凝结海恩德里克斯氏菌(Heyndrickxia coagulans),曾用名产孢乳杆菌(Lactobacillus sporogenes)、凝结芽胞杆菌(Bacillus coagulans)和凝结魏茨曼氏菌(Weizmannia coagulans),最初于1915年由HAMMER等[1]从变质牛奶中分离出来。2023年NARSING RAO等[2]将其更名为凝结海恩德里克斯氏菌。凝结海恩德里克斯氏菌是一种产芽孢、产乳酸且环境耐受性强的益生菌[3]。该菌凭借其调节肠道菌群[4]、增强免疫[5]、促进消化[6]和抗氧化[7]等多种功效,被广泛应用于食品、饲料和医药等产业。
目前凝结海恩德里克斯氏菌的鉴定主要依赖于16S rRNA基因测序比对、生理生化试验、全基因组平均核苷酸一致性分析(average nucleotide identity,ANI)和基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry,MALDI-TOF MS)等方法[8-10],这些方法通常需要获得纯培养的菌株。基于16S rRNA基因序列比对的鉴定方法,在PCR扩增后还需进行一代测序和BLAST比对,该流程通常需要3～5 d。而生理生化鉴定、ANI比对和MALDI-TOF MS等方法通常需委托专业的检测机构,存在检测周期长、成本高等问题。上述方法难以满足行业对快速、简便和低成本检测方法的迫切需求。
基于种特异性鉴定引物的PCR检测方法,因其快速、简便、低成本的特点而备受青睐。目前已报道的凝结海恩德里克斯氏菌特异性鉴定引物,是2013—2019年,研究者们基于当时的分类系统通过随机筛选针对该菌的特异性基因而设计的[11-15]。然而,近10年来,该菌种的分类学地位经历了两次重大变更:其先从凝结芽胞杆菌被重新分类为凝结魏茨曼氏菌[16],后于2023年更名为凝结海恩德里克斯氏菌[2]。属级分类框架的更新,意味着该菌种的基因组定义和近缘物种关系已发生根本性变化。因此,在旧分类体系下基于当时有限数据所设计的引物,其靶向基因在新分类背景下可能已非特异,亟待重新评估与验证。
基于基因组数据采用Roary 3.31.0和BPGA 1.3等生物信息学软件开发种水平特异性PCR鉴定引物[17-20],已成为细菌鉴定领域中一项新兴的技术策略。相较于通过随机筛选种特异性基因并开发鉴定引物的传统策略,该方法首先通过全基因组比对,筛选出种内保守且种间特异性高的候选基因进行引物设计,再通过实验验证筛选出特异性强且扩增效果良好的引物对,因而开发的引物具有更好的种内适用性和种间特异性。目前已成功应用于化脓性链球菌(Streptococcus pyogenes)[17]、明串珠菌属(Leuconostoc)[18]、德氏乳杆菌亚种(Lactobacillus delbrueckii subspecies)[19]和魏斯氏菌属(Weissella)[20]等的快速鉴定中。然而,由于引物开发过程需要大量生物信息学分析和繁琐的引物特异性验证工作,相较于16S rRNA测序、MALDI-TOF MS等成熟方法,该方法前期开发过程需要大量精力投入,因此目前基于基因组数据开发凝结海恩德里克斯氏菌PCR鉴定引物的相关研究仍不多见。
本研究基于基因组数据,采用生物信息学方法筛选出凝结海恩德里克斯氏菌的特异性基因,然后在序列保守区设计相应的PCR引物。通过特异性筛选、灵敏度测定和退火温度的优化,筛选出一对灵敏度高、退火温度广的特异性鉴定引物,建立了一种高效、简便且低成本的凝结海恩德里克斯氏菌特异性PCR鉴定方法,有望满足行业的快速和低成本的鉴定需求。
1 材料与方法
1.1 实验材料与仪器
实验材料:高保真酶Goldenstar T6 Super PCR mix、高纯度低电渗琼脂糖、DL2000 DNA Marker,北京擎科生物科技股份有限公司;细菌基因组提取试剂盒FastPure Bacteria DNA Isolation Mini Kit,南京诺唯赞生物科技股份有限公司;LB肉汤培养基、MRS肉汤培养基,青岛高科技工业园海博生物技术有限公司;Tris-HCl,广州赛国生物科技有限公司;冰乙酸,北京伊诺凯科技有限公司;甘油,上海阿拉丁生化科技股份有限公司。
实验菌种:本实验选取25株凝结海恩德里克斯氏菌作为阳性菌株,以验证引物在种内的通用性。同时,为评估引物的种间特异性及其在复杂样本中的应用潜力,共选用35株非目标菌作为阴性对照,涵盖以下类别:a)系统发育近缘菌株:包括枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌和短短芽孢杆菌等5种;b)常见益生菌菌株或有益生潜力的菌株:包括唾液链球菌嗜热亚种、发酵粘液乳杆菌和罗伊氏粘液乳杆菌等16种共18株;c)常见的致病菌株:包括金黄色葡萄球菌、单核细胞增生李斯特氏菌和副溶血性弧菌等11种;d)代表性环境菌株:恶臭假单胞菌1种。所有菌株均为本实验室保藏,如表1所示。
表1 菌种信息表
Table 1 Strain information table
25株阳性菌35株阴性菌凝结海恩德里克斯氏菌SCFF-JNJ004凝结海恩德里克斯氏菌SCFF-JNJ022志贺氏菌SCFF-J0301戊糖片球菌SCFF-JWP001凝结海恩德里克斯氏菌SCFF-JNJ005凝结海恩德里克斯氏菌SCFF-JNJ023普通变形杆菌SCFF-J029唾液链球菌嗜热亚种SCFF-JSR006凝结海恩德里克斯氏菌SCFF-JNJ006凝结海恩德里克斯氏菌SCFF-JNJ024肠炎沙门氏菌SCFF-J0731发酵粘液乳杆菌SCFF-JFJ004凝结海恩德里克斯氏菌SCFF-JNJ007凝结海恩德里克斯氏菌SCFF-JNJ025弗氏柠檬酸杆菌SCFF-J0734罗伊氏粘液乳杆菌SCFF-JLY005凝结海恩德里克斯氏菌SCFF-JNJ008凝结海恩德里克斯氏菌SCFF-JNJ026产气肠杆菌SCFF-J0211动物双歧杆菌乳亚种SCFF-JDW002凝结海恩德里克斯氏菌SCFF-JNJ009凝结海恩德里克斯氏菌SCFF-JNJ027副溶血性弧菌SCFF-J0936长双歧杆菌长亚种SCFF-JCS002凝结海恩德里克斯氏菌SCFF-JNJ010凝结海恩德里克斯氏菌SCFF-JNJ028阪崎肠杆菌SCFF-J0512短双歧杆菌SCFF-JDS002凝结海恩德里克斯氏菌SCFF-JNJ011小肠结肠炎耶尔森菌SCFF-J2131嗜酸乳杆菌SCFF-JSS005凝结海恩德里克斯氏菌SCFF-JNJ012大肠埃希氏菌SCFF-J0014干酪乳酪杆菌SCFF-JGL004凝结海恩德里克斯氏菌SCFF-JNJ013恶臭假单胞菌SCFF-J1510鼠李糖乳酪杆菌SCFF-JSL005凝结海恩德里克斯氏菌SCFF-JNJ014金黄色葡萄球菌SCFF-J0477植物乳植杆菌SCFF-JZW005凝结海恩德里克斯氏菌SCFF-JNJ015枯草芽孢杆菌SCFF-J0219长双歧杆菌婴儿亚种SCFF-JCS006凝结海恩德里克斯氏菌SCFF-JNJ016解淀粉芽孢杆菌SCFF-J0527发酵粘液乳杆菌SCFF-JFJ002凝结海恩德里克斯氏菌SCFF-JNJ017单核细胞增生李斯特氏菌SCFF-J0391乳酸片球菌SCFF-JRP001凝结海恩德里克斯氏菌SCFF-JNJ018短短芽孢杆菌SCFF-J022两歧双歧杆菌SCFF-JLQ001凝结海恩德里克斯氏菌SCFF-JNJ019巨大芽孢杆菌SCFF-J075副干酪乳酪杆菌SCFF-JFG002凝结海恩德里克斯氏菌SCFF-JNJ020短小芽孢杆菌SCFF-J094戊糖片球菌SCFF-JWP004凝结海恩德里克斯氏菌SCFF-JNJ021罗伊氏粘液乳杆菌SCFF-JLY002
实验仪器:Microfuge 16台式微量离心机,贝克曼库尔特国际贸易(上海)有限公司;FDE30086FV-ULTS -80 ℃冰箱,赛默飞世尔科技(中国)有限公司北京分公司;AC2-6S8-CN生物安全柜,新加坡艺思高科技有限公司;CAW400SG型厌氧工作站,上海磐麦科技有限公司;T100 PCR仪,伯乐生命医学产品(上海)有限公司;MOL-61R振荡培养箱,上海旻泉仪器有限公司;LF-31DN水平琼脂糖电泳槽,北京龙方科技有限公司;ChemiScope 6200化学发光成像仪,上海勤翔科学仪器有限公司;Epoch微孔板分光光度计,美国伯腾仪器有限公司。
1.2 实验方法
1.2.1 特异性基因筛选与引物设计
从NCBI数据库下载基因组序列用于分析。其中,目标数据集包含56个凝结海恩德里克斯氏菌的基因组。背景数据集的构建基于以下原则:a)选取海恩德里克斯氏属内其他8个公开物种的基因组,用以筛选能够区分属内近缘物种的特异性基因;b)该菌曾被归类为芽孢杆菌属,为排除系统发育上密切相关的芽孢杆菌属的干扰,本研究选取119株芽孢杆菌属参考基因组纳入背景数据集,以保障引物在属水平的特异性。
首先采用Prokka 1.14.6对上述183个基因组进行基因注释[21],然后使用泛基因组分析软件Roary 3.31.0统计各注释基因在各基因组中的分布情况[22]。使用Microsoft Excel 2019筛选出凝结海恩德里克斯氏菌中保守且独有的备选基因。使用BLAST+ v2.13.0进一步从基因中筛选出序列相似性和覆盖度在56个凝结海恩德里克斯氏菌基因组中均高于97.5%且在背景菌株基因组中均低于5%的特异性基因。使用NCBI BLAST(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)对特异性基因的特异性进行验证;使用Primer-BLAST(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/)在特异性基因保守序列区进行引物设计。
1.2.2 引物特异性筛选
1.2.2.1 菌株活化
25株凝结海恩德里克斯氏菌:接种100 μL甘油冻存菌到5 mL LB肉汤培养液中,37 ℃、180 r/min培养12～18 h。
两歧双歧杆菌、长双歧杆菌长亚种、长双歧杆菌婴儿亚种、短双歧杆菌和动物双歧杆菌乳亚种等严格厌氧菌:在厌氧工作台中接种100 μL甘油冻存菌到添加50 mg/L莫匹罗星的5 mL厌氧MRS肉汤培养基中,37 ℃静置培养48 h。
罗伊氏粘液乳杆菌、戊糖片球菌、乳酸片球菌、干酪乳酪杆菌、唾液链球菌嗜热亚种、发酵粘液乳杆菌、嗜酸乳杆菌、鼠李糖乳酪杆菌、植物乳植杆菌:接种100 μL甘油冻存菌到5 mL MRS肉汤培养液中,37 ℃、180 r/min培养48 h。
志贺氏菌、普通变形杆菌、肠炎沙门氏菌、弗氏柠檬酸杆菌、产气肠杆菌、副溶血性弧菌、阪崎肠杆菌、小肠结肠炎耶尔森菌、大肠埃希氏菌、恶臭假单胞菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、单核李斯特氏菌、短短芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌和短小芽孢杆菌:接种100 μL甘油冻存菌到5 mL LB肉汤中,37 ℃、180 r/min培养12～24 h。
1.2.2.2 基因组DNA提取与定量
将上述活化的菌液按照2%的接种量再次接种并培养至对数生长期,取1.5 mL菌液,使用试剂盒进行基因组DNA提取。使用微孔板分光光度计进行核酸质量浓度及纯度检测。
1.2.2.3 PCR扩增与电泳
引物特异性初筛:将所有的基因组DNA调整至相同质量浓度后分别制备混合阳性菌模板和混合阴性菌模板。混合阳性菌模板:25株阳性菌基因组DNA各取1 μL进行等量混合;混合阴性菌模板:35株阴性菌基因组DNA各取1 μL进行等量混合。使用1.2.1节中设计的10对引物,分别以混合阳性菌模板和混合阴性菌模板进行PCR扩增。PCR反应体系:DNA模板1 μL,上下游引物各0.4 μL,Goldenstar T6 Super PCR mix 23.2 μL。PCR反应程序:98 ℃预变性2 min;98 ℃变性10 s,55 ℃退火15 s,72 ℃延伸15 s,共30个循环;72 ℃终延伸5 min。PCR产物采用1%琼脂糖凝胶电泳分离,使用化学发光成像仪进行显影。
引物特异性复筛:选取初筛中特异性较好的引物对,分别以35株阴性菌株和25株阳性菌株的单菌基因组DNA为模板进行PCR扩增,反应体系和程序同上。
1.2.3 温度梯度优化
根据复筛引物对SCFF-WCYW008的Tm值,设置退火温度梯度为50～62 ℃,每2 ℃设置1个梯度。以3株凝结海恩德里克斯氏菌SCFF-JNJ005、SCFF-JNJ009和SCFF-JNJ006的基因DNA作为模板进行PCR扩增,除退火温度外,PCR反应条件同1.2.2.3节。使用ImageJ 1.48q对电泳条带进行灰度值分析[23];使用Microsoft Excel 2021进行作图;使用SPSS 26.0对灰度值进行单因素方差分析,P<0.05表示差异具有统计学意义。
1.2.4 引物的鉴定灵敏性与阈值检测
根据凝结海恩德里克斯氏菌基因组DNA的质量浓度测定结果,选取最高质量浓度(1 109.76±9.67) ng/μL、中间质量浓度(408.08±5.34) ng/μL和最低质量浓度(95.55±5.23) ng/μL的DNA进行梯度稀释,分别梯度稀释至1、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5倍。以上述不同质量浓度的DNA溶液为模板进行PCR扩增,检测SCFF-WCYW008引物的扩增阈值,PCR反应条件同1.2.2.3节。
2 结果与分析
2.1 特异性引物设计
使用Roary 3.31.0等软件共筛选出9个凝结海恩德里克斯氏菌特异性基因,为进一步验证9个基因的序列特异性,使用NCBI core-nt核酸数据库进行在线序列比对,如表2所示。9个基因在凝结海恩德里克斯氏菌基因组中最低覆盖度为100%,最低序列相似性为97.73%,具有高度的保守性。其中,group_3088、group_3848和group_6011在其他物种中无同源序列,为凝结海恩德里克斯氏菌的特有基因,具有高度序列特异性。cheB_1、group_7622和group_7848在非目标菌种中有覆盖度为52%～76%,相似度为67.49%～77.97%的同源序列,具有较高的序列特异性。而group_6063、group_5577和group_7523在非目标菌种中具有覆盖度91%～95%,相似度70.95%～76.56%的同源序列,具有部分序列特异性。针对这些基因的序列保守区使用Primer-BLAST设计引物序列,如表3所示。
表2 九个凝结海恩德里克斯氏菌特有基因的BLAST评估
Table 2 BLAST-based evaluation of the 9 genes specific to Heyndrickxia coagulans
基因编号编码蛋白基因长度/bp与NCBI中目标菌最低相似度序列与NCBI中非目标菌最高相似度序列覆盖度/%相似性/%覆盖度/%相似性/%cheB_1趋化蛋白CheB66010097.736067.49group_3088假定蛋白14710097.96——group_3848假定蛋白44110097.73——group_5577假定蛋白14110097.849176.56group_6011假定蛋白29110098.28——group_6063孢子衣蛋白CotJB26110098.089372.56group_7523冷激蛋白18910097.889570.95group_7622假定蛋白22810098.685277.97group_7848含DUF1836结构域蛋白24910098.397670.53
注：目标菌为凝结海恩德里克斯氏菌;非目标菌为NCBI core-nt数据库中除凝结海恩德里克斯氏菌外的所有菌种;“—”表示除目标菌凝结海恩德里克斯氏菌外未比对出其他菌种的同源序列。
表3 引物信息表
Table 3 Primers information
引物名称引物序列5’-3’引物Tm值/℃目的产物长度/bp靶基因SCFF-WCYW001TTCAAAGCGGACGGATAGCA 59.75GGCTTGAGCATTTCGCCATC60.25226cheB_1SCFF-WCYW002TCAAAGCGGACGGATAGCAC60.46CTCGGCTTCTTTCACCCTGA59.68205cheB_1SCFF-WCYW003GGAAACCAGAATGCTGAGCG59.55ATTCCACGAGTTCTTCTGCAAC59.1970group_3088SCFF-WCYW004GAATTTGCCACAGTCAGCGT59.41GCTTCCTGTTTTCCGCATCC59.83334group_3848SCFF-WCYW005GCATGAAATGGTGTCGCTCA59.2CTTGGCCTCAATCCGGTACA59.7582group_5577SCFF-WCYW006GTGAGGCGGTTGAAGAAAGC 59.76TGGTAAGCACGTGAAATCGAGA60.03215group_6011SCFF-WCYW007GCAGGCCCTTGATTTTGCAC60.67GCCCGAAATTTGTCAGCGG60.15158 group_6063SCFF-WCYW008CCTGAGGTGGAAACGACCG60.37TTCATATCGGAGTGGCAGAGC59.93116group_7523SCFF-WCYW009GTCCATGAAAAAGAGCTGCTGG60.09CATGGCCCTTTTGATGACCC59.17111group_7622SCFF-WCYW010ATTGTTTGAGCTGTACCGGG58.18CCAAGCAGGTCTTTCCGGTT60.54102group_7848
2.2 特异性鉴定引物筛选
首先采用混合阳性菌和混合阴性菌模板初步验证了10对引物的特异性。如图1所示,引物对SCFF-WCYW001、SCFF-WCYW002、SCFF-WCYW005、SCFF-WCYW006、SCFF-WCYW007和SCFF-WCYW010在混合阴性菌模板中扩增出条带。SCFF-WCYW003在混合阳性菌中扩增出现非特性条带;SCFF-WCYW004扩增条带非预期大小。SCFF-WCYW008和SCFF-WCYW009具有特异性扩增条带,但是SCFF-WCYW009扩增条带较弱,故优选SCFF-WCYW008作为特异性引物。
图1 十对引物特异性初筛
Fig.1 Preliminary specificity screening of the 10 primer pairs
注:M:DNA marker;1～10分别为引物SCFF-WCYW001～SCFF-WCYW010 的扩增条带。
进一步使用SCFF-WCYW008分别对35株阴性菌和25株阳性菌DNA进行PCR扩增,验证该引物对的特异性。如图2所示,引物对SCFF-WCYW008在35株阴性菌株中均无扩增条带,在25株阳性菌株中均扩增出特异性条带,表明SCFF-WCYW008引物具有100%扩增特异性,可用于凝结海恩德里克斯氏菌的种水平鉴定。
图2 引物对SCFF-WCYW008特异性验证
Fig.2 Specificity validation of primer pair SCFF-WCYW008
注:M:DNA marker;PC:阳性对照;NC:阴性对照;1:志贺氏菌SCFF-J0301;2:普通变形杆菌SCFF-J029;3:肠炎沙门氏菌SCFF-J0731;4:弗氏柠檬酸杆菌SCFF-J0734;5:产气肠杆菌SCFF-J0211;6:副溶血性弧菌SCFF-J0936;7:阪崎肠杆菌SCFF-J0512;8:小肠结肠炎耶尔森SCFF-J2131;9:大肠埃希氏菌SCFF-J0014;10:恶臭假单胞菌SCFF-J1510;11:金黄色葡萄球菌SCFF-J0477;12:枯草芽孢杆菌SCFF-J0219;13:解淀粉芽孢杆菌SCFF-J0527;14:单核细胞增生李斯特氏菌SCFF-J0391;15:短短芽孢杆菌SCFF-J022;16:巨大芽孢杆菌SCFF-J075;17:短小芽孢杆菌SCFF-J094;18:罗伊氏粘液乳杆菌SCFF-JLY002;19:戊糖片球菌SCFF-JWP001;20:乳酸片球菌SCFF-JRP001;21:两歧双歧杆菌SCFF-JLQ001;22:副干酪乳酪杆菌SCFF-JFG002;23:戊糖片球菌SCFF-JWP004;24:唾液链球菌嗜热亚种SCFF-JSR006;25:发酵粘液乳杆菌SCFF-JFJ004;26:罗伊氏粘液乳杆菌SCFF-JLY005;27:动物双歧杆菌乳亚种SCFF-JDW002;28:长双歧杆菌长亚种SCFF-JCS002;29:短双歧杆菌SCFF-JDS002;30:嗜酸乳杆菌SCFF-JSS005;31:干酪乳酪杆菌SCFF-JGL004;32:鼠李糖乳酪杆菌SCFF-JSL005;33:植物乳植杆菌SCFF-JZW005;34:长双歧杆菌婴儿亚种 SCFF-JCS006;35:发酵粘液乳杆菌SCFF-JFJ002;36～60:凝结海恩德里克斯氏菌SCFF-JNJ004～SCFF-JNJ028。
2.3 引物退火温度优化
对引物SCFF-WCYW008的退火温度进行优化,结果如图3所示:SCFF-WCYW008在退火温度范围为50～62 ℃时,均能扩增出单一目的条带,表明该引物具有较宽的退火温度范围。在范围为50～60 ℃时,扩增条带亮度随温度升高无明显差异,随着退火温度升高到62 ℃,扩增条带明显减弱。因此,推荐50～60 ℃作为SCFF-WCYW008的最佳退火温度范围。
a-不同退火温度下PCR扩增产物电泳图;b-PCR扩增条带灰度值差异分析
图3 引物对SCFF-WCYW008退火温度优化
Fig.3 Optimization of annealing temperature for primer pair SCFF-WCYW008
注:M:DNA marker;1～3:凝结海恩德里克斯氏菌SCFF-JNJ005、SCFF-JNJ009和SCFF-JNJ006;NC:无DNA模板PCR对照;不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。
2.4 SCFF-WCYW008引物对凝结海恩德里克斯氏菌的鉴定灵敏性验证
选取高、中、低3个质量浓度不同的凝结海恩德里克斯氏菌基因组DNA:SCFF-JNJ005[(95.55±5.23) ng/μL]、SCFF-JNJ009[(1 109.76±9.67) ng/μL]和SCFF-JNJ006[(408.08±5.34) ng/μL],分别进行10倍梯度稀释。使用SCFF-WCYW008分别对稀释后的DNA进行PCR扩增,结果如图4所示:SCFF-JNJ005、SCFF-JNJ009和SCFF-JNJ006这3种DNA模板的扩增条带亮度随着模板DNA质量浓度的降低而逐渐减弱,在10-2倍稀释后,仍可扩增出肉眼可见的条带,而在10-3、10-4、10-5倍稀释后,扩增条带较微弱或无明显扩增。因此,DNA质量浓度最低的SCFF-JNJ005经10-2倍稀释后对应的DNA质量浓度(0.96 ng/μL)可作为SCFF-WCYW008引物对的最低检测质量浓度。引物对SCFF-WCYW008具有较高的扩增灵敏度,在凝结海恩德里克斯氏菌基因组DNA质量浓度≥0.96 ng/μL时具有良好的扩增效果。
图4 引物对SCFF-WCYW008 PCR扩增灵敏度检测
Fig.4 Detection of PCR amplification sensitivity using primer pair SCFF-WCYW008
注:005、009和006分别为凝结海恩德里克斯氏菌SCFF-JNJ005、SCFF-JNJ009、SCFF-JNJ006;M:DNA marker;1～6分别表示将DNA稀释至1、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5倍;NC:无DNA模板PCR对照。
3 结论与讨论
近年来,随着凝结海恩德里克斯氏菌分类地位的不断修订及应用规模的逐年扩大,其快速鉴定方法的开发对于促进产业的健康发展具有十分重要的意义。然而目前该菌现存的鉴定方法存在鉴定周期长、检测成本高或鉴定引物的特异性存疑等问题,不能满足行业快速、简便、低成本的检测需求,亟待开发出一种新型、高效的检测方法。本研究基于基因组数据与生物信息学工具,开发了一种针对凝结海恩德里克斯氏菌的特异性PCR鉴定方法。该方法可有效区分凝结海恩德里克斯氏菌及其近缘物种,不仅具备高度的特异性与灵敏性,还具有较强的操作简便性,可显著缩短菌种鉴定时间,提升检测效率,并易于标准化推广,适用于工业化质量控制与常规检测场景。
通过泛基因组分析工具Roary 3.31.0等对菌种特异性基因进行系统筛选和鉴定引物开发,不仅避免了以往通过随机寻找种特异性基因开发特异性鉴定引物的盲目性,也显著提高了引物设计的合理性与可重复性,减少了实验验证的工作量,体现出生物信息学在现代微生物鉴定中的应用优势。将计算生物学与实验验证相结合,不仅能加速引物开发进程,也为建立快速、稳健的微生物鉴定技术提供了新思路。未来,该方法可扩展至其他细菌物种的特异性引物开发,特别是在近缘种区分、病原菌快速检测及混合样本中特定菌种的检测等方面具有广阔前景。
[1] HAMMER B W.Bacteriological studies on the coagulation of evaporated milk[J].Iowa Agricultural Experiment Station Research Bulletin, 1915, 19:119-131.
[2] NARSING RAO M P, BANERJEE A, LIU G H, et al.Genome-based reclassification of Bacillus acidicola, Bacillus pervagus and the Genera Heyndrickxia, Margalitia and Weizmannia[J].International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 2023, 73(7):5961.
[3] OU M S, INGRAM L O, SHANMUGAM K T.L:(+)-Lactic acid production from non-food carbohydrates by thermotolerant Bacillus coagulans[J].Journal of Industrial Microbiology &Biotechnology, 2011, 38(5):599-605.
[4] NICOLAS G M, MA S H.Effects of Heyndrickxia coagulans probiotics in the human gut microbiota and their health implications:A review[J].Food Wellness, 2025, 1(1):100003.
[5] ILOBA I, MCGARRY S V, YU L, et al.Differential immune-modulating activities of cell walls and secreted metabolites from probiotic Bacillus coagulans JBI-YZ6.3 under normal versus inflamed culture conditions[J].Microorganisms, 2023, 11(10):2564.
[6] STECKER R A, MOON J M, RUSSO T J, et al.Bacillus coagulans GBI-30, 6086 improves amino acid absorption from milk protein[J].Nutrition &Metabolism, 2020, 17(1):93.
[7] MAZHAR S, SIMON A, KHOKHLOVA E, et al.In vitro safety and functional characterization of the novel Bacillus coagulans strain CGI314[J].Frontiers in Microbiology, 2024, 14:1302480.
[8] 曹艳花, 冯会粉, 唐腾飞, 等.凝结芽胞杆菌(Bacillus coagulans)分类变迁与鉴定[J].食品与发酵工业, 2024, 50(20):35-41.CAO Y H, FENG H F, TANG T F, et al.Taxonomic changes and identification of Bacillus coagulans[J].Food and Fermentation Industries, 2024, 50(20):35-41.
[9] 丁长河, 樊星, 高军, 等.抑制幽门螺杆菌的凝结海恩德里克斯氏菌的筛选及其在发酵乳中的应用[J].河南工业大学学报(自然科学版), 2025, 46(3):81-89.DING C H, FAN X, GAO J, et al.Screening of Haiendrix coagulans with antagonistic effect on Helicobacter pylori and its application in fermented milk[J].Journal of Henan University of Technology (Natural Science Edition), 2025, 46(3):81-89
[10] ANSARI J M, COLASACCO C, EMMANOUIL E, et al.Strain-level diversity of commercial probiotic isolates of Bacillus, Lactobacillus, and Saccharomyces species illustrated by molecular identification and phenotypic profiling[J].PLoS One, 2019, 14(3):e0213841.
[11] 李顺鹏, 闫新, 黄科.一种用于扩增凝结芽孢杆菌的特异性引物及其应用:中国, CN102533743B[P].2013-06-19.LI S P, YAN X, HUAN K.Specific primer for amplifying Bacillus coagulans and application thereof:China, CN102533743B[P].2013-06-19.
[12] 符雷, 郗洪生, 施腾鑫, 等.一种鉴定凝结芽孢杆菌的方法:中国, CN104004846B[P].2016-01-06.FU L, XI H S, SHI T X, et al.Method for identifying Bacillus coagulans:China, CN104004846B[P].2016-01-06.
[13] 刘云国, 丁生林, 徐榕蔓, 等.凝结芽孢杆菌的PCR快速检测方法:中国, CN102041298B[P].2013-01-16.LIU Y G, DING S L, XU R M, et al.PCR (polymerase chain reaction) rapid detection method for Bacillus coagulans:China, CN104004846B[P].2016-01-06.
[14] 苟小兰, 黄丹, 苏艳秋, 等.一种快速检测凝结芽孢杆菌的方法及多重PCR试剂盒:中国, CN105256054B[P].2019-02-15.GOU X L, HUANG D, SU Y Q, et al.Method for rapidly detecting of Bacillus coagulans and multiplex PCR kit:China, CN105256054B[P].2019-02-15.
[15] 庞有志, 张小辉, 杜会坡, 等.一种禽类肠道凝结芽孢杆菌定量检测试剂盒及检测方法:中国, CN106244723A[P].2016-12-21.PANG Y Z, ZHANG X H, DU H P, et al.Poultry intestinal tract Bacillus coagulans quantitative detection kit and detection method:China, CN106244723A[P].2016-12-21.
[16] GUPTA R S, PATEL S, SAINI N, et al.Robust demarcation of 17 distinct Bacillus species clades, proposed as novel Bacillaceae genera, by phylogenomics and comparative genomic analyses:Description of Robertmurraya kyonggiensis sp.nov.and proposal for an emended genus Bacillus limiting it only to the members of the subtilis and cereus clades of species[J].International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 2020, 70(11):5753-5798.
[17] CHAUDHARI N M, GUPTA V K, DUTTA C.BPGA- an ultra-fast pan-genome analysis pipeline[J].Scientific Reports, 2016, 6:24373.
[18] KIM E, YANG S M, KIM I S, et al.Identification of Leuconostoc species based on novel marker genes identified using real-time PCR via computational pangenome analysis[J].Frontiers in Microbiology, 2022, 13:1014872.
[19] KIM E, CHO E J, YANG S M, et al.Identification and monitoring of Lactobacillus delbrueckii subspecies using pangenomic-based novel genetic markers[J].Journal of Microbiology and Biotechnology, 2021, 31(2):280-289.
[20] KIM E, YANG S M, KIM I S, et al.Identification of novel molecular targets for Weissella species-specific real-time PCR based on pangenome analysis[J].Applied Microbiology and Biotechnology, 2022, 106(11):4157-4168.
[21] SEEMANN T.Prokka:Rapid prokaryotic genome annotation[J].Bioinformatics, 2014, 30(14):2068-2069.
[22] PAGE A J, CUMMINS C A, HUNT M, et al.Roary:Rapid large-scale prokaryote pan genome analysis[J].Bioinformatics, 2015, 31(22):3691-3693.
[23] SCHNEIDER C A, RASBAND W S, ELICEIRI K W.NIH Image to ImageJ:25 years of image analysis[J].Nature Methods, 2012, 9(7):671-675.