。
屠宰后,牛肉肉色主要由肌红蛋白的含量和氧化还原状态决定。在缺氧条件下,肉中的肌红蛋白主要以紫红色的脱氧肌红蛋白(deoxymyoglobin, DMb)形式存在。当暴露于氧气中时,DMb会发生氧合作用,生成鲜红色的氧合肌红蛋白(oxymyoglobin, OMb),这也是消费者青睐的肉色。DMb和OMb中的Fe2+易被氧化,生成棕色的高铁肌红蛋白(metmyoglobin, MMb)。研究表明,线粒体功能与肉色稳定性存在强相关性。肉中存在天然的MMb还原体系,能自发地将MMb还原成DMb,该还原过程依赖烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide, NADH)或线粒体电子传递链(electron transport chain, ETC)提供电子。ARIHARA等[3]报道位于线粒体和微粒体中的NADH-依赖型MMb还原酶系统,通过将NADH的电子传递到细胞色素b5,并最终传递给MMb,从而实现其还原作用。在宰后贮藏期间,ETC酶和MMb还原酶仍保持活性,而代谢底物和NADH的耗竭是导致线粒体功能衰减和MMb还原能力下降的主要原因[4-5]。通过向宰后肌肉中添加三羧酸(tricarboxylic acid,TCA)循环底物已被证实可以通过再生NADH来提高MMb还原能力,进而稳定肉色。WANG等[6]发现3%(质量分数)乳酸浸泡处理显著提高了牛肉的乳酸脱氢酶活性,促进乳酸转化成丙酮酸并生成NADH,从而改善肉色。MOHAN等[7]报道,2%(质量分数)的苹果酸在抑制牛腰大肌和牛腰最长肌MMb形成方面比乳酸和丙酮酸更有效。添加琥珀酸盐可以增强线粒体的氧气消耗,低氧分压有利于电子传递到细胞色素b5,并最终转移到MMb[8]。前人研究多在固定浓度下评估单一底物或比较不同底物对肉色的影响,未考虑不同代谢底物最佳作用浓度可能存在固有差异。
冻藏是肉与肉制品长期保存的常用技术,可通过抑制微生物活动有效延长产品货架期。然而,该过程形成的冰晶会对肉品产生机械损伤,导致肌红蛋白的珠蛋白结构变性,并破坏MMb氧化还原系统。这种结构性损伤还会促使关键成分(如NADH与MMb还原酶)流失,最终造成冻藏肉品色泽劣化。当前,TCA循环底物在冷鲜肉体系中改善肉色的研究已有报道,但在冻藏肉品中的作用效果尚不明确。
柠檬酸钠、苹果酸钠、琥珀酸二钠均属于GB 2760—2024《食品安全国家标准 食品添加剂使用标准》范畴。其中,柠檬酸钠和苹果酸钠常被用做酸度调节剂。琥珀酸二钠是水产品和蘑菇中重要的鲜味物质,被用作增味剂[9]。此外,丙酮酸钠也被用于冷鲜肉肉色调控的研究[7, 10-11]。因此,本研究首先筛选出4种TCA循环底物(丙酮酸钠、柠檬酸钠、苹果酸钠、琥珀酸二钠)在冻融体系中的最佳护色添加量;进而,以反复冻融模拟长期冻藏[12],测定各底物在各自最佳浓度下对牛肉饼色泽参数(L*、a*、b*、C*、H*和R630/R580)、肌红蛋白组成、高铁肌红蛋白还原能力(metmyoglobin reducing activity, MRA)、氧气消耗率(oxygen consumption rate, OCR)、NADH含量、琥珀酸脱氢酶(succinate dehydrogenase, SDH)活性、pH和硫代巴比妥酸反应物(thiobarbituric acid reactive substances,TBARS)值的长期影响,以期为冻藏肉制品护色技术的开发提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
牛背最长肌,江苏无锡天鹏肉类批发交易市场。
丙酮酸钠、柠檬酸钠、琥珀酸二钠、苹果酸钠,上海源叶生物科技有限公司;三氯乙酸、NaNO2,上海泰坦科技股份有限公司;2-硫代巴比妥酸,东京化成工业株式会社。所有试剂均为分析纯。NAD+/NADH含量试剂盒、琥珀酸脱氢酶活性试剂盒,上海碧云天生物技术股份有限公司。
1.2 仪器与设备
XZW-22A绞肉机,广州旭众食品机械有限公司;HF-100肉饼成型机,安徽华菱西厨装备股份有限公司;C200热成型真空包装机,德国莫维迪克公司;UltraScan PRO分光测色仪,美国HunterLab公司;SpectraMAX 190全波长光吸收酶标仪,美国Molecular Devices公司;T18高速分散机,德国IKA公司;Testo205便携式pH计,梅特勒-托利多公司;5910R台式冷冻离心机,德国Eppendorf公司;SCIENTZ-48高通量组织研磨器,宁波新芝生物科技有限公司。
1.3 实验方法
1.3.1 牛肉样品的处理
浓度筛选实验:选取4头健康、饲养条件一致、18月龄的西门塔尔牛(n=4)作为生物重复。屠宰遵循GB/T 19477—2018 《畜禽屠宰操作规程 牛》在江苏无锡周庄屠宰中心进行。宰后胴体于0～4 ℃,相对湿度85%～95%,风速0.5 m/s的条件下冷却成熟48 h。随后低温冷链运输至交易市场,立即取右半胴体背最长肌,于0～4 ℃下30 min内运送至实验室。剔除可见的脂肪和结缔组织后,将肌肉切成2 cm3的肉块,并使用绞肉机(6 mm孔径)绞碎。对每头牛制备的独立肉糜样本,均设置21个处理组:1个空白对照组(添加等量的蒸馏水),以及4种底物(丙酮酸钠、柠檬酸钠、琥珀酸二钠、苹果酸钠)在5个添加量(1%、2%、3%、4%、5%,以肉质量计,下同)下的处理组。所有底物均用等量蒸馏水(10%,以肉质量计)溶解并与肉糜充分混匀,后制成直径10 cm、厚度1 cm的肉饼,每个肉饼质量约80 g。每头牛每个处理组制备3块肉饼。样品采用聚乙烯/聚偏二氯乙烯袋[56 μm厚,透氧率20 cm3/ (m2·bar·24 h),水蒸汽透过率5 g/m2/24 h]真空包装。样品置于-20 ℃冷冻48 h,随后4 ℃解冻24 h,定义为一个冻融循环。经3次循环后,测定肉色参数及肌红蛋白组成,筛选各底物的最佳浓度,用于后续长期冻融实验。
长期效果验证实验:基于筛选结果,选取新一批西门塔尔牛4头,采用相同的肉糜制备、肉饼成型及包装程序。对每头牛制备的独立肉糜样本,均分为5个组:空白对照组、2%丙酮酸钠组、2%柠檬酸钠组、2%琥珀酸二钠组和3%苹果酸钠组。每头牛每个处理组制备12块肉饼,用于不同时间点的测定:分别在冻融循环1、3、5、7次后随机各选取3块肉饼进行指标测定。
1.3.2 色差的测定
参照KING等[13]的方法,将冻融循环后的肉饼置于4 ℃发色30 min后,用分光测色仪(孔径25 mm,光源D65,视角10°)测量其L*、a*、b*值。仪器在使用前经标准黑、白板校正。每块肉饼随机选取3个位置测量。根据公式(1)和(2)计算饱和度C*和色调角H*。使用分光光度计以10 nm为间隔记录470～730 nm的反射率。将630 nm与580 nm的反射率比值(R630/R580)作为评价肉色稳定性的指标。
(1)
(2)
1.3.3 肌红蛋白组成的测定
参照KRZYWICKI[14]的方法,使用1.3.2节中的分光测色仪,以10 nm的间隔,测量牛肉饼从470 nm到730 nm的反射率。使用线性内插法计算473、525、572 nm处的反射率。通过公式(3)将反射率转换成反射衰减A值,并通过公式(4)～公式(6)计算3种肌红蛋白的相对百分比。
(3)
(4)
(5)
OMb/%=100-MMb-DMb
(6)
1.3.4 MRA的测定
参照SAMMEL等[15]的方法,将样品浸泡在质量分数0.3%的NaNO2溶液中20 min,取出擦干表面溶液后立即采用1.3.3节的方法测定样品中的MMb含量。将样品真空包装,30 ℃孵育2 h后,测得此时的MMb含量。通过公式(7)计算MRA。
(7)
1.3.5 OCR的测定
参照RAMANATHAN等[16]的方法,将样品置于4 ℃发色30 min后,采用1.3.3节的方法测定样品中的OMb含量。将样品真空包装,30 ℃孵育30 min后,测得此时的OMb含量。通过公式(8)计算OCR。
(8)
1.3.6 NADH含量和SDH活性的测定
采用碧云天试剂盒对样品中的NADH含量和SDH活性进行测定。
1.3.7 pH值的测定
采用便携式pH计,每个样品随机选择3个位置测量pH值。
1.3.8 TBARS值的测定
参照WITTE等[17]的方法,取1 g牛肉糜加入5 mL 10%(质量分数)的三氯乙酸溶液中,用高速分散机以9 000 r/min匀浆1 min。将匀浆液在4 ℃、8 000×g下离心10 min。取2 mL上清液与等体积的20 mmol/L硫代巴比妥酸溶液混合,95 ℃孵育20 min。取出用冰水浴冷却,使用全波长光吸收酶标仪在532 nm处测量吸光度,并代入1, 1, 3, 3-四乙氧基丙烷标准曲线进行定量,结果表示为mg MDA/kg肉样。
1.4 数据处理
数据均用“平均值±标准偏差”表示。采用SPSS 20.0进行数据分析。Tukey HSD多重比较用于分析显著性差异(P<0.05)。Origin 9.0用于作图。
2 结果与分析
2.1 四种TCA循环底物最佳作用浓度的筛选
前期筛选4种底物最佳添加量的结果表明(见电子版增强出版附表,https://doi.org/10.13995/j.cnki.11-1802/ts.045740),丙酮酸钠、柠檬酸钠和琥珀酸二钠在添加量为2%时效果最佳,a*值分别由对照组的22.11提升至27.63、29.73和29.39;苹果酸钠则在3%质量分数下改善效果最为明显,a*值升高至24.12(P<0.05)。DENZER等[18]观察到牛排在零售展示期间琥珀酸含量逐渐下降,其减少与红度下降高度同步,说明内源性底物耗竭与褪色有关。添加适量TCA循环底物可以提高TCA循环代谢,进而维持稳定的还原环境[19]。肌红蛋白组成结果与色差变化趋势一致。添加2%丙酮酸钠、柠檬酸钠和琥珀酸二钠显著降低MMb含量,并提高OMb含量(P<0.05)。3%苹果酸钠对OMb含量的提升作用有限。然而,随着添加量的增加,肉色逐渐劣化。这是因为,过量底物释放的电子在传递过程中可能渗漏,与氧分子结合生成超氧阴离子自由基,从而氧化DMb和OMb。其次,过量底物会过度激活线粒体呼吸作用,导致其与肌红蛋白竞争消耗氧气,促使肉中OMb含量下降,从而加速肉色劣变[20]。基于以上结果,本研究选取2%丙酮酸钠(P2)、柠檬酸钠(C2)和琥珀酸二钠(S2)和3%苹果酸钠(M3)用于后续长期冻融循环实验,以进一步验证其色泽稳定效果。
2.2 四种TCA循环底物在反复冻融条件下对牛肉饼色泽稳定性的影响
2.2.1 不同TCA循环底物对冻融循环牛肉饼色泽参数的影响
由表1可知,较冻融1次时,冻融7次后,各组的L*值显著降低(P<0.05)。冻融循环促使冰晶反复形成与生长,破坏细胞结构,迫使细胞内水分向细胞外间隙迁移。这一过程使得细胞内溶质浓度升高,从而增强了光吸收,最终表现为L*值的降低[21]。在所有冻融循环节点上,底物的添加显著降低L*值(P<0.05)。RUEDT等[22]提出,盐类的添加可诱导肌丝晶格膨胀并减小肌原纤维间空隙,从而降低光散射,并导致L*值下降。a*值是评价肉品新鲜度与色泽品质的关键指标。随着冻融次数的增加,各组的a*值显著降低(P<0.05)。7次冻融后,CK组a*值从16.38降至10.48(36%),这是肌红蛋白氧化的结果。一方面,反复冻融诱导的冰晶再生会不断破坏肌肉细胞结构,致使细胞内氧化酶溶出并氧化肌红蛋白[23];另一方面,冰晶造成的机械损伤会导致肌红蛋白的珠蛋白结构变性,增加其氧化敏感性[24]。C2和S2组的a*值在1～7次冻融间均显著高于CK组(P<0.05),且除冻融3次外,S2组的a*值均为5组中最高。添加丙酮酸钠对a*值的提升效果持续至冻融5次,而添加苹果酸钠的效果仅维持至冻融3次。各组的b*值随冻融次数的增加而显著降低(P<0.05),这是由于反复冻融破坏了细胞膜结构,进而导致可溶性色素随汁液流失。C*和H*值分别表示肉品的色彩饱和度和色调角,C*值越大,H*值越小时,肉色越红。随着冻融次数的增加,各组的C*值呈现下降趋势,H*值呈现上升趋势,表明肉色逐渐劣变。7次冻融后,CK组C*值从19.44降至12.65,H*值从32.60升高至34.07。在冻融1～7次期间,C2、S2组的C*值均显著高于CK组(P<0.05)。添加丙酮酸钠对C*值的提升效果持续至冻融5次,添加苹果酸钠的效果仅维持至冻融3次。在冻融1～3次期间,所有处理组的H*值均显著低于CK组(P<0.05)。这一差异在冻融5次后趋于不显著。R630/R580可以用来表征肉色稳定性,该比值越大,肉中OMb和DMb含量越高,肉色越红[13]。随着冻融次数的增加,各组的R630/R580比值显著降低(P<0.05)。在冻融1～7次期间,S2组始终保持最高的R630/R580比值,并且显著高于CK组(P<0.05)。C2组仅在冻融1～3次内展现出显著高于CK组的R630/R580比值(P<0.05)。其他2组对于R630/R580比值的改善效果不显著。综上,琥珀酸二钠对牛肉饼的a*、C*和R630/R580值具有长期维持作用。
表1 不同TCA循环底物对冻融循环牛肉饼色泽参数的影响
Table 1 Effects of different Krebs cycle substrates on color parameters of beef patties during freeze-thaw cycles
指标组别冻融1次冻融3次冻融5次冻融7次L∗CK40.46±0.10Aa40.67±0.24Aa40.03±1.60Aab38.75±1.18AbP238.20±0.65Ca38.30±0.49Ba36.64±0.35Bb36.68±0.40BbC239.17±0.24Ba38.49±0.19Ba36.71±0.68Bb36.24±0.34BbS239.74±0.13Ba37.47±0.15Cb36.65±0.36Bc36.84±0.49BbcM338.44±0.18Ca37.44±0.39Cb36.32±0.33Bc35.98±0.38Bca∗CK16.38±0.29Da13.35±0.87Cb11.33±0.38Bc10.48±0.39CcP218.16±0.23Ca17.04±0.07Bb14.55±1.52Ac11.75±0.39BCdC219.15±0.09Ba19.02±0.75Aa14.23±0.19Ab12.38±1.07BcS222.02±0.17Aa18.75±0.24Ab15.86±0.85Ac14.17±1.15AcM319.63±0.37Ba17.43±0.40Bb12.58±0.49Bc11.91±0.53BCcb∗CK10.48±0.39Ca8.65±0.70Cb7.53±0.29Cc7.09±0.43CcP210.94±0.21Ca10.34±0.03Ba9.98±0.08Ab7.46±0.42BCcC211.57±0.17Ba11.56±0.52Aa8.80±0.42Bb8.05±0.37BbS213.40±0.26Aa11.25±0.22Ab9.80±0.78Ac9.97±0.51AcM311.60±0.21Ba10.18±0.18Bb8.11±0.53BCc7.53±0.49BCcC∗CK19.44±0.46Da15.91±1.10Cb13.60±0.47Bc12.65±0.56CcP221.20±0.30Ca19.93±0.07Bb18.46±0.83Ac13.92±0.55BCdC222.37±0.17Ba22.26±0.86Aa16.73±0.35Ab14.77±1.09BcS225.78±0.28Aa21.86±0.26Ab17.54±1.68Ac17.34±1.05AcM322.80±0.42Ba20.19±0.36Bb14.98±0.11Bc14.09±0.71BCcH∗CK32.60±0.51Ab32.92±0.61Aab33.59±0.37ABab34.07±0.73ABaP231.06±0.24BCb31.24±0.12Bb32.21±0.49ABa32.41±0.64BaC231.14±0.26BCb31.30±0.83Bb31.72±0.05Bb33.11±0.60ABaS231.32±0.30Bb30.96±0.50Bb34.00±1.08Aa35.17±2.28AaM330.58±0.02Cb30.30±0.68Bb32.84±2.72ABa32.29±0.56BaR630/R580CK3.89±0.10Ca3.64±0.11Cb3.03±0.07Bc2.48±0.18BCdP23.97±0.08Ca3.60±0.04Cb3.00±0.01Bc2.34±0.06CdC24.35±0.12Ba4.29±0.07Aa3.03±0.06Bb2.75±0.06ABcS25.13±0.09Aa4.30±0.16Ab3.16±0.05Ac2.82±0.27AdM33.99±0.03Ca4.08±0.01Ba2.62±0.09Cb2.61±0.07ABCb
注：不同大写字母表示不同组别在相同冻融循环次数时存在显著差异(P<0.05);不同小写字母表示同一组别在不同冻融循环次数时存在显著差异(P<0.05);表2～表4同。
2.2.2 不同TCA循环底物对冻融循环牛肉饼肌红蛋白组成的影响
由表2可知,随着冻融次数的增加,各组牛肉饼中的OMb含量显著下降,而MMb含量显著上升(P<0.05)。这也与2.2.1节中观察到的a*值的下降趋势相符。以CK组为例,其OMb含量从64.59下降至61.35,MMb含量从28.03上升至33.08。S2组在维持肉色稳定性方面表现出持久的最佳效果。具体表现为:在整个冻融周期内,S2组的OMb含量均显著高于CK组,MMb含量均显著低于CK组(P<0.05)。TANG等[4]提出琥珀酸二钠可以作为底物,进入线粒体电子传递链。电子从琥珀酸经复合体Ⅱ→泛醌→复合体Ⅲ→细胞色素c→线粒体外膜细胞色素b5,最终传递给MMb并将其还原。此外,琥珀酸二钠代谢过程会快速消耗氧气,从而建立利于MMb还原的厌氧条件[25]。C2和M3组也显著抑制了MMb的积累,在冻融1～7次期间,均展现出显著低于CK组的MMb含量,但C2组OMb含量仅在冻融循环前期显著高于CK组(P<0.05),而M3组对于OMb含量的提升效果不明显。与此相同,BJELANOVIC等[26]发现添加柠檬酸钠能显著提高并维持高氧包装牛肉糜中的OMb比例。MOHAN等[27]的研究表明,苹果酸钠通过苹果酸-天冬氨酸穿梭进入线粒体,在内部被氧化成草酰乙酸并再生NADH。新生成的NADH通过电子传递链等途径还原MMb。丙酮酸钠未表现出明显效果。值得注意的是,添加柠檬酸钠、琥珀酸二钠和苹果酸钠显著提高了冻融期间的牛肉饼中的DMb含量(P<0.05)。这可能是由于,TCA底物的添加提高了线粒体的代谢活性,刺激其呼吸作用,进而降低了氧分压,促使DMb的形成。
表2 不同TCA循环底物对冻融循环牛肉饼肌红蛋白相对百分含量的影响 单位:%
Table 2 Effects of different Krebs cycle substrates on the relative proportions of DMb, OMb and MMb of beef patties during freeze-thaw cycles
肌红蛋白组别冻融1次冻融3次冻融5次冻融7次DMbCK7.38±0.34Ca6.20±0.34Cb5.16±0.15Db5.57±1.05BbP26.83±0.65Ca6.62±0.25Ca5.28±0.26Db4.89±0.33BbC28.95±0.32Aa8.78±0.23Ba8.12±0.17Bb8.66±0.45AabS29.40±0.27Aa9.61±0.26Aa9.70±0.43Aa9.32±0.14AaM38.05±0.31Ba8.82±0.45Ba6.50±0.44Cb8.24±0.86AaOMbCK64.59±0.14Ca63.03±1.36Bb62.26±0.05Bbc61.35±0.12BcP265.78±0.54Ba63.70±0.33Bb63.06±0.01Ab61.25±0.32BcC267.84±0.36Aa65.43±0.40Ab62.29±0.24Bc60.86±0.48BCdS266.37±0.15Ba65.23±0.61Ab63.29±0.20Abc62.65±0.52AcM364.75±0.11Ca62.57±0.46Bb61.87±0.41Bc60.37±0.18CdMMbCK28.03±0.20Ac30.77±1.04Ab32.58±0.07Aa 33.08±1.15AaP227.39±0.52Bd29.68±0.18ABc31.66±0.08Bb33.86±0.46AaC223.21±0.29Dd25.78±0.18Cc29.59±0.77Cb30.49±0.20BaS224.23±0.25Cc25.16±0.69Cc27.01±0.61Db28.03±0.21CaM327.20±0.24Bc28.61±0.31Bb31.63±0.03Ba31.39±1.04Ba
2.2.3 不同TCA循环底物对冻融循环牛肉饼MRA的影响
MRA表征肉品自身将高铁肌红蛋白还原成氧合或脱氧状态的能力,是评价肉色稳定性的关键指标。如图1所示,随着冻融次数的增加,各组的MRA显著降低(P<0.05)。这可能是因为,冰晶的形成与生长会不断破坏线粒体和肌肉细胞的结构完整性,不仅导致为MMb还原提供电子的ETC功能受损,也造成关键还原酶和还原当量随汁液流失,从而削弱了肌肉自身的还原潜力[28]。冻融循环7次后,CK组的MRA降幅最大(83%),从32.84%降低至5.49%。其他处理组(P2、C2、S2和M3)分别降低了68%、41%、35%和43%。在所有冻融循环节点上,C2和S2组的MRA均显著高于CK组(P<0.05)。在冻融循环5～7次期间,M3组的MRA显著高于CK组(P<0.05)。然而,丙酮酸钠的添加则呈现出相反效果,其MRA显著低于CK组(P<0.05)。这可能是因为,肉中的乳酸脱氢酶催化丙酮酸生成乳酸,这一过程会消耗NADH,而NADH是维持肌红蛋白还原系统和ETC功能的关键物质[10]。
图1 不同TCA循环底物对冻融循环牛肉饼MRA的影响
Fig.1 Effects of different Krebs cycle substrates on the MRA of beef patties during freeze-thaw cycles
注:不同大写字母表示不同组别在相同冻融循环次数时存在显著差异(P<0.05);不同小写字母表示同一组别在不同冻融循环次数时 存在显著差异(P<0.05);图2～图4同。
2.2.4 不同TCA循环底物对冻融循环牛肉饼OCR的影响
OCR用于表征肉品中线粒体消耗氧气的速度。如图2所示,随着冻融次数的增加,各组的OCR显著降低(P<0.05)。这可能是代谢底物逐渐缺失和线粒体功能损伤导致的结果。冻融7次后,CK和P2组OCR降幅最大,分别降低了75%和74%,而其他各组(C2、S2和M3)降幅较小,分别降低了24%、23%和25%。添加柠檬酸钠、琥珀酸二钠和苹果酸钠显著提高了冻融循环期间肉品的OCR(P<0.05)。以冻融循环3次为例,CK组OCR为7.63%,而C2、S2和M3组分别为34.49%、39.27%和30.75%。此外,S2组在每个冻融循环节点上均保持最高的OCR。ETC上的复合体Ⅰ极易受损或出现功能障碍,琥珀酸二钠可以绕过该易损节点,直接作为复合体Ⅱ的底物进入ETC,从而维持线粒体ATP合成能力及膜电位稳定[29]。添加丙酮酸钠对于OCR无明显改善效果。
图2 不同TCA循环底物对冻融循环牛肉饼OCR的影响
Fig.2 Effects of different Krebs cycle substrates on the OCR of beef patties during freeze-thaw cycles
2.2.5 不同TCA循环底物对冻融循环牛肉饼NADH含量的影响
NADH是MMb还原过程中的辅酶和氢供体,对肉色稳定性有显著影响。由图3可知,随着冻融次数的增加,各组的NADH含量呈下降趋势。MITACEK等[30]也发现,随着熟成时间的延长,牛背最长肌中的NADH含量显著降低,这是线粒体退化、代谢底物耗竭和氧化应激增加的结果。添加柠檬酸钠、琥珀酸二钠和苹果酸钠显著提高了NADH含量,而添加丙酮酸钠显著降低了NADH含量(P<0.05)。这也与上述观察到的MRA、OCR变化趋势相符。乳酸脱氢酶能催化乳酸生成丙酮酸,而过量丙酮酸会驱动该反应逆向进行,并伴随NADH的氧化消耗。
图3 不同TCA循环底物对冻融循环牛肉饼中NADH含量的影响
Fig.3 Effects of different Krebs cycle substrates on the NADH content of beef patties during freeze-thaw cycles
2.2.6 不同TCA循环底物对冻融循环牛肉饼SDH活性的影响
SDH位于线粒体内膜,并作为连接TCA循环与呼吸链的关键酶,其活性常被用来评估线粒体功能和循环运行状态[31]。由图4可知,随着冻融次数的增加,各组的SDH活性逐渐降低。冻融7次后,各组的SDH活性分别降低了64%、46%、54%、70%和67%。除冻融1次外,添加琥珀酸二钠显著提高了SDH活性(P<0.05)。这可能是因为在冻融初期,肌肉细胞内源性代谢池及线粒体结构仍相对完整,SDH活性尚未成为限速环节。随着冻融次数增加,冰晶损伤累积导致细胞内容物(包括代谢中间产物)大量流失,线粒体功能衰退,内源琥珀酸耗竭致使SDH活性降低。此时,外源补充的琥珀酸二钠作为SDH的直接底物,有效弥补了内源性底物的不足,从而提升了SDH活性。冻融3～5次期间,添加柠檬酸钠显著提高了SDH活性(P<0.05)。其机制可能在于:柠檬酸作为TCA循环的起始与关键中间代谢物,可补充因冻融或宰后代谢耗竭而减少的循环中间代谢池。在顺乌头酸酶催化下,柠檬酸转化为异柠檬酸,进而经α-酮戊二酸、琥珀酰辅酶A等步骤,最终提高琥珀酸(SDH的直接底物)的浓度,从而增强SDH活性。相比之下,冻融1～5次间,添加丙酮酸钠使得SDH活性大幅下降,而苹果酸钠对于SDH活性的影响不显著。
图4 不同TCA循环底物对冻融循环牛肉饼中SDH活性的影响
Fig.4 Effects of different Krebs cycle substrates on the SDH activity of beef patties during freeze-thaw cycles
2.2.7 不同TCA循环底物对冻融循环牛肉饼pH的影响
pH决定肉色稳定性,较低的pH会显著抑制线粒体功能(降低线粒体复合体Ⅲ和Ⅳ的氧气消耗速率),导致MRA降低。由表3可知,随着冻融次数的增加,各组牛肉的pH显著降低(P<0.05)。以CK组为例,经过7次冻融后,pH值从5.69降至5.50。这也与CHENG等[32]观察到的现象一致。反复冻融破坏细胞结构,致使汁液大量渗出,这导致肉中溶质浓度上升,从而pH降低。此外,反复冻融会导致蛋白质变性、聚集与降解,这一过程会使原先掩埋在蛋白质三维结构内部的酸性氨基酸侧链以及结合态的氢离子暴露出来,导致pH的下降。添加TCA循环底物提高冻融循环期间牛肉的pH。这是因为这些底物本身是弱有机酸钠盐,溶于肉汁后释放Na+和有机酸根阴离子。此外,它们作为底物在被代谢的过程中会消耗质子、减少乳酸等酸性产物堆积,从而推高体系pH[33]。其中,柠檬酸钠的效果最明显,C2组的pH在每个冻融循环节点上都是5组中最高。丙酮酸钠和琥珀酸二钠的效果次之。
表3 不同TCA循环底物对冻融循环牛肉饼pH的影响
Table 3 Effects of different Krebs cycle substrates on the pH of beef patties during freeze-thaw cycles
组别冻融1次冻融3次冻融5次冻融7次CK5.69±0.04Ca5.68±0.03Ea5.57±0.02Eb5.50±0.02DcP25.89±0.00Ba5.88±0.01Ba5.80±0.02Bb5.74±0.03ABcC25.98±0.04Aa5.94±0.03Aa5.85±0.04Ab5.79±0.03AbS25.86±0.03Ba5.83±0.01Ca5.74±0.01Cb5.70±0.05BbM35.74±0.03Ca5.73±0.02Da5.65±0.02Db5.62±0.02Cb
2.2.8 不同TCA循环底物对冻融循环牛肉饼TBARS值的影响
如表4所示,随着冻融次数的增加,各组牛肉饼的TBARS值显著上升(P<0.05),其中M3组的涨幅最大(80%),从0.41 mg MDA/kg上升至0.74 mg MDA/kg;C2组的涨幅最小(37%),从0.38 mg MDA/kg上升至0.52 mg MDA/kg。反复冻融会引发冰晶形成与生长,导致细胞破裂并释放氧化酶、血红蛋白铁及自由基等氧化剂,从而加速脂质氧化过程。
表4 不同TCA循环底物对冻融循环牛肉饼TBARS值的影响
Table 4 Effects of different Krebs cycle substrates on the TBARS values of beef patties during freeze-thaw cycles
组别冻融次数TBARS/(mg MDA/kg)CK10.41±0.00ABc30.46±0.01Ac50.58±0.03Ab70.71±0.04AaP210.34±0.00Cc30.41±0.02Bb50.44±0.03Bab70.47±0.03BaC210.38±0.02Bb30.42±0.01Bb50.49±0.04Ba70.52±0.04BaS210.42±0.00Ad30.47±0.01Ac50.58±0.04Ab70.72±0.02AaM310.41±0.03ABc30.45±0.01Ac50.58±0.04Ab70.74±0.04Aa
脂质氧化与肌红蛋白氧化是相互促进的过程。脂质氧化的副产物,特别是α,β-不饱和醛,如4-羟基壬烯醛,会与血红蛋白中的组氨酸残基共价结合,导致血红素口袋结构失稳,从而促进其氧化[34]。反之,肌红蛋白的氧化会释放血红素铁等活性物质,进一步加剧脂质氧化。添加丙酮酸钠显著降低了反复冻融期间牛肉饼的TBARS值(P<0.05)。丙酮酸钠已被报道为强抗氧化剂,它分子中的酮-烯醇结构可通过抑制超氧化物生成酶,直接清除活性氧[35]。鉴于其对MRA、OCR并无明显提升作用,丙酮酸钠对肉色有一定改善作用可能是依赖于其抑制脂肪氧化的能力。除冻融1次外,柠檬酸钠的添加也显著抑制了脂肪氧化(P<0.05)。ZHANG等[36]也发现柠檬酸钠可以显著降低冷藏真空包装牛排在长期储存过程中的脂肪氧化,这可能是因为,柠檬酸盐可螯合铁等过渡金属,减少Fenton反应介导的脂质过氧化链式反应。琥珀酸二钠和苹果酸钠无明显抑制脂肪氧化的效果。
3 结论
本研究系统比较了4种TCA循环底物对反复冻融牛肉饼色泽稳定性的影响。浓度筛选实验表明,丙酮酸钠、柠檬酸钠和琥珀酸二钠的最佳添加量为2%,苹果酸钠为3%。长期冻融实验结果表明,2%琥珀酸二钠的护色效果最优,能显著维持较高的a*、C*、R630/R580值与氧合肌红蛋白含量(P<0.05),其主要通过提高NADH含量与SDH活性,从而增强肌红蛋白还原系统的功能。2%柠檬酸钠次之,具有一定护色与抑制脂质氧化作用;3%苹果酸钠效果有限;而2%丙酮酸钠虽可抑制脂肪氧化,但会消耗NADH、抑制关键酶活性,不利于肌红蛋白还原。综上,琥珀酸二钠在冻融体系中展现出良好的色泽稳定潜力,为开发冻藏肉制品的护色技术提供了理论与应用依据。未来研究可在以下方向深入:系统评估该底物对肉品综合食用品质的影响,如风味、质构及整体可接受度;探索该底物与其他护色成分的复配,以进一步降低其使用浓度,规避潜在的风味风险;验证其在不同贮藏、运输条件下护色效果的稳定性,以推动其产业化应用。
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