葡萄(Vitis vinifera L.)以其细腻的果肉质地、独特的风味和丰富的营养成分深受消费者青睐[1-2]。然而,葡萄采后伴随着复杂的生理代谢失衡,且贮藏中会出现软化、落粒、腐烂和果梗褐变等现象;导致葡萄果实品质劣变,严重影响葡萄果实的贮藏品质和商品价值[3-4]。SO2因兼具抑菌、防腐和抗褐变等作用,长期以来被广泛应用于葡萄采后商业化保鲜处理中[5]。适宜浓度的SO2处理可有效抑制病原微生物繁殖、降低果实腐烂,并延缓硬度和风味物质的下降,延长果实货架期[6-8]。SO2可通过上调苯丙氨酸解氨酶活性,增强‘玫瑰香’和‘木纳格’葡萄的抗性[9-10],调节H2O2稳态,以减轻葡萄采后的氧化损伤程度[11]。但现有研究多集中于SO2的技术应用或果实抗性的研究,对其是否通过调控活性氧(reactive oxygen species,ROS)代谢系统,尤其是NADPH氧化酶(NADPH oxidase,NOX)/超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)系统与抗坏血酸-谷胱甘肽(ascorbate-glutathione,AsA-GSH)循环的协同作用延缓果实衰老,仍缺乏系统性研究。此外,不同葡萄品种对SO2响应的差异性以及ROS稳态调控机制尚未完全明确,这在一定程度上制约了SO2保鲜技术的精准应用与理论指导。
果实采后生理过程中,ROS作为信号分子,具有双重作用。适量ROS的积累可参与信号转导,调控防御反应和次生代谢;过量ROS则会诱导膜脂过氧化,破坏细胞结构,导致组织快速衰老[12]。ROS稳态的维持依赖于其生成与清除系统之间的动态平衡。其中,NOX是ROS产生的主要来源之一,其通过催化超氧阴离子(·O2-)的生成,在果实逆境反应中发挥重要作用[13]。而SOD则将其转化为H2O2,由过氧化氢酶(catalase,CAT)、抗坏血酸过氧化物酶(ascorbate peroxidase,APX)等进一步分解,降低其潜在毒性[14]。AsA-GSH循环通过AsA、GSH及相关酶的协同作用,形成了清除H2O2和维持氧化还原稳态的核心防御体。已有研究表明,不同采后处理可通过调控NOX/SOD系统和AsA-GSH循环来改善果实的采后品质。臭氧处理可显著诱导SOD与CAT活性提升,增强自由基清除效率并抑制氧化损伤,保持鲜切红火龙果品质的稳定[15];香芹酚处理则通过强化AsA-GSH循环并协同激活苯丙烷代谢,有效缓解桃果实的氧化胁迫,维持细胞氧化还原稳态并延长贮藏寿命[16]。现有SO2研究主要集中在应用技术及产品研发层面,其在鲜食葡萄保鲜中所发挥的生物学作用研究较少。前期研究发现,SO2能通过激活硫代谢激活抗氧化系统[17]。因此,探究SO2在调节ROS生成与清除过程中的作用机制,尤其是对NOX/SOD系统和AsA-GSH循环的调控,对于揭示其延缓葡萄采后衰老的生物学效应具有重要意义。
本研究以‘克瑞森’葡萄为试材,采用SO2熏蒸处理,分析果实采后品质、ROS水平、NOX/SOD系统及AsA-GSH循环相关代谢物、酶活性与基因表达的变化,旨在阐明SO2调控ROS稳态的作用,为SO2在葡萄采后保鲜中的科学应用提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
‘克瑞森’无核葡萄(Vitis vinifera L.cv.Crimson Seedless),产自新疆维吾尔自治区双河市八十六团二十一连。在果实达到商业成熟度[可溶性固形物(total soluble solids,TSS)含量≥20%]时进行采收,选取果穗整齐、果粒大小均匀、果梗新鲜、无机械损伤及病虫害的葡萄样品。所有样品在采后运回实验室,随后进行统一处理。
SO2标准气体(纯度≥99.5%),乌鲁木齐鑫天意标准气体有限公司;丙二醛(malondialdehyde,MDA)、三氯乙酸、硫代巴比妥酸、氮蓝四唑、核黄素、甲硫氨酸、KI、磺基水杨酸、2-乙烯基吡啶、三乙醇胺、5,5′-二硫代双-(2-硝基苯甲酸),天津市江天化工技术股份有限公司。
·O2-含量检测试剂盒、NOX活性检测试剂盒、APX活性检测试剂盒、DHAR活性检测试剂盒、MDHAR活性检测试剂盒、GPX活性检测试剂盒、GR活性检测试剂盒、ASA含量检测试剂盒、DHA含量检测试剂盒、GSH含量检测试剂盒、GSSG含量检测试剂盒,北京盒子生工科技有限公司;HiPure HP plant RNA Mini Kit难提植物总RNA小提试剂盒,美基生物科技有限公司;FastKing cDNA第一链合成试剂盒、2×Taq PCR MasterMix Ⅱ试剂盒、FastReal qPCR PreMix试剂盒,天根生化科技(北京)有限公司。
1.2 仪器与设备
JYLX2型熏蒸设备,课题组自主设计;GY-4果实硬度计,乐清市艾德堡仪器有限公司;PAL-1数显糖度计,日本Atago公司;MT-V6全自动电位滴定仪,上海禾工科学仪器有限公司;D3024R台式高速冷冻型微量离心机,美国SCILOGEX公司;UV2100型紫外可见分光光度计,上海普析通公司;Hybrid Technology酶标仪,美国伯腾仪器有限公司;LightCycler® 96实时荧光定量聚合酶链式反应,瑞士罗氏公司;CB4 1QB凝胶图像分析系统,英国UVItec公司;TProfessional PCR梯度式热循环仪,德国耶拿分析仪器公司。
1.3 实验方法
1.3.1 原料处理
选取240串葡萄,随机分为2组,置于熏蒸箱(600 mm×800 mm×1 000 mm)中。根据预实验结果,采用500 μL/L SO2熏蒸2 h,以相同条件下通入空气为对照。熏蒸结束后,每8串葡萄置于同一框中,并用0.30 mm聚乙烯薄膜密封包装。每组共120串,设置3个平行,共计15框。将葡萄置于(22±2) ℃,相对湿度(40±5)%的条件下贮藏。定期测定品质指标,并进行取样。
1.3.2 品质指标的测定
硬度、TSS含量、落粒率、腐烂率、失重率参照ZHANG等[17]的方法进行测定。使用3.0 mm直径的硬度计测定果实硬度,单位:N。使用数显糖度计测定果实TSS,单位:%。落粒率、腐烂率、失重率分别根据公式(1)～公式(3)进行计算:
落粒率
(1)
腐烂率
(2)
失重率
(3)
可滴定酸(titratable acidity,TA)含量根据王曼等[18]的方法略加修改,用全自动电位滴定仪进行测定,以苹果酸折算系数0.067进行计算,单位:%。
1.3.3 ·O2-、H2O2和MDA含量的测定
·O2-含量使用·O2-含量测定试剂盒进行测定,单位:μmol/g。
H2O2含量测定参考XU等[19]的方法并略加修改。称取约3 g葡萄冷冻样品,加入6 mL预冷的10 g/L三氯乙酸溶液,在冰浴条件下进行组织匀浆。匀浆液于4 ℃,12 000×g离心20 min。吸取1 mL上清液,与1 mL 10 mmol/L磷酸钾缓冲液及2 mL 1 mol/L KI溶液混合,充分涡旋振荡。反应液在390 nm波长处测定该混合液的吸光度值,并依据标准校准曲线计算H2O2含量,单位:μmol/g。
MDA含量的测定参照ZHANG等[11]的方法并略加修改。称取约1 g葡萄冻样品,置于5 mL 50 g/L三氯乙酸溶液中,充分混匀。混合物于4 ℃、10 000×g离心15 min,吸取2 mL上清液,加入2 mL 6.7 g/L硫代巴比妥酸溶液,混匀后置于沸水浴中加热20 min,待溶液冷却后重复离心1次,测定上清液在450、532、600 nm波长处的吸光度值,单位:nmol/g。
1.3.4 NOX、SOD和CAT活性的测定
NOX活性使用NOX活性检测试剂盒测定,每mg组织蛋白在反应体系中1 min变化0.01定义为1个酶活力单位,单位:U/g。
SOD活性测定参考吴若臣等[20]方法并稍作修改。称取约1.0 g葡萄冻样,置于3.0 mL 50 mmol/L的磷酸缓冲液中混匀,于4 ℃、12 000×g离心15 min。吸取0.1 mL上清液,依次加入1.7 mL 50 mmol/L磷酸钠缓冲液(pH 7.8)、0.3 mL 130 mmol/L甲硫氨酸、0.3 mL 750 mmol/L硝基氮蓝四唑(nitro blue tetrazolium,NBT)、0.3 mL 100 mmol/L乙二胺四乙酸和0.3 mL 20 mmol/L核黄素。混匀后对照管进行避光处理,测定管在4 000 lx光照强度下反应20 min,反应结束后,于560 nm波长处测定其吸光度值。酶活力单位定义为:1 min内抑制NBT光化还原50%的酶量,单位:U/g。
CAT活性测定参考ZHANG等[11]的方法。称取约1 g葡萄冻样,加入3 mL磷酸缓冲液(50 mmol/L、pH 7.0)混匀,于4 ℃、12 000×g离心15 min,取0.1 mL上清液与3 mL磷酸缓冲液混匀、加入0.2 mL 3 g/L H2O2溶液反应,于240 nm波长处测定混合液吸光度值变化。酶活力单位定义为:1 min引起吸光度降低0.01的酶量,单位:U/g。
1.3.5 AsA-GSH循环相关酶活性的测定
APX、脱氢抗坏血酸还原酶(dehydroascorbate reductase,DHAR)、单脱氢抗坏血酸还原酶(monodehydroascorbate reductase,MDHAR)、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase,GPX)和谷胱甘肽还原酶(glutathione reductase,GR)活性均采用试剂盒进行测定。APX、DHAR、MDHAR、GPX、GR酶活力单位定义分别为:1 g样品1 min氧化1 μmol抗坏血酸定义为1个酶活力单位;1 g组织1 min催化1 μg GSH氧化所需酶量;25 ℃条件下1 g样品1 min氧化1 μmol NADH所需酶量;1 g组织样本在反应体系中1 min催化1 nmol GSH所需酶量;pH 8.0条件下1 g组织1 min催化1 μmol NADPH所需酶量。单位均为:U/g。
1.3.6 AsA-GSH循环相关代谢物含量的测定
AsA、脱氢抗坏血酸(dehydroascorbic acid,DHA)均采用试剂盒进行测定,单位均为:μmol/g。
GSH、氧化型谷胱甘肽(oxidized glutathione,GSSG)含量的测定参考XING等[21]的方法。单位均为:μmol/g。
1.3.7 基因表达测定
总RNA通过植物总RNA小提试剂盒提取,采用核酸分光光度计对RNA样本进行浓度及纯度测定。利用FastKing cDNA第一链合成试剂盒合成cDNA;使用FastReal qPCR PreMix(SYBR Green)试剂盒和LightCycler 96®分析相对基因表达水平。以VvActin为内参基因,利用2-ΔΔCT方法,以熏蒸前样品为基础计算目标基因的相对表达量。引物信息如表1所示。
表1 引物序列
Table 1 Primer sequences
基因上游引物序列(5′→3′)下游引物序列(5′→3′)VvSODGCACCACCAGACCTACATAACGCGCTCTGCAACTTAACAACVvCATAGGCTGGGAAGGCAAATTATCTGAGTAGCATGACTGTGGTTAGVvNOXCTGGAGGAGGATTTGGGTTATTCTTCGTCTGCCTGTACTCAAAVvAPXGCTCTGGATTTGAAGGACCTGATGGCAGTTGGATAAGACVvDHARCTCGCTCCTCCTCCTGAACATTGCCAAGAGCCACCTGAAGATGVvMDHARTCATCAAGGGAACAGTAGCAGGTGGGAAAGTAGCAACATCTCVvGPXGCTTACCGATTCGAATTACACCCAGCCTTGTATCTTGTACATGCVvGRCCTCAGGCTATTCTCAAATCAGTCAACCTCTATTGCTCCAGTCVvActinGATTCTGGTGATGGTGTGAGTGACAATTTCCCGTTCAGCAGT
1.4 数据处理与分析
采用Excel 2010进行数据结果计算,所有数据均以3次重复测定结果的“平均值±标准误差”表示。使用SPSS 27.0.1对数据进行方差分析,处理组间差异采用t检验进行分析,显著性水平设定为*P<0.05、**P<0.01。使用Origin 2021软件对最终数据进行绘图和相关性分析。
2 结果与分析
2.1 SO2处理对葡萄果实采后表观品质的影响
如图1所示,贮藏前期(第0天),2组葡萄均呈现色泽鲜亮、果梗翠绿的良好新鲜状态。CK组葡萄品质随着贮藏时间的延长逐渐下降。第4天即出现明显果梗褐变,第5天部分果实开始腐烂,伴有白色霉菌出现。SO2处理组在第6天仅出现轻微果梗褐变,整个贮藏期间未观察到果实腐烂,外观品质保持良好。
图1 SO2处理对‘克瑞森’葡萄采后外观的影响
Fig.1 Effect of SO2 treatment on postharvest appearance of ‘Crimson Seedless’ grape
2.2 SO2处理对葡萄果实品质的影响
随着贮藏时间的延长,葡萄果实的硬度、TSS含量和TA含量逐渐下降,失重率、落粒率及腐烂率则持续上升(表2)。与CK组相比,SO2处理显著延缓了葡萄果实采后品质劣变。贮藏结束时,SO2处理组葡萄果实的硬度、TSS含量和TA含量分别比CK高18.22%、7.12%和9.20%;失重率低35.79%(P<0.05)。经SO2处理后,果实的落粒和腐烂发生时间明显后延。CK组在第3天即出现落粒,SO2处理组在第4天才出现落粒情况;CK组第4天开始出现腐烂,SO2处理组则在第6天才出现腐烂。贮藏结束时,SO2处理显著降低了果实落粒率和腐烂率,分别比CK低62.39%和84.23%(P<0.05)。
表2 SO2处理对‘克瑞森’葡萄品质的影响
Table 2 Effects of SO2treatment on postharvest quality in ‘Crimson Seedless’ grape
品质指标处理贮藏时间/d0123456硬度/NCK13.56±0.44a12.55±0.31a12.06±0.25a11.43±0.44a10.45±0.30a10.15±0.47a9.77±0.21aSO213.56±0.44a13.24±0.30b13.09±0.24b12.72±0.25b12.00±0.28b11.70±0.38b11.55±0.28bTSS/%CK21.37±0.29a21.00±0.24a21.02±0.16a20.7±0.35a20.52±0.27a20.02±0.24a19.78±0.15aSO221.37±0.29a21.73±0.22b22.23±0.30b21.77±0.15b21.80±0.23b21.40±0.31b21.19±0.20bTA/%CK0.565±0.008a0.598±0.007a0.558±0.013a0.526±0.009a0.526±0.007a0.523±0.009a0.511±0.006aSO20.565±0.008a0.552±0.010b0.568±0.008a0.604±0.011b0.573±0.008b0.569±0.010b0.558±0.011b失重率/%CK0a2.13±0.24b4.08±0.21b4.79±0.22b5.02±0.18b5.31±0.36b5.70±0.29bSO20a1.22±0.27a2.15±0.22a2.95±0.21a3.04±0.30a3.16±0.21a3.66±0.34a落粒率/%CK0a0a0a0.27±0.19a0.92±0.25a3.56±0.27b6.78±0.35bSO20a0a0a0a0.50±0.20a1.04±0.32a2.55±0.23a腐烂率/%CK0a0a0a0a1.13±0.13b3.2±0.35b6.15±0.27bSO20a0a0a0a0a0a0.97±0.12a
注：不同小写字母表示同一贮藏时间2组间差异显著(P<0.05)。
2.3 SO2处理对葡萄果实·O2-、H2O2和MDA水平的影响
整个贮藏期间,CK组和SO2处理组葡萄果实的·O2-、H2O2及MDA含量均呈上升趋势(图2)。贮藏2 d后,SO2处理组的·O2-、H2O2及MDA水平显著低于CK组。贮藏1天时,·O2-在果实中迅速积累;至贮藏末期,CK组·O2-含量较SO2处理组高出22.11%(P<0.01)。对于H2O2和MDA,CK组和SO2处理组在第1天无显著差异,但自第2天起CK组H2O2和MDA含量迅速升高。贮藏结束时,CK组的H2O2和MDA含量分别比SO2处理组高20.47%和11.13%(P<0.01)。
a-·O2-含量;b-H2O2含量;c-MDA含量
图2 SO2处理对‘克瑞森’葡萄·O2-、H2O2和MDA含量的影响
Fig.2 Effects of SO2 treatment on the contents of ·O2-、H2O2, and MDA of ‘Crimson Seedless’ grape
注:*表示P<0.05,**表示P<0.01(下同)。
a-NOX活性;b-SOD活性;c-CAT活性
图3 SO2处理对‘克瑞森’葡萄NOX、SOD、CAT活性的影响
Fig.3 Effects of SO2 treatment on the activities of NOX, SOD, and CAT of ‘Crimson Seedless’ grape
2.4 SO2处理对葡萄果实NOX、SOD和CAT活性的影响
随着贮藏时间的增加,果实NOX活性逐渐升高,且CK组一直处于较高水平(图3-a)。贮藏第4天时,CK组NOX活性是SO2处理组的1.13倍(P<0.01)。SO2处理组SOD活性显著高于CK组(图3-b),并在贮藏第2天时出现峰值,SO2处理组SOD活性是CK组的1.33倍(P<0.01)。CAT活性呈现先升后降趋势(图3-c),贮藏第2天时,SO2处理组CAT活性被迅速激活,并达到峰值,贮藏第3天时差异最显著,此时SO2处理组CAT活性是CK组的1.17倍(P<0.01)。整个贮藏后期,SO2处理延缓了葡萄贮藏后期CAT活性的下降。
2.5 SO2处理对葡萄果实AsA-GSH循环相关酶活性的影响
在整个贮藏期间,葡萄果实APX和MDHAR变化趋势相似,均呈现先升高后下降的趋势,峰值分别出现的第1天和第2天(图4-a、图4-b)。SO2处理显著提高了这2种酶的活性,第1天时,SO2处理组APX活性是CK组的1.20倍;第2天时,SO2处理组MDHAR活性是未处理果实的1.46倍(P<0.01)。贮藏2 d后,未处理葡萄DHAR活性大幅度降低且随后一直保持在较低的活性水平,SO2处理显著削弱了这种下降趋势(图4-c)。CK组GPX和GR活性在第2天达到最高值后持续下降(图4-d、图4-e),SO2处理组上升趋势延长至第3天,此时GPX和GR活性分别比CK组高32.5%和26.7%(P<0.01)。整个贮藏后期(3～6 d),SO2处理组GPX和GR活性均显著高于CK组。
a-APX活性;b-MDHAR活性;c-DHAR活性;d-GPX活性;e-GR活性
图4 SO2处理对‘克瑞森’葡萄AsA-GSH循环相关酶活性的影响
Fig.4 Effects of SO2 treatment on the activities of AsA-GSH cycle related enzymes of ‘Crimson Seedless’ grape
a-AsA含量;b-DHA含量;c-GSH含量;d-GSSG含量;e-AsA/DHA含量;f-GSH/GSSG含量
图5 SO2处理对‘克瑞森’葡萄AsA-GSH循环代谢物含量的影响
Fig.5 Effects of SO2 treatment on the contents of metabolites of AsA-GSH cycle of ‘Crimson Seedless’ grape
2.6 SO2处理对葡萄果实AsA-GSH循环相关代谢物含量的测定
葡萄果实中AsA与DHA含量变化呈现不同趋势:贮藏期间(1～6 d),AsA总体呈下降趋势,而DHA则先升后降(图5-a、图5-b)。SO2处理显著促进AsA积累,尤其在贮藏第3天和第4天,含量分别较CK组高35.2%和37.02%(P<0.01)。相反,SO2处理在贮藏1天后有效抑制了DHA含量的增加,至第6天时,SO2处理组DHA含量较CK组降低8.38%(P<0.01)。
葡萄果实中GSH与GSSG含量的变化分别与AsA和DHA含量变化趋势相似(图5-c、图5-d)。GSH含量在贮藏1 d内快速积累至峰值,SO2处理组是CK组的1.13倍差异显著(P<0.05)。整个贮藏期间,SO2处理有效维持了GSSG含量的稳定;至贮藏结束时,CK组GSSG含量为SO2处理组的1.25倍(P<0.05)。此外,AsA/DHA和GSH/GSSG比值呈下降趋势,而SO2处理显著减缓了下降趋势(图5-e、图5-f);贮藏结束时,SO2处理组AsA/DHA和GSH/GSSG比值分别为CK组的1.34、2.26倍(P<0.01)。
2.7 SO2处理对葡萄果实ROS代谢相关基因表达的影响
VvNOX表达达到峰值后逐渐降低,且在1～4 d贮藏期间SO2处理下调了VvNOX的表达(图6-a)。在第4天时,SO2处理组VvNOX表达量相较于对照组降低了14.41%(P<0.01)。在整个贮藏期间,葡萄中VvSOD和VvCAT基因的表达均呈现先上升后下降的趋势(图6-b、图6-c)。SO2处理对这2种基因的调控模式存在差异,SO2处理上调了VvSOD在贮藏前期(1～4 d)的表达水平,而VvCAT的表达水平是在贮藏后期(2～5 d)上调。在SO2处理组中,VvSOD和VvCAT的表达量分别在第3天和第2天达到峰值,其表达量分别为对照组1.47倍和1.56倍(P<0.01)。
a-VvNOX;b-VvSOD;c-VvCAT;d-VvAPX;e-VvDHAR;f-VvMDHAR;g-VvGPX;h-VvGR
图6 SO2处理对‘克瑞森’葡萄活性氧代谢相关基因相对表达量的影响
Fig.6 Effects of SO2 treatment on the relative expression levels of genes related to ROS metabolism of ‘Crimson Seedless’ grape
CK组VvAPX基因的表达在贮藏期间总体呈下降趋势(图6-d)。SO2处理则在贮藏1～4 d内诱导了VvAPX的表达。贮藏结束时,2组VvAPX的相对表达量均显著低于初始水平(P<0.01)。贮藏期间,CK组VvDHAR和VvMDHAR表达水平总体低于SO2处理组(图6-e、图6-f)。SO2处理组VvDHAR和VvMDHAR表达量的峰值均出现在第2天,分别是CK组的1.17、1.76倍(P<0.01)。CK组VvDHAR和VvMDHAR的表达均呈现双峰模式,2个峰值分别出现在第2天和第4天。
整个贮藏期间,葡萄VvGPX表达量呈先升后降的趋势(图6-g),SO2处理增强了VvGPX在贮藏中期(2～4 d)以及第6天的表达,在第3天时达到峰值。对照组VvGR基因的表达在第2天达到峰值后缓慢下降(图6-h)。与CK组相比,SO2处理组VvGR峰值延长到第3天,此时SO2处理比CK组高出77.55%(P<0.01)。SO2可持续诱导VvGR表达直至贮藏结束。
2.8 相关性分析
如图7所示,‘克瑞森’葡萄硬度、TSS、TA与·O2-、H2O2、MDA和NOX水平呈显著负相关(P<0.05);与SOD、AsA、APX、DHAR、MDHAR、GSH、GSH/GSSG、GPX、GR呈显著正相关。葡萄失重率、落粒率、腐烂率与·O2-、H2O2、MDA和NOX水平呈显著正相关,与SOD、AsA、AsA/DHA、APX、DHAR、MDHAR、GSH、GSH/GSSG呈显著负相关(P<0.05)。
图7 相关性分析热图
Fig.7 Correlation analysis heat map
注:*P≤0.05,**P≤0.01。
GSH、AsA含量与·O2-、H2O2、MDA、NOX水平呈显著负相关(P<0.05);与CAT、AsA/DHA、APX、DHAR、MDHAR、GSH/GSSG、GPX、VvSOD、VvAPX、VvDHAR、VvMDHAR呈显著正相关(P<0.05)。
3 讨论
果实采后硬度下降和腐烂是鲜食葡萄果实采后衰老的重要标志,这不仅会加速果实品质劣变,还会缩短采后贮藏时间,降低商品价值。SO2熏蒸作为当前鲜食葡萄商业化保鲜中最有效的方法,可延缓果实衰老并维持品质[22]。本试验中,SO2处理显著保持了葡萄果实的外观品质、延缓果梗褐变、降低腐烂率,并维持果实硬度,减缓TSS和TA下降,降低失重率和落粒的发生,从而延长了果实贮藏时间。与本研究结果一致,SO2处理可维持‘木纳格’葡萄果实硬度,抑制落粒率和腐烂率的上升[23];经SO2处理的不同包装条件下蓝莓果实均表现出腐烂率和失重率下降[24]。以上研究表明SO2可能在延缓果实采后品质劣变中具有重要的作用。果实采后品质下降与ROS过量积累密切相关,SO2在维持葡萄采后品质的过程中,可能通过调控ROS生成与清除平衡来延缓衰老进程。
ROS过量积累所引发的氧化损伤是导致葡萄果实衰老的关键因素之一,·O2-和H2O2的过量积累会打破细胞内自由基平衡,导致细胞膜结构功能受损,加速果实的衰老[25]。ROS的过量积累还可引起膜脂过氧化反应,最终生成MDA。MDA是植物氧化应激的关键指标,其水平升高常直接反映细胞膜的氧化损伤程度[14]。在双孢蘑菇中,采后ROS的过度积累,诱发蛋白质的氧化修饰与脂质的过氧化降解,进而加快菇帽褐变与组织腐烂[26]。甜樱桃采后,由于其自身高蒸腾速率和呼吸速率,引起体内·O2-、H2O2和MDA的大量富集,造成TSS、TA、总酚及总花青素等重要营养成分显著损耗,导致贮藏品质下降[27]。在本研究中,随着贮藏时间的延长,SO2熏蒸处理显著抑制了·O2-和H2O2的积累,进而减缓果实膜脂过氧化程度和MDA含量的升高。相关研究也发现,NO处理通过抑制·O2-、H2O2和MDA水平,增强杏果实的抗病性,以延长果实贮藏期[28]。可见SO2处理可能通过抑制果实ROS的过量积累,维持细胞膜完整性,进而延缓衰老并较好地保持果实品质。
NOX/SOD系统和CAT是关键的ROS清除系统,可降低果实中ROS的积累。NOX可催化·O2-的生成,而SOD将·O2-歧化为H2O2和O2;H2O2又在CAT的催化下,转化为H2O和O2,最终达到ROS清除的目的[29]。在龙眼中,SO2熏蒸处理可激活果实中NOX/SOD系统,并在1 d后触发抗氧化响应,从而调控ROS稳态,维持果实品质[30]。此外,基因表达与酶活性密切相关,本研究表明,SO2处理下调VvNOX表达,显著抑制NOX活性,使·O2-含量低于CK组;同时上调VvSOD和VvCAT表达,增强SOD和CAT活性,激活NOX/SOD系统,降低H2O2及MDA水平。类似的现象也在香蕉[31]和火龙果[32]果实中观察到,通过调控NOX、SOD、CAT活性和相关基因的表达,抑制ROS积累,维持果实品质。因此,SO2可能通过调控NOX、SOD和CAT活性,减轻葡萄果实的氧化损伤程度,进而延缓果实衰老进程并维持采后品质。
AsA-GSH循环在ROS清除、延缓果实品质劣变方面中发挥重要作用,其通过维持细胞氧化还原稳态实现保护果实细胞功能。在AsA-GSH循环中,AsA在APX的催化下将H2O2分解为水,自身被氧化为单脱氢抗坏血酸(monodehydroascorbate,MDHA),MDHA可进一步转化为DHA[29]。GSH在MDHAR和DHAR的催化下作为电子供体,分别将MDHA和DHA再生为新的AsA;同时GPX将GSH转化为GSSG,消除过量的H2O2,而GR有助于GSSG还原为GSH,促进GSH的积累[33]。由此,AsA与GSH在循环中不断再生,实现ROS的高效清除和氧化还原稳态的维持。较高水平的DHAR、MDHAR、GR活性,会加速AsA-GSH循环,促进AsA和GSH的积累,延缓桃果实的衰老[34]。在本研究中,SO2处理通过上调VvAPX和VvGPX表达,并增强APX和GPX活性,有效清除了果实内H2O2,减轻了ROS积累所引发的氧化损伤。此外,SO2处理显著提高了DHAR、MDHAR和GR活性,并诱导VvDHAR、VvMDHAR、VvGR的表达,从而促进了AsA的再生和GSH的持续积累。外源性褪黑素处理通过上调RrAPX、RrGR、RrDHAR、RrMDHAR基因的表达,有效维持刺梨的品质[35]。此外,AsA/DHA和GSH/GSSG的比值是反映植物细胞内氧化还原状态的核心指标,SO2处理通过激活AsA-GSH循环关键酶活性,提高了AsA和GSH水平,维持较高的AsA/DHA与GSH/GSSG比值,抑制ROS累积,从而增强葡萄果实对采后氧化胁迫的抗性,维持果实采后贮藏品质。在西梅的研究中发现,维持较高的AsA-GSH循环关键酶活性,可增强果实抗性,延缓果实衰老和品质劣变[36-37]。
·O2-、H2O2、MDA和NOX与硬度、TSS、TA呈显著负相关(P<0.05),与失重率、落粒率、腐烂率呈显著正相关(P<0.05);SOD、AsA、GSH、APX、DHAR、MDHAR、AsA/DHA、GSH/GSSG与硬度、TSS、TA呈显著正相关(P<0.05),SOD、AsA、GSH、APX、DHAR、MDHAR、GPX、GR、GSH/GSSG与失重率、落粒率、腐烂率呈显著负相关(P<0.05);上述结果进一步证明了SO2可能通过激活NOX/SOD系统和AsA-GSH循环,协同调控ROS代谢,从而抑制氧化损伤、维持果实采后品质。相关研究表明,外源褪黑素处理,可诱导SOD、CAT活性增强,有效延缓柑橘类水果的采后衰老并提升其贮藏性能[38]。同样地,臭氧处理通过提高AsA和GSH的含量,有效抑制H2O2和MDA的积累[39],改善哈密瓜果实的品质。综上所述,SO2处理很可能通过多路径协同调控果实内部的氧化还原稳态,从而有效延缓‘克瑞森’葡萄的采后衰老进程,维持其采后品质。
4 结论
SO2处理可显著延缓鲜食葡萄采后衰老并维持果实品质。SO2有效保持果实硬度、TSS和TA含量,降低果实失重、落粒及腐烂的发生,延长贮藏期并维持外观品质。SO2通过下调VvNOX表达并抑制其活性,减少·O2-生成,同时上调VvSOD、VvCAT的表达,激活NOX/SOD系统;此外,SO2显著增强AsA-GSH循环,通过诱导VvAPX、VvDHAR、VvMDHAR、VvGPX和VvGR表达,激活酶活性,促进AsA再生和GSH积累,从而维持较高的AsA/DHA和GSH/GSSG比值。综上所述,SO2通过激活NOX/SOD系统与AsA-GSH循环的协同抗氧化网络,抑制ROS生成、减轻膜脂过氧化损伤,提升果实的氧化还原稳态,从而延缓葡萄采后衰老。
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