红茶是全球消量最广、贸易量最大的茶类,其特有的色、香、味品质主要源于鲜叶中多酚类物质的酶促氧化聚合反应[1]。植物多酚因其广泛的生物活性而备受关注,在茶叶干物质中,多酚类物质占比高达18%～36%,其中儿茶素类约占多酚总量的70%,是构成茶叶品质和健康功效的关键成分[2-3]。茶黄素是儿茶素氧化聚合形成的一类具有苯骈卓酚酮结构的特征性色素,对红茶茶汤的明亮度、鲜爽度以及“金圈”的形成起着决定性作用。自Roberts首次发现并命名以来,研究者已陆续鉴定出包括茶黄素(theaflavin, TF)、茶黄素-3-没食子酸酯(theaflavin-3-gallate, TF-3-G)、茶黄素-3′-没食子酸酯(theaflavin-3′-gallate, TF-3′-G)和茶黄素-3,3′-双没食子酸酯(theaflavin-3,3′-digallate, TFDG)在内的多种茶黄素单体[4-5]。在成品红茶中,茶黄素含量虽仅占干物重的0.3%～1.5%,但其含量与比例直接决定了红茶的感官品质与经济价值。
近年来,随着研究的深入,茶黄素在抗氧化、抗炎、预防心脑血管疾病及抗癌等方面的潜在健康效益被不断揭示,推动了其在功能食品、保健品及医药领域的应用探索[6-7]。然而,其商业化应用面临两大核心挑战:其一来自产业前端,茶黄素在加工与贮藏中的化学不稳定性是其高值化利用的核心瓶颈。该过程不仅损及其感官品质,更导致其作为核心功能成分的含量与功效难以控制,从而严重制约了终端产品的标准化生产。市场后端挑战则在于全球主要市场的法规壁垒:在中国茶黄素被规范为食品添加剂GB 2760—2024 《食品安全国家标准 食品添加剂使用标准》,在美国被认定为膳食补充剂,在欧盟则被视为新食品原料。因此,深入阐明茶黄素的形成与氧化机制,对于前端精准调控红茶发酵工艺、稳定并提升茶黄素含量,乃至应对后端合规要求、最大化其应用价值,均具有重要的理论指导意义。本文系统梳理了茶黄素从形成到转化的复杂化学网络,重点评述了茶萘醌(theanaphthoquinone, TNQ)和双环[3.2.1]辛烷型中间体 (bicyclo [3.2.1] octane-type intermediate, BOI)等关键中间体的转化机制,并强调了计算化学等新兴交叉学科方法在该传统食品加工领域中的应用潜力。旨在为相关基础研究提供清晰脉络,并为通过食品加工技术精准调控红茶品质、开发高附加值茶制品提供理论指导与创新思路。
1 茶黄素的形成
1.1 茶黄素的类别
茶黄素类物质并非单一化合物,而是一系列由儿茶素及其衍生物通过氧化偶联反应形成的、具有苯骈卓酚酮特征结构的二聚或多聚体集合体。其具体类别及结构多样性直接取决于参与反应的前体儿茶素的类型、比例及氧化缩合方式。表1系统地总结了目前已鉴定的主要茶黄素类化合物及其对应的反应底物,其具体化学结构见图1。
图1 茶黄素结构
Fig.1 Structure of Theaflavin
表1 茶黄素种类及其前体
Table 1 Types of theaflavins and their precursors
序号中文名称英文名称反应底物1红紫精[8]purpurogallin(PPG)PG+PG23′4-二羟基苯骈卓酚酮benzotropolone(BTP)PG+CC3红紫精酸[8]purpurogallin carboxylic acidGA+GA4暂未命名unnamedCC+GA5茶黄酸[8]theaflavic acid(+)-EC + GA6表茶黄酸[8]epitheaflavic acid(-)-EC + GA7表茶黄酸-3′-没食子酸酯[8]epitheaflavic acid-3′-gallate(-)-ECG + GA8表茶黄棓灵-3-没食子酸酯[8]epitheaflagallin-3-gallateEGCG + GA(Pyrogallol)9暂未命名—EGC + Catechol10暂未命名[8]—EGCG+ Catechol11茶黄棓灵[9]theaflagallin(+)-EGC + GA(Pyrogallol)12表茶黄棓灵[9]epitheaflagallin(-)-EGC + GA(Pyrogallol)13羟基茶黄素[9]hydroxytheaflavin(-)-EGC14茶黄素[9]theaflavin (TF)EC + EGC15茶黄素-3-没食子酸酯[9]theaflavin-3-gallate (TF-3-G)EC + EGCG16茶黄素-3′-没食子酸酯[9]theaflavin-3′-gallate (TF-3′-G)ECG + EGC17双没食子酸酯[9]theaflavin-3,3′-digallate (TFDG)ECG + EGCG18异茶黄素[10]isotheaflavinEC + GC19异茶黄素3′-没食子酸酯[10]isotheaflavin 3′-gallateEC + GCG20新茶黄[10]neotheaflavin(+)-C + EGC21新茶黄素-3-没食子酸酯[9]neotheaflavin-3-gallate(+)-C + EGCG22茶烷典酸酯A[9]theaflavate AECG23茶烷典酸酯B[9]theaflavate BECG + EC24新茶烷典酸酯B[9]neotheaflavate BC + ECG25双苯骈卓酚酮环茶黄素A[11]theadibenzotropolone ATF-3-G + EC26双苯骈卓酚酮环茶黄素B[11]theadibenzotropolone BTF-3-G + C27双苯骈卓酚酮环茶黄素C[11]theadibenzotropolone CNeotheaflavin-3-gallate + EC28暂未发表authors’ unpublished dataTF-3′-G + EC29暂未发表authors’ unpublished dataTF-3,3′-G+EC30三苯骈卓酚酮环茶黄素[9]theatribenzotropolone ATF-3,3′-G + 2 EC31双茶黄素A[12]bistheaflavin ATF + TF32双茶黄素B[12]bistheaflavin BTF + TF
注：—表示暂未命名。
如表1所示,根据参与反应的反应物类型和缩合方式,茶黄素的生成途径可主要归纳为以下几类:1)简单酚类模型物间的氧化偶联;2)儿茶素与其他酚酸的反应;3)不同类型儿茶素之间的交叉偶联;4)已形成的茶黄素单体与儿茶素进一步氧化缩合生成高阶寡聚体;5)茶黄素分子之间的直接聚合。这些反应途径共同构成了一个复杂的网络,决定了红茶发酵中茶黄素类物质的最终组成与比例。
1.2 茶黄素的形成机理
正是由于其前体与路径的多样性,茶黄素的具体形成机制一直是研究的焦点。随着对茶黄素研究的深入,其种类渐增,形成机制也逐步被完善。最初TAKINO通过对比骨架型茶黄素单体与茶黄素的紫外吸收确定其构型;随后SANG、HASLAM、TANAKA分别提出从儿茶素到茶黄素的具体反应路径,双环[3,2,1]辛烷中间体TFs-e被认为可能是形成茶黄素类化合物的关键;当YANASE通过利用甲基化儿茶素得到加水即生成茶黄素的无色透明物质后该结构被确定为茶黄素形成过程的关键中间体。
前人通过对比合成红紫精,3′4-二羟基苯骈卓酚酮及其衍生物与茶黄素的光谱特征,发现TF与二羟基苯骈卓酚酮结构高度相似,而与三羟基苯骈卓酚酮差异显著[13-15],据此首次推断TF的苯骈卓酚酮构型可能源于表儿茶素(epicatechin, EC)和表没食子儿茶素(epigallocatechin, EGC)的直接耦合,并基于ROBERTS等[14]提出的中间体假说构建了初步形成机理见图2。
图2 茶黄素可能形成机制[13-15]
Fig.2 The possible formation mechanism of the theaflavin[13-15]
随后,SANG等[16]通过系统合成18种苯骈卓酚酮衍生物,明确提出苯骈卓酚酮骨架的形成依赖于一对儿茶素的共氧化:其中一个须具有连苯三酚型B环(如EGC),另一个须具邻苯二酚型B环(如EC)。该反应涉及B环氧化为醌、醌类间发生迈克尔加成、分子内羰基加成及最终脱羧等步骤,具体反应路径见图3。
图3 茶黄素可能形成机制[16]
Fig.3 The possible formation mechanism of the theaflavin[16]
与此同时,HASLAM等[17]认为反应始于儿茶素B环间形成区域选择性的氢醌型π-π复合物,继而脱羧生成目标结构见图4。而TANAKA等[18]基于酶优先氧化EC的现象,提出缺电子的EC-醌亲电进攻富电子的连苯三酚型儿茶素(如EGC)B环,进而构建苯骈卓酚酮骨架见图5。
图4 茶黄素可能形成机制[17]
Fig.4 The possible formation mechanism of the theaflavin proposed[17]
图5 茶黄素可能形成机制[18]
Fig.5 The possible formation mechanism of the theaflavin proposed[18]
该领域的关键突破来自于NAKATSUKA等[19]以及TANAKA等[18]对反应中间体的成功捕获。NAKATSUKA等[19]利用甲基化模型底物(5-甲基连苯三酚与4-甲基邻苯醌)进行缩合,分离并鉴定出一种无色的双环[3.2.1]辛烷型中间体。该中间体可进一步转化为苯骈卓酚酮,从而证实了该结构是形成过程中的关键枢纽。几乎同时,研究者们在合成茶黄素过程中,也分离出类似的不稳定二环辛烯中间体,证实其经水化、氧化和脱羧后可生成茶黄素,为茶黄素经由双环[3.2.1]辛烷中间体形成的理论提供了有力支持[17]。总之,尽管早期研究对初始反应路径存在不同见解,但双环[3.2.1]辛烷中间体的发现为茶黄素形成机制提供了一个公认的统一模型。
近年来,对茶黄素形成机制的研究已从路径争议深入到立体化学及量子计算化学层面。WANG等[20]的研究表明,不同立体构型的儿茶素对通过空间取代基效应显著影响其作为底物与多酚氧化酶(polyphenol oxidase, PPO)的亲和力及氧化还原电位,进而决定不同茶黄素异构体的合成效率和后续转化路径。这从最根本的分子属性上解释了为何不同茶树品种或发酵控制会导致茶黄素组成和含量的差异。目前对茶黄素形成机理的理论研究,也已从早期提出多种反应路径,发展到通过对关键中间体的实验捕获和理论计算,逐步统一和验证其核心机制。
2 茶黄素的后续转化
茶黄素作为红茶加工过程中的特征次级代谢产物,其生成与转化呈现典型的动态平衡特性。在发酵过程中,儿茶素类物质首先通过酶促氧化聚合形成茶黄素,随后茶黄素本身既可进一步发生氧化降解,也可与其他成分发生非氧化性转化,多种转化路径并存且竞争,共同决定了红茶色、香、味的最终形成。其中,氧化路径主导茶黄素向茶红素乃至高分子聚合物茶褐素的转变;而非氧化路径则涉及茶黄素苯骈卓酚酮骨架与亲核试剂(如硫醇化合物)的直接加合,形成结构稳定的衍生物。深入解析茶黄素的多路径转化机理,对于精准调控红茶发酵工艺、定向引导产物构成、稳定并提升茶汤品质具有重要理论意义;同时对不稳定中间体的捕获与鉴定,不仅可完善茶黄素转化机理的理论体系,也为开发发酵过程实时监测技术奠定基础。
2.1 茶黄素的氧化转化
2.1.1 茶黄素关键醌类中间体的生成与反应
茶黄素在红茶发酵阶段的氧化降解是其含量下降的关键原因,该过程不仅依赖于PPO和过氧化物酶(peroxidase, POD)的催化作用,也包括茶黄素的自氧化反应,生成一系列高反应活性的醌类中间体见图6,这些中间体可进一步通过分子间环化形成多聚体,或与蛋白质、多糖等生物大分子结合形成复合物,共同推动茶色素的复杂转化与稳定产物的形成。研究表明,TNQ(33)及其衍生物TNQ-3′-G(34)是茶黄素氧化过程中重要的初级中间产物[12,21]。它们不仅可作为电子受体促进多酚的持续氧化,也为后续聚合反应提供结构单元。值得注意的是,这类萘醌中间体的稳定性受分子结构影响显著,例如3′位没食子酰基的引入可能因空间位阻和极性增加导致其更易与质子性溶剂形成复合物,从而影响其反应路径与最终产物构成。进一步的研究通过捕获并鉴定出茶黄素醌的乙醇加合物(35),证实了“茶黄素→茶黄素醌(36)→TNQ”的逐步氧化路径[22]。更重要的是,实验中也分离出由茶黄素苯骈卓酚酮结构单元与表儿茶素醌(epicatechin quinone, EC-quinone)耦合形成的三聚体(37),为茶黄素经由醌类中间体发生分子间偶联、最终形成茶红素类多聚体提供了直接证据。
图6 茶黄素氧化中间体及其衍生物结构
Fig.6 Structure of the intermediate products and derivatives of the tea yellow pigment oxidation
尽管具有没食子酰基取代的茶黄素(如TF-3-G、TF-3′-G和TFDG)因其苯骈卓酚酮环空间位阻难以直接与EC-quinone反应,但其没食子酰基仍可作为反应位点,通过类似于茶黄素生物合成的分子机制与醌类化合物作用,形成结构更为复杂的多聚体(25～30)[23]。近年来的研究指出,茶黄素的氧化降解倾向性与其自身的电子结构密切相关,这从最底层揭示了降解反应的选择性本质。WANG等[20]通过静电势(electrostatic potential, ESP)分析表明,不同构型的茶黄素异构体其苯骈卓酚酮环的亲电/亲核性存在显著差异。TF苯骈卓酚酮环区域显示出更高的电子密度,这一电子结构特征使其在发酵体系中更容易作为亲核试剂,被其他亲电性醌进攻,从而更易于发生氧化聚合生成茶红素。综上所述,茶黄素的氧化是一个动态的多路径过程,涉及多种活性中间体的生成与转化,理解这些中间体的反应特性对于阐明茶红素的形成机制及调控红茶品质具有重要意义。
2.1.2 茶黄素多聚体的形成
茶黄素多聚体的形成主要依赖于非酶促氧化和酶促氧化。在酸性或高温环境下,茶黄素可通过自由基介导的聚合反应形成多聚体。在红茶加工过程中,茶叶中的PPO和POD催化儿茶素氧化为邻醌类中间体,进而通过C—C或C—O聚合形成茶黄素,并进一步聚合成二聚体、三聚体及更高分子质量的多聚体。这些多聚体被认为是茶红素类,通过液相色谱串联质谱技术(liquid chromatography-mass spectrometry, LC-MS)检测其分子质量>1 000 Da显著高于茶黄素类。TANAKA等[12]通过PPO氧化EC和EGC形成TF的同时进一步氧化分离得到双茶黄素A(31),经MS及核磁共振(nuclear magnetic resonance, NMR)分析为由2个TF分子间苯并托酚酮环通过C—C偶联形成的对称性四聚体结构;此外将TF在中性条件下自发氧化生成TNQ及其与之通过类似茶黄素合成时分子间作用机制的分子间环化形成的双茶黄素B(32)。研究显示在H2O2存在条件下,辣根过氧化酶可将茶黄素氧化为茶红素[8]。在H2O2条件下氧化儿茶素EC和表没食子儿茶素没食子酸酯(epigallocatechin gallate, EGCG)生成TF3G过程中用辣根过氧化酶处理后发现除了TF-3-G外还分离出一种新型色素(25),经鉴定为茶黄素型三聚体,且为首次被发现的茶黄素型三聚体,并在红茶中被检测到[11]。由TF-3-G的没食子基与游离儿茶素EC在POD的作用下生成,表明茶黄素的没食子基可以被氧化成二苯骈卓酚酮骨架从而起到延长茶黄素分子大小的作用[23]。在类似条件下,将该茶黄素的异构体与EC反应同样生成相应三聚体,TFDG的2个游离没食子基也可与EC形成相应的四聚体(30)[24]。
综上所述,茶黄素多聚体的形成是一个复杂的动态过程。酶促氧化是红茶加工中的主要途径,通过扩展茶黄素分子骨架高效氧化生成二聚体、三聚体乃至更高阶的多聚体(即茶红素);而非酶促氧化则通过自由基机制辅助这一过程的进行。这2条途径共同决定了红茶色素的最终组成与品质。
2.1.3 茶黄素可能的降解路径
TNQ被广泛认为是茶黄素氧化的关键初级中间产物,然而其在成品红茶中难以检测到的现象表明,TNQ在加工过程中极不稳定,会迅速发生后续转化。目前研究揭示了其2条可能的转化路径:
其一为非酶促缩合路径。TANAKA等[25]发现,TNQ的醌基可与茶叶中含量最丰富的多酚EGCG的B环发生非酶促缩合,生成具有复杂环状结构的化合物(38)结构见图7,表明除经典的儿茶素B环的偶联及没食子酰基氧化的途径外,醌类中间体的缩合同样构筑茶红素等高分子聚合物的可能途径之一。
图7 茶黄素氧化降解结构
Fig.7 Structure of Theaflavin Oxidation Degradation
其二为酶促转化路径。研究表明在POD和H2O2存在的条件下,EC与EGC反应体系中随TNQ含量下降而伴随出现一种新物质——茶香豆素A(39)见图7,其生成机制被推测为POD催化下的醌类转化反应[26]。这提示POD可能催化了TNQ的分子内重排或与其他组分的反应,使其转化为结构迥异的次级产物。鉴于发酵体系中POD与H2O2的广泛存在,这一酶促路径被认为可能是茶黄素降解的另一个重要方向。
综上,茶黄素的氧化降解可能遵循“茶黄素 → TNQ →...”的核心路径,并存在至少2种分支:即TNQ通过非酶促缩合直接参与茶红素聚合,或通过POD介导的酶促反应转化为茶香豆素等小分子化合物,后者可能进一步聚合或转化为茶褐素成分。然而,从TNQ到最终产物茶红素和茶褐素的完整转化链条仍存在大量未知环节,其详细的分子机制、反应动力学以及各路径的相对贡献率仍有待阐明。其他潜在路径,如TNQ与氨基酸/蛋白质的美拉德反应、与多糖的结合或自动氧化聚合等,亦是值得未来研究深入探索的重要可能性。
2.2 茶黄素的非氧化转化
茶黄素除了氧化降解,还可通过非氧化途径进行转化。近年研究发现,在中性至弱碱性条件(pH 6.5～7.5)下,茶黄素苯骈卓酚酮骨架本身即表现出亲电性,可直接与低分子质量硫醇化合物如半胱氨酸 (cysteine, Cys)、谷胱甘肽 (glutathione, GSH)和N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine, NAC) 等发生非氧化的亲核加成反应,从而有效抑制其氧化褐变[27]。该反应不依赖于活性氧或醌类中间体,其机制在于:茶黄素的苯骈卓酚酮c位碳原子表现出强烈的亲电性,而去质子化的硫醇基团(—S-)作为强亲核试剂,直接对其进行攻击,形成共价硫醚键连接的初始加合物。并且由于亲核试剂的结构差异也决定了后续反应路径与产物结构差异。Cys因兼具巯基与游离氨基,其游离氨基会进一步与b位羰基碳发生亲核进攻,进而环化形成S-半胱氨酰脱羟基茶黄素A(40);而GSH无游离氨基则只与茶黄素形成简单的单分子硫醇加合物S-谷胱甘肽茶黄素A(41),反应路径及产物结构见图8。
图8 茶黄素与硫醇化合物反应产物的结构
Fig.8 Structural of reaction products from theaflavin with thiol compounds
这一非氧化转化机制揭示了茶黄素转化的新机制,对其在食品工业应用体系如利用硫醇抑制茶饮料褐变、改善色泽和生理环境如与胃肠道中蛋白质的巯基相互作用,影响其生物可及性与活性中的命运和行为提供了关键的科学解释。
然而,当前研究仍存在明显局限。首先相关研究目前主要集中于反应活性最强的硫醇类化合物,而茶黄素作为多亲电中心,理论上也可与蛋白质赖氨酸ε-氨基、核酸碱基乃至维生素C等分子中的强亲核基团反应,相关系统性研究尚属空白[28]。未来研究应拓展至更广泛的生物亲核剂,比较不同亲核基团与茶黄素的反应活性、位点选择性及其产物特性,以构建完整的茶黄素反应网络。其次,新型茶黄素-硫醇加合物的生物学效益,体内代谢途径及安全性亟待评估,这是推动其向功能性食品或药物先导物发展的关键前提。
3 茶黄素形成及氧化的研究方法
体外模拟反应通过模拟红茶发酵过程在可控条件下进行反应是茶黄素形成和氧化机理的主要研究方法,主要包括酶促氧化法和化学氧化法,此外理论计算化学通过分子模拟和量子化学计算,从能量和轨道角度预测最可能发生的反应路径和中间体结构,尤其在不稳定反应中间体醌类的反应路径方面发挥重要作用。
3.1 化学氧化法
化学氧化法通常以儿茶素单体为原料,在特定氧化剂(如K3[Fe(CN)6]、H2O2等)作用下发生氧化偶联反应,生成茶黄素类化合物。TAKINO等[13]为解析茶黄素的形成机制,通过化学氧化法合成茶黄素类色素。该方法反应条件可控,产物得率较高,但存在副产物复杂、纯化困难等问题,且后期处理化工废液成本高,不便于规模化应用[29-30]。然而该方法能够构建酶促氧化法无法实现的无水反应体系,因此在茶黄素氧化机理研究中仍是一种有效的实验手段。
3.1.1 传统化学氧化法
由于茶黄素具有多官能团和复杂立体中心的结构特性,直接研究其反应机制常面临副反应多及分离困难等问题。鉴于茶黄素形成及氧化机制的关键反应位点主要位于B环,选用结构简化但仍保留关键反应位点的模型化合物,既可排除无关官能团干扰,又能聚焦于目标反应路径的研究。HORNER等[31]采用邻苯醌(ortho-benzoquinone, o-quinone)和焦棓酚(pyrogallol, PG)作为简化模型,以K3[Fe(CN)6]为氧化剂模拟苯骈卓酚酮的形成,提出o-quinone与PG通过离子型偶联形成双环中间体,再经水解和氧化生成目标产物,为后续茶黄素中间体的分离与反应机制解析奠定了重要的实验基础。TAKINO等[13]直接以EC和EGC为底物,通过化学氧化合成茶黄素,从实验上揭示了B环氧化偶联的可能性。在此基础上,NAKATSUKA等[19]选用甲基化模型底物4-甲基邻醌和5-甲基连苯三酚,在相同条件下成功合成并分离出双环中间体,完成从假说到实证的跨越。该中间体已被广泛认可为研究茶黄素及其苯骈卓酚酮骨架形成机制的关键中间体,且为后续酶促氧化、化学合成仿生研究提供范式。
3.1.2 模型系统的演进与电化学氧化法
传统的化学氧化剂如K3Fe(CN)6、FeCl3等虽能模拟儿茶素氧化,但其引入的金属离子等外源物质常引发副反应如金属螯合、亲电取代,导致生成的茶黄素在组成上与天然茶黄素存在显著差异,限制了其用于精确的机理研究。为克服这一局限,YASSIN等[32]开发了一种无试剂的电化学氧化模型系统。该研究以EGCG为底物,利用循环伏安法在电极表面直接生成醌类中间体,避免了外加氧化剂带来的复杂性。结果表明,此系统能更真实地模拟酶促氧化环境,成功鉴定出B环邻醌中间体、多羟基化EGCG衍生物以及茶黄素、茶栖素等关键二聚体产物。这一方法为在纯净体系中研究茶红素前体的形成路径提供了可靠且优越的实验工具。
3.2 冻干鲜叶模型发酵法
传统红茶发酵依赖于鲜叶受损后儿茶素与內源酶之间的接触,该过程易受湿度、温度等环境因素的影响。同时,由于鲜叶的供应受季节和产地的限制,发酵的实验研究会有难以复刻的困扰,为解决这一问题,TANAKA等[25]开发了一种使用冻干新鲜茶叶粉的新型红茶发酵模型。经验证,利用该冻干茶粉进行发酵并提取的产物与市售红茶中的发酵产物相似,表明该模型可用于优化发酵工艺或调控红茶色素组成。该方法是一种能够实现底物标准化,同时又能保留茶叶复杂天然体系的理想研究方法。它极大提高了红茶发酵基础研究的科学性、精确性和可重复性。
3.3 酶促氧化法
新鲜茶叶中的多酚组成相对简单,而红茶独特的发酵加工过程显著丰富了其成茶中的多酚类物质含量。在该过程中,PPO和POD对多酚的转化过程起关键作用。在茶黄素酶促氧化研究中,早期采用的粗酶提取物法和鲜叶匀浆发酵法存在明显局限,包括酶源和底物不可控、难以捕获反应中间体,仅能对终端产物进行检测。20世纪50年代,ROBERTS等[14]通过引入色谱技术并建立模型发酵体系,开创了红茶多酚体外研究的先河。为捕获酶促反应中不稳定的中间体,通常可采用亲核试剂处理策略,将其转化为稳定的衍生物,从而终止氧化聚合进程,便于后续分离、鉴定及氧化机制研究。例如,LI等[22-33]在研究发酵阶段儿茶素低聚物的形成机制时,利用邻苯二胺处理将不稳定的醌类代谢物转化为稳定的吩嗪衍生物,此外,在研究TF的酶促降解时,通过添加乙醇终止反应,成功获得了TNQ前体。
3.3.1 酶促氧化体系优化
该方法反应条件温和,产物结构与天然茶黄素更为接近,但合成过程受多因素调控,除PPO外,环境参数如pH、温度、溶氧水平和反应参数如反应时长、底物配比及浓度均显著影响其合成效率。系统优化这些反应参数不仅有助于提升产物得率,更能深入解析茶黄素的形成机制,且为工业化规模制备茶黄素奠定重要理论与技术支撑。
3.3.1.1 PPO来源
红茶发酵的“红变”现象是一系列酶促氧化反应所引起的色素变化,其主要由PPO触发,该过程也常见于受损的水果和蔬菜中[34]。PPO是一种含铜的金属酶,可划分为单酚单氧化酶(酪氨酸酶)、双酚氧化酶(儿茶酚氧化酶)和漆酶等类别[35]。在茶黄素的体外合成中,早期研究多采用游离PPO作催化剂,并发现不同来源的PPO其催化特性存在显著差异[36-37]。例如,多数植物内源性PPO倾向于催化邻苯二酚而非连苯三酚,而来源于蘑菇的酪氨酸酶能够同时氧化邻苯二酚型和连苯三酚型儿茶素,从而在茶黄素合成过程中同步生成两类醌类中间体,加速反应进程并提高TF产量[38]。TENG 等[39]通过纯化PPO同工酶,进一步证实通过精细调控底物体系中非酯型与酯型儿茶素的比例,可实现茶黄素组成的定向合成,奠定了基于底物工程的调控策略。
然而,游离酶体系存在稳定性差、难以重复利用以及成本较高等固有局限,制约了其工业化应用潜力。为克服这些瓶颈,近年来研究焦点已逐渐转向酶固定化技术与酶分子工程的结合应用。例如,HUANG等[35]通过过渡态构象优化策略对微生物酪氨酸进行理性设计,获得了催化效率显著提升的变体,为高效合成茶黄素(如TFDG)提供了高性能的酶催化剂基础。若进一步将该高性能工程酶通过物理吸附或共价交联等方式固定于介孔二氧化硅、磁性纳米粒子等载体,有望同时实现酶的高活性、高稳定性与可重复使用性。因此,结合酶理性设计与固定化策略,构建高性能、可回收的PPO催化剂系统,已成为当前提升茶黄素酶法合成效率的重要研究方向[40]。
3.3.1.2 pH 值
酶在茶黄素合成和氧化过程中起重要催化作用,反应体系的pH值显著影响酶活性。PPO和POD分别是含有铜和铁的氧化还原酶,过酸时不仅会导致酶蛋白变性,还会导致PPO活性中心的铜离子大量游离,POD辅基中的铁被质子化,而过碱时会导致形成CuOH沉淀及铁卟啉的水解[30]。在茶黄素的酶促氧化研究中,许多研究结果都表明,pH值为5～6时茶黄素的合成量最高,这也与红茶发酵的弱酸性环境相吻合[36,41-43]。红茶工业化发酵中,将pH值控制在5.0～5.5并采用富氧发酵,可有效提升茶黄素保留率,从而改善红茶汤色明亮度和滋味鲜爽度。
3.3.1.3 底物浓度和量比
底物的浓度和比例都显着影响茶黄素的合成速率。高浓度儿茶素是天然的酶灭活剂或抑制剂,所以在茶黄素合成过程中底物浓度存在最佳范围,而非线性正相关关系[44]。有研究表明,TFDG合成的最佳底物质量浓度为0.50 mg/mL,当底物浓度在该浓度范围内,产物生成量呈线性增加,当底物浓度高于该临界值时,产物得率反而随浓度升高呈递减趋势[45]。
儿茶酚型儿茶素与三酚型儿茶素的比例也极大影响茶黄素的生物合成。在茶黄素合成过程中,两类儿茶素首先发生非酶促氧化生成醌类中间体;随后,儿茶酚型醌与连苯三酚型醌发生氧化还原偶联,通过形成C—C或C—O生成不稳定中间体,该中间体经氧化还原歧化后进一步缩合,最终形成具有特征性苯骈卓酚酮结构的茶黄素[46]。因此,促进前体物质的氧化偶联与缩合反应对提高茶黄素产率至关重要。在TF合成体系中,由于EGC更易发生氧化二聚化,其浓度下降速度比EC更快。随反应的进行当EGC被完全消耗时,TF的合成速率开始降低,转而大量生成TNQ及其他副产物。另一方面,EC因对PPO具有较高特异性,通常在反应初期优先生成,随后作为氧化剂进攻EGC分子,促进TF的形成。由于EGC的氧化还原电位较低,更容易被EC醌氧化;在此过程中,EC醌被还原重新生成EC,后者作为电子载体,介导电子从EGC传递至EC醌,进而促进EGC醌的生成。这一循环机制导致EGC浓度迅速下降[47]。因此,适当提高连苯三酚型儿茶素的比例,有助于维持反应推进,促进茶黄素的高效合成[9]。研究表明,反应体系中高浓度的 EGC 和 EGCG可通过其连苯三酚基团与儿茶酚醌发生偶联还原反应,从而抑制由醌类中间体引发的引发的茶黄素分解[48]。不同类型的儿茶素比例显著影响酶促氧化反应的方向,LI等[49]通过对不同摩尔比例的EC与EGCG酶促反应产物进行光谱与色度分析发现,高比例EGCG倾向于促进红色色素如脱氢茶黄素和茶红素的生成,而高比例EC则有利于黄色色素如茶黄素的形成。因此,调控邻苯三酚型儿茶素与邻苯二酚型儿茶素的比例是提高茶黄素合成效率的关键策略。基于此,通过精确控制底物比例与氧化条件来优化醌类偶联路径,已成为茶黄素实验室制备及工业化生产中极具应用前景的技术方案。
3.3.1.4 时间
茶黄素的生物合成是不断变化的动态过程,其含量变化与反应时间密切相关。在酶促反应初期,随着反应时间的延长,茶黄素含量呈现明显的上升趋势。然而,当反应持续超过特定时间阈值后,生成的茶黄素将进一步在PPO作用下与反应体系中的儿茶素醌发生氧化聚合反应形成多聚体,同时伴随底物副产物的增多,其生成量反而逐渐降低,因此在最佳时间终止反应非常必要[25]。值得注意的是,部分结构更为复杂的氧化产物的生成过程极为迅速,几乎在反应起始阶段即达到最大产量。这一现象表明,不同氧化产物的形成动力学存在显著差异。
3.3.1.5 氧气
茶黄素的形成依赖于儿茶素的氧化聚合,而氧气是这一反应的必要因素,在PPO作用下,氧气作为电子受体,促进儿茶素(如EGCG、ECG等)氧化成醌类中间体,进而聚合成茶黄素。在大规模的红茶发酵中,氧气含量直接影响产物的生成量。且富氧发酵显著改善了红茶的口感,潘科等[50]发现富氧发酵的样品颜色和亮度会更深,且香气化合物的种类增多。有研究表明氧气有助于儿茶素的消耗及茶黄素的积累,PPO催化的茶黄素产量随着空气通量从 0 增加到 300 L/h 而显着增加[51]。
3.4 计算化学法
茶黄素的形成与氧化过程涉及大量高活性、不稳定的醌类中间体,其瞬变特性使得传统实验方法难以捕获和表征。理论计算化学通过模拟反应路径、优化中间体与过渡态结构、计算反应能垒,为揭示这些难以通过实验观测的微观反应机制提供了不可替代的研究手段。
3.4.1 在氧化区域选择性机理研究中的应用
YASSIN等[32]在利用电化学氧化模型发现EGCG的氧化优先发生于B环后,为探究其本质原因,进一步采用了密度泛函理论(density functional theory, DFT)计算。他们系统分析了儿茶素及其异构体的前沿分子轨道(frontier molecular orbital, FMO),发现对于连苯三酚型儿茶素如EGCG,其最高占据轨道的电子密度高度集中于B环。这一计算结果明确预示,B环是分子中最容易失去电子的部位,在热力学和动力学上都是氧化的最优位点。该工作从量子化学角度完美解释了红茶发酵中氧化偶联化学为何以B环反应为主导,在此理论基础上,研究得以进一步深入,聚焦于该活性位点所引发的具体化学反应路径与关键中间体的去向。理论计算化学在此同样展现出不可替代的优势,尤其是在解析BOI等不稳定物种的形成与转化机制方面。
3.4.2 在反应机制解析中的独特优势
计算化学的应用极大拓展了茶黄素机理研究的边界。其一,它突破了实验条件的限制。鉴于关键中间体对水极度敏感,计算模拟可在绝对无水的虚拟环境中进行,为理解其本征反应性质提供了纯净的模型体系[52]。其二,它具备精准的微观洞察力。通过量子化学计算,能够可视化质子转移、电子密度分布变化等细节,从而从电子层面解释反应的选择性[53]。例如,在茶黄素形成机制的研究中,量子力学(quantum mechanics, QM)计算与逆合成共同证实,BOI是苯并托酮环生成的关键中间体[54]。JIAN等[55]通过逆合成分析与结构优化,揭示了这种新的连苯三酚醌(EGC-quinone I, EGC-Q-I)互变异构模式,并发现o-quinone 与EGC-Q-I需通过形成分子间氢键以克服空间位阻,最终生成关键的中间体BOI(42), 该发现深化了对初始缩合步骤的理解。基于上述方法学优势,计算化学的核心突破在于精准揭示了关键中间体BOI的转化路径与溶剂依赖性机制。
3.4.3 对关键中间体转化路径的揭示
计算化学的核心贡献在于阐明了BOI中间体的后续转化通用机理(图9)。研究表明,BOI分子中的C2—C3因电子密度较低而成为反应的决速步和关键断裂点[56]。量子化学计算模拟出的详细路径表明:极性溶剂分子(水或醇)经去质子化后,其含氧亲核离子会攻击BOI的桥羰基碳,导致C2—C3断裂并生成一个阳离子中间体(43);此后的反应路径具有显著的溶剂依赖性:在水相环境中,促使e-位甲酸基脱羧,最终生成PPG;而在醇类溶剂中,则与e-位结合形成一系列稳定的甲酸酯衍生物(44)。该理论成功解释了实验观察到的产物差异,是计算化学驱动机理解析的典范。
图9 BOI中间体的后续转化通用机理
Fig.9 The general mechanism of subsequent transformation of BOI intermediates
计算化学通过其独特的理论模拟优势,已成为阐明茶黄素形成与氧化过程中难以捕获的不稳定中间体结构及反应路径不可或缺的核心研究手段。
4 展望
茶黄素作为红茶的关键品质成分与功能因子,其复杂的形成与氧化机制研究虽已取得显著进展,仍面临诸多挑战与机遇。未来研究应在以下方面进一步深化。
4.1 深化反应机制解析,助力精准调控工艺
应重点突破关键中间体如TNQ、BOI的实时捕获与动态转化路径解析。结合多尺度计算模拟(quantum mechanics/molecular dynamics, QM/MD)与原位谱学技术,揭示醌类中间体在不同发酵条件下的转化动力学与路径选择机制,为红茶发酵的数字化监控与智能调控提供理论支撑,实现通过pH、温度、通氧等参数的精准优化,定向引导产物构成。
4.2 加强构效关系研究与高附加值产品开发
未来研究需系统表征茶黄素多聚体、茶红素及茶褐素等高级氧化产物的精细化学结构、聚合机制及其与蛋白质、多糖等食品组分的互作模式。结合体内外模型评估其健康功效,明确构效关系,为开发茶黄素强化饮料、微胶囊、功能性食品等提供理论与原料创新基础。
4.3 突破应用技术瓶颈,推动产业化应用
应着力突破茶黄素在工业化发酵中的稳定性与生物利用度瓶颈,开发高效递送系统(如纳米乳液、脂质体)与绿色制备工艺(酶工程、合成生物学)。同时,加强发酵过程的工程化放大研究,开发在线监测技术与智能控制系统,推动茶黄素从天然成分向高值化、功能化食品配料的转化,并关注其质量标准与安全性评价体系的建立。
[1] BERTELLI A, BIAGI M, CORSINI M, et al.Polyphenols:From theory to practice[J].Foods, 2021, 10(11):2595.
[2] WANG M T, GUO W W, KE Z J, et al.Inhibitory mechanisms of galloylated forms of theaflavins on α-glucosidase[J].International Journal of Biological Macromolecules, 2025, 294:139324.
[3] HU L, HU Z H, PENG J Y, et al.In vitro inhibitory effects and molecular mechanism of four theaflavins on isozymes of CYP450 and UGTs[J].Foods, 2025, 14(16):2822.
[4] ZHAO T Y, HUANG X X, ZHAO J, et al.Theaflavins:An underexploited functional compound in black tea[J].Trends in Food Science &Technology, 2024, 154:104755.
[5] DU Y Y, ZHANG H, ROTHENBERG D O’, et al.Multiomics correlation analysis on the mechanism of flavor substance formation during the processing of “Huanong 53” black tea[J].Lwt, 2024, 214:117086.
[6] DONG S S, WU S T, HAO F Y, et al.Research advancements on theaflavins:Isolation, purification, synthesis, gut microbiota interactions, and applications potentials[J].Food Research International, 2025, 202:115692.
[7] DU S L, CHANG J Y, ZHOU Z M.A comprehensive review of theaflavins:Physiological activities, synthesis techniques, and future challenges[J].Food Science &Nutrition, 2025, 13(8):e70762.
[8] SANG S M, YANG C S, HO C T.Peroxidase-mediated oxidation of catechins[J].Phytochemistry Reviews, 2004, 3(1-2):229-241.
[9] MATSUO Y, TANAKA T, KOUNO I.A new mechanism for oxidation of epigallocatechin and production of benzotropolone pigments[J].Tetrahedron, 2006, 62(20):4774-4783
[10] ABUDUREHEMAN B, YU X C, FANG D D, et al.Enzymatic oxidation of tea catechins and its mechanism[J].Molecules, 2022, 27(3):942.
[11] SANG S M, TIAN S Y, MENG X F, et al.Theadibenzotropolone A, a new type pigment from enzymatic oxidation of (-)-epicatechin and (-)-epigallocatechin gallate and characterized from black tea using LC/MS/MS[J].Tetrahedron Letters, 2002, 43(40):7129-7133.
[12] TANAKA T, INOUE K, BETSUMIYA Y, et al.Two types of oxidative dimerization of the black tea polyphenol theaflavin[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2001, 49(12):5785-5789.
[13] TAKINO Y, IMAGAWA H, HORIKAWA H, et al.Studies on the mechanism of the oxidation of tea leaf catechins[J].Agricultural and Biological Chemistry, 1964, 28(1):64-71.
[14] ROBERTS E A H, MYERS M.The phenolic substances of manufactured tea.IV.:Enzymic Oxidations of Individual Substrates[J].Journal of the Science of Food and Agriculture, 1959, 10(3):167-172.
[15] SALFELD J C.Zum Reaktionsmechanismus der Purpurogallin-Bildung[J].Angewandte Chemie International Edition, 1957, 69(22):719-732.
[16] SANG S M, LAMBERT J D, TIAN S Y, et al.Enzymatic synthesis of tea theaflavin derivatives and their anti-inflammatory and cytotoxic activities[J].Bioorganic &Medicinal Chemistry, 2004, 12(2):459-467.
[17] HASLAM E, LILLEY T H, WARMINSKI E, et al. Polyphenol complexation: A study in molecular recognition[M]. Phenolic Compounds in Food and Their Effects on Health I. Washington, DCAmerican Chemical Society1992:8-50.
[18] TANAKA T, MATSUO Y, KOUNO I.Chemistry of secondary polyphenols produced during processing of tea and selected foods[J].International Journal of Molecular Sciences, 2010, 11(1):14-40.
[19] NAKATSUKA S I, YANASE E, SAWAKI K.The isolation of a bicyclo [3.2.1] intermediate during formation of benzo-tropolones, a common nucleus found in black tea pigments:Theaflavins[J].Synlett, 2005(17):2661-2663.
[20] WANG Z K, CAO Q Q, WEN M C, et al.Stereoselectivity during enzymatic oxidation of catechins and their products’ characteristic in taste receptors and color properties[J].Food Chemistry, 2025, 495:146307.
[21] JIAN J J, AN J L, GAO Z J, et al.The enzymatic synthesis of theaflavin-3-gallate oxidation product and its determination[J].Talanta, 2024, 276:126239.
[22] LI Y, SHIBAHARA A, MATSUO Y, et al.Reaction of the black tea pigment theaflavin during enzymatic oxidation of tea catechins[J].Journal of Natural Products, 2010, 73(1):33-39.
[23] MATSUO Y, OWATARI R, KUSANO R, et al.Oxidation mechanism of tea pigment theaflavins[C].The 57th Symposium on Natural Organic Compounds,2015.
[24] SANG S M, TIAN S Y, STARK R E, et al.New dibenzotropolone derivatives characterized from black tea using LC/MS/MS[J].Bioorganic &Medicinal Chemistry, 2004, 12(11):3009-3017.
[25] TANAKA T, YASUMATSU M, HIROTANI M, et al.New degradation mechanism of black tea pigment theaflavin involving condensation with epigallocatechin-3-O-gallate[J].Food Chemistry, 2022, 370:131326.
[26] KUSANO R, MATSUO Y, SAITO Y, et al.Oxidation mechanism of black tea pigment theaflavin by peroxidase[J].Tetrahedron Letters, 2015, 56(36):5099-5102.
[27] NARAI-KANAYAMA A, CHIKU K, ONO H, et al.Inhibitory effects of thiol compounds on theaflavin browning and structural analysis of the causative substances[J].Food Chemistry, 2022, 384:132488.
[28] WANG L, YANG H X, CUI J W, et al.Rewriting lysine reactivity:Lysine-targeted bioconjugation via biomimetic polarity reversal for diversified biomolecule modification[J].Chem, 2026, 12(2):102744.
[29] LIU Y F, WANG D Y, LI J, et al.Research progress on the functions and biosynthesis of theaflavins[J].Food Chemistry, 2024, 450:139285.
[30] LI J F, DENG Z Y, HE Y S, et al.Differential specificities of polyphenol oxidase from lotus seeds (Nelumbo nucifera Gaertn.) toward stereoisomers, (-)-epicatechin and (+)-catechin:insights from comparative molecular docking studies[J].LWT-Food Science and Technology, 2021, 148:111728.
[31] HORNER L, DÜRCKHEIMER W, WEBER K H, et al.Zur kenntnis der o-chinone, XXIV.synthese, struktur und eigenschaften von 1′.2′-dihydroxy-6.7-benzotropolonen[J].Chemische Berichte, 1964, 97(2):312-324.
[32] YASSIN G H, KOEK J H, KUHNERT N.Model system-based mechanistic studies of black tea thearubigin formation[J].Food Chemistry, 2015, 180:272-279.
[33] LI Y, TANAKA T, KOUNO I.Oxidative coupling of the pyrogallol B-ring with a galloyl group during enzymatic oxidation of epigallocatechin 3-O-gallate[J].Phytochemistry, 2007, 68(7):1081-1088.
[34] TILLEY A, MCHENRY M P, MCHENRY J A, et al.Enzymatic browning:The role of substrates in polyphenol oxidase mediated browning[J].Current Research in Food Science, 2023, 7:100623.
[35] HUANG Y, GAO C Z, SONG W, et al.Improving theaflavin-3, 3′-digallate production efficiency optimization by transition state conformation of polyphenol oxidase[J].Molecules, 2023, 28(9):3831.
[36] TENG J, LIU Y, ZENG W, et al.In vitro enzymatic synthesis of a monomeric theaflavin using a polyphenol oxidase isozyme from tea (Camellia sinensis) leaf[J].International Journal of Food Science &Technology, 2022, 57(9):5621-5631.
[37] CAI H L, ZHONG Z H, CHEN Y R, et al.Genes cloning, sequencing and function identification of recombinant polyphenol oxidase isozymes for production of monomeric theaflavins from Camellia sinensis[J].International Journal of Biological Macromolecules, 2023, 240:124353.
[38] ZHOU J H, LIU C W, ZHAO S M, et al.Improved yield of theaflavin-3, 3′-digallate from Bacillus megaterium tyrosinase via directed evolution[J].Food Chemistry, 2022, 375:131848.
[39] TENG J, GONG Z H, DENG Y L, et al.Purification, characterization and enzymatic synthesis of theaflavins of polyphenol oxidase isozymes from tea leaf (Camellia sinensis)[J].LWT, 2017, 84:263-270.
[40] ZHOU F, LIN H Y, LUO Y, et al.Advances and application of polyphenol oxidase immobilization technology in plants[J].Plants, 2025, 14(15):2335.
[41] LI D, DONG L, LI J Y, et al.Optimization of enzymatic synthesis of theaflavins from potato polyphenol oxidase[J].Bioprocess and Biosystems Engineering, 2022, 45(6):1047-1055.
[42] LI Y, BAI R X, WANG J T, et al.Pear polyphenol oxidase enhances theaflavins in green tea soup through the enzymatic oxidation reaction[J].eFood, 2022, 3(5):e35.
[43] KONG X H, XU W Q, ZHANG K X, et al.Effects of reaction temperature, pH and duration on conversion of tea catechins and formation of theaflavins and theasinensins[J].Food Bioscience, 2023, 54:102911.
[44] SHARMA K, BARI S S, SINGH H P.Biotransformation of tea catechins into theaflavins with immobilized polyphenol oxidase[J].Journal of Molecular Catalysis B:Enzymatic, 2009, 56(4):253-258.
[45] LEI S C, XIE M H, HU B, et al.Effective synthesis of theaflavin-3, 3′-digallate with epigallocatechin-3-O-gallate and epicatechin gallate as substrates by using immobilized pear polyphenol oxidase[J].International Journal of Biological Macromolecules, 2017, 94:709-718.
[46] TANAKA T, WATARUMI S, MATSUO Y, et al.Production of theasinensins A and D, epigallocatechin gallate dimers of black tea, by oxidation-reduction dismutation of dehydrotheasinensin A[J].Tetrahedron, 2003, 59(40):7939-7947.
[47] TANAKA T, MINE C E, WATARUMI S, et al.Accumulation of epigallocatechin quinone dimers during tea fermentation and formation of theasinensins[J].Journal of Natural Products, 2002, 65(11):1582-1587.
[48] NARAI-KANAYAMA A, KAWASHIMA A, UCHIDA Y, et al.Specificity of tyrosinase-catalyzed synthesis of theaflavins[J].Journal of Molecular Catalysis B:Enzymatic, 2016, 133:S452-S458.
[49] LI L, CUI Y Q, WEN M C, et al.Molar ratio of (-)-epicatechin and (-)-epigallocatechin gallate determined their enzymatic oxidation products and color characteristics[J].Food Bioscience, 2024, 57:103480.
[50] 潘科, 沈强, 申东, 等. 红茶通氧发酵过程中发酵叶相变化分析[J]. 食品科学, 2014, 35(15): 198-201.PAN K, SHEN Q, SHEN D, et al. Changes in sensory and physico-chemical characteristics of tea leaves during aerobic fermentation for black tea[J]. Food Science, 2014, 35(15): 198-201.
[51] CHEN L, LIU F, YANG Y F, et al.Oxygen-enriched fermentation improves the taste of black tea by reducing the bitter and astringent metabolites[J].Food Research International, 2021, 148:110613.
[52] TO
OVI
J, MILOEVI Ž, MARKOVI S.Simulation of the UV/vis spectra of flavonoids[C].2015 IEEE 15th International Conference on Bioinformatics and Bioengineering (BIBE).IEEE, 2016:1-6.
[53] INO Y, YONEKAWA M, YUZAWA H, et al.Workflow for practical quantum chemical calculations with a quantum phase estimation algorithm:Electronic ground and π-π* excited states of benzene and its derivatives[J].Physical Chemistry Chemical Physics, 2024, 26(48):30044-30054.
[54] DING Y P, GAO Z J, JIAN J J, et al.Effective enzymatic synthesis of benzotropolone and formation mechanism of its bicyclo [3.2.1] octane-type intermediate[J].Asian Journal of Organic Chemistry, 2023, 12(9):e202300327.
[55] JIAN J J, GAO Z J, DING Y P.Efficient enzymatic synthesis of theaflavin and its production mechanism[J].Journal of Food Science, 2024, 89(3):1531-1539.
[56] GAO Z J, AN J L, DIAO Z H, et al.Synthesis of purpurogallin-formic acid ester derivatives and their formation mechanism[J].Tetrahedron, 2025, 172:134457.