中国传统发酵食品历史悠久、品类丰富,其历史可追溯至约公元8000年[1],涵盖酒制品、米面制品、豆制品、蔬菜制品、乳制品、肉制品、茶制品等[2],这些传统食品的风味形成与品质提升高度依赖发酵过程中微生物群落及其所产酶系的作用。扣囊覆膜酵母(Saccharomycopsis fibuligera),又名扣囊复膜孢酵母,是我国传统酿造体系中的核心微生物,能够高效分泌蛋白酶、淀粉酶、β-葡萄糖苷酶等多种功能酶类,在酒类、酱油、豆酱等发酵食品的品质提升中发挥着关键作用[3]。在传统酿造过程中,蛋白酶促进蛋白质降解生成风味前体肽段,淀粉酶驱动淀粉糖化为发酵提供底物[4],β-葡萄糖苷酶则通过释放糖苷键结合态香气物质显著增强产品风味层次,因此提升这3种酶系的活力,对于改善传统发酵食品原料利用率、风味品质与产品稳定性具有重要实践意义。

目前,针对扣囊覆膜酵母的研究主要集中在产酶特性筛选及发酵应用方面,例如王茜等[5]通过筛选出一株具有高糖化酶活性的扣囊覆膜酵母与其他微生物进行复配制作清香型拟大曲,有效改善酒体的口感,提升酒体品质;CHEN等[6]发现在传统米酒发酵中,扣囊覆膜酵母通过调控发酵体系内多种酶活性及代谢通量,促进风味前体的生成与转化,从而整体优化风味特征;杨克胜等[7]利用扣囊覆膜酵母进行麦麸固态发酵,显著提高了麦麸的可溶性膳食纤维含量和总抗氧化活性。然而,尽管应用研究取得了一定进展,但对其产酶调控机制,尤其是多酶系在转录水平上的调控网络缺乏系统解析,制约了针对传统发酵应用的精准菌种选育与工艺优化。真菌产酶调控涉及转录调控、转录后调控以及代谢网络整合调控等多层次复杂系统[8-9],已有研究表明,环境因素如pH值变化能够引起该酵母全局基因表达谱的重塑,进而影响水解酶的产生和菌体显微形态转换[10]。然而,除pH外是否存在其他关键调控因子,以及不同水解酶基因表达之间是否存在互作关系,尚待深入探讨。

转录组测序(RNA-seq)技术作为挖掘微生物产酶相关调控基因的有效手段,能够通过比较不同产酶能力菌株的基因表达差异,系统揭示代谢途径中的关键调控节点及其代谢调控网络[11]。基于此,本研究采用转录组学技术系统解析扣囊覆膜酵母蛋白酶、淀粉酶和β-葡萄糖苷酶的调控机制,重点挖掘酶活性相关的差异表达基因(differentially expressed gens,DEGs),并特别关注在3种酶活性调控中共同发挥作用的核心调控因子。研究结果将深化对扣囊覆膜酵母产酶调控机制的认识,为选育适用于中国传统发酵食品工业的高性能菌株提供理论依据与分子靶点,从而推动我国传统发酵产业的技术升级。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 菌株

本研究所用扣囊覆膜酵母菌株均从传统发酵制品米酒、酒曲中分离,保藏于本公司微生物菌种资源库。

1.1.2 化学试剂

酵母浸粉(FM 888)、蛋白胨(FP 328)、蔗糖,安琪酵母股份有限公司;纤维二糖、海藻糖、葡萄糖、可溶性淀粉、MgSO4·7H2O、(NH4)2SO4、Na2HPO4、NaH2PO4,国药集团化学试剂有限公司;琼脂,上海惠兴生化试剂有限公司;无水乙醇,郑州派尼化学试剂厂;H2SO4、NaOH、乳酸、盐酸、乙酸,西陇科学股份有限公司;酵母基因组DNA快速抽提试剂盒,生工生物工程(上海)股份有限公司;Rapid Taq Master Mix、FastPure Complex Tissue/Cell Total RNA Isolation Kit,南京诺唯赞生物科技股份有限公司;BioZues® Ⅲ All-in-One 1 st Strand cDNA Synthesis Kit、2×BioZues® HS Taq Universal SYBR Green qPCR Master Mix,百力格生物科技(上海)股份有限公司;琼脂糖,上海贝晶生物技术有限公司。

1.1.3 培养基

YPD液体培养基(g/L):葡萄糖20、蛋白胨20、酵母提取物10,pH值自然,115 ℃高压蒸汽灭菌20 min。

YPD固体培养基(g/L):葡萄糖20、蛋白胨20、酵母提取物10,琼脂20,pH值自然,115 ℃高压蒸汽灭菌20 min。

蛋白酶诱导培养基(g/L):脱脂奶粉20,葡萄糖20、蛋白胨20、酵母提取物10,pH值自然,115 ℃高压蒸汽灭菌20 min。

淀粉酶诱导培养基(g/L):可溶性淀粉20,葡萄糖20、蛋白胨20、酵母提取物10,pH值自然,115 ℃高压蒸汽灭菌20 min。

β-葡萄糖苷酶诱导培养基(g/L):纤维二糖20,葡萄糖20、蛋白胨20、酵母提取物10,pH值自然,115 ℃高压蒸汽灭菌20 min。

1.2 仪器与设备

YXQ-100A型蒸汽灭菌锅,上海博迅医疗生物仪器股份有限公司;ME4002E型分析天平,瑞士METTLER TOLEDO公司;SKJH-1109型超净工作台,上海苏坤实业有限公司;CX43型光学显微镜,日本OLYMPUS公司;PTC-100型PCR仪,美国MJRESEARCH公司;SPX-II300型生化培养箱,上海跃进医疗器械有限公司;DL-5200B-II型离心机,上海安亭科学仪器厂;SkyHigh型酶标仪、NanoDrop2000型超微量分光光度计,美国赛默飞公司;SP-752型紫外可见分光光度计,上海光谱仪器有限公司;CFX96型实时荧光定量系统,伯乐生命医学产品(上海)有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 菌株分离与纯化

吸取1 mL米酒、1 g酒曲样品分别溶于9 mL无菌生理盐水中,获得10-1稀释度的稀释液,按此操作依次制备10-2、10-3、10-4、10-5、10-6稀释度的稀释液,涂布于YPD固体培养基,30 ℃培养24～48 h,观察平板上菌落形态。挑取具有典型酵母菌落特征的菌落,在YPD固体培养基上划线培养,纯化2次后,获得纯化菌株于-80 ℃保存,后续进行分子鉴定。

1.3.2 菌株鉴定

提取酵母菌基因组,以ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′),ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGAT-ATGC-3′)为引物,PCR程序为94 ℃预变性5 min,94 ℃变性30 s,55 ℃退火45 s,72 ℃延伸60 s,30个循环,最后72 ℃延伸10 min,用于扩增ITS基因序列,经琼脂糖凝胶电泳检测并委托武汉擎科生物技术有限公司进行测序。将测序结果提交至NCBI的GenBank数据库,采用BLAST进行同源性比对。

1.3.3 酶活性测定

将保藏于-80 ℃甘油管的菌株划线接种于YPD固体培养基,于30 ℃培养箱中培养24 h。挑取单菌落接种于5 mL YPD液体培养基试管中,置于30 ℃、180 r/min摇床中培养至对数生长中期(OD600=1.5)。以1%的接种量分别接种于5 mL蛋白酶诱导培养基、淀粉酶诱导培养基和β-葡萄糖苷酶诱导培养基,30 ℃、180 r/min培养48 h,用于酶活性测定。蛋白酶活性采用Folin-酚法测定[12],淀粉酶活性采用DNS法测定还原糖[13],β-葡萄糖苷酶活性采用对硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷(p-nitrophenyl-β-D-glucopyranoside,PNPG)法测定[14]。

1.3.4 样品测序及转录组分析

将待测菌株接种于各产酶诱导培养基30 ℃、180 r/min培养48 h。8 000 r/min、4 ℃离心5 min,用无菌水洗涤2次后,弃上清液,收集菌体转移至进口冻存管中,立即转入液氮中速冻,样本送至苏州金唯智生物科技有限公司进行转录组测序。原始测序数据经过质量控制,使用Trimmomatic (v0.39)去除接头序列和低质量reads(Q<20)。使用HISAT2 (v2.2.1)将clean reads比对到扣囊覆膜酵母参考基因组。使用StringTie (v2.1.5)进行转录本组装和基因表达量化,获得每百万转录本数(transcripts per million,TPM)值。DEGs分析采用DESeq2 (v1.30.1),筛选标准为|log2FC|>2且padj<0.05。使用clusterProfiler (v3.18.1)进行GO功能富集和KEGG通路分析。

1.3.5 RT-qPCR验证

以扣囊覆膜酵母ACTIN1为内参基因,选取15个关键调控基因进行RT-qPCR验证。使用Primer 5.0设计特异性引物,序列如表1所示,引物序列由武汉擎科生物技术有限公司合成。以测序同批次的菌体为样本,使用FastPure Complex Tissue/Cell Total RNA Isolation Kit试剂盒提取总RNA,要求质量浓度大于100 ng/μL,A260/280在2.0～2.2。使用BioZues® Ⅲ All-in-One 1 st Strand cDNA Synthesis Kit反转录试剂盒合成cDNA,使用2×BioZues® HS Taq Universal SYBR Green qPCR Master Mix配制20 uL RT-qPCR体系,反应程序为:95 ℃预变性30 s,95 ℃变性10 s,60 ℃退火及延伸30 s,40个循环,所有实验均设置3个生物学平行。

2 结果与分析

2.1 菌株鉴定

经分离纯化后获得27株菌株,菌落形态呈乳白色奶酪状,表面干燥,中央轻度隆起,边缘呈锯齿状并伴随放射状丝状突起;挑取典型菌落制片,于40倍物镜下观察,显微形态为椭圆形,大小约(3～8) μm×(2～6) μm,呈多极出芽,部分细胞形成发达的有隔菌丝结构。经琼脂糖凝胶电泳检测及测序后,与GenBank上序列进行Blast分析比对,序列相似性大于99%为同一物种,结合形态分析及分子鉴定,该27株菌株均为扣囊覆膜酵母(Saccharomycopsis fibuligera),保藏至-80 ℃。

2.2 酶活性测定

对扣囊覆膜酵母菌株进行蛋白酶、淀粉酶和β-葡萄糖苷酶活性筛选,结果如图1所示,其中蛋白酶活性范围为14.3～222.5 U/mL,淀粉酶的活性范围为16.9～180.2 U/mL,β-葡萄糖苷酶的活性范围为23.6～249.2 U/L,体现出较大的表型多样性。优选以上3个不同酶系的高产酶菌株为实验组,以低产酶菌株作为对照,每个组别均设3个生物学平行,以保障数据的可靠性与统计效力。

2.3 转录组质控分析

18个酵母样本的转录组测序原始数据质控统计如表2所示。每个样本获得3.9×107～5.4×107条reads、数据量为5.7～8.0 Gb碱基,总平均长度147.8 bp,满足差异表达分析所需深度[15];Q20为99.0%～99.4%,Q30为96.4%～97.3%,显著高于建议阈值Q30≥85%,测序误差率低于0.1%。GC含量为39.5%～40.6%,相较于该种属基因组平均GC(38.5%)处于正常浮动范围,无GC偏倚。N碱基含量为0.032%～0.053%,远低于常规0.5%上限[16],所有质控参数均符合标准。

2.4 表达量差异分析

利用NCBI数据库和UniProt/Swiss-Prot蛋白质数据库对所有转录本进行功能注释;随后对同一基因产生的多拷贝冗余结果进行合并,最终鉴定出6 500条具有可靠注释信息的基因。以TPM≥1作为表达量过滤阈值,采用 DESeq2(v1.40.2)进行差异表达分析(|log2FC|≥2,FDR<0.05)。显著性差异表达基因(differentially expressed genes,DEGs)的统计结果如图2所示,3组比较组共筛选出2 828个DEGs,其中蛋白酶比较组发生上调基因有217个,下调基因有1 945个;淀粉酶比较组发生上调基因有210个,下调基因有163个;β-葡萄糖苷酶比较组发生上调基因有147个,下调基因有146个。

2.5 GO富集分析

蛋白酶DEGs的GO富集分析结果见图3-a,在生物学过程(biological process,BP)类别中,DEGs显著富集于胞质翻译、跨膜运输、细胞壁组织合成等过程;在细胞组成(cellular component,CC)类别中,DEGs显著富集于细胞质、线粒体、细胞膜等结构;在分子功能(molecular function,MF)类别中,DEGs显著富集于核糖体结构组成、跨膜转运蛋白活性、序列特异性DNA结合等功能。

淀粉酶DEGs的GO富集分析结果见图3-b,在BP类别中,DEGs显著富集于尿酸盐分解、细胞黏附、有机含氮化合物分解等过程;在CC类别中,DEGs显著富集于核小体、液泡、转录因子TFIID复合体等结构;在MF类别中,DEGs主要富集于甘油醛-3-磷酸脱氢酶(磷酸化)活性、蛋白质异二聚化活性、DNA结合等功能。

β-葡萄糖苷酶DEGs的GO富集分析结果见图3-c,在BP类别中,DEGs显著富集于纤维素分解、细胞壁组织合成、细胞黏附等过程;在CC类别中,DEGs显著富集于胞外区域、细胞壁、细胞表面等结构;在MF类别中,DEGs显著富集于脱氨酶活性、内切多聚磷酸酶活性、葡萄糖内切-1-3-β-D-葡萄糖苷酶活性等功能。

基于GO富集结果的交叉分析表明,3种酶系相关菌株均显著富集于细胞壁组织合成过程,这一共同特征揭示细胞壁的结构与功能强化是扣囊覆膜酵母实现高酶活性的一个关键共性策略。细胞壁可能通过为酶提供锚定位点、优化底物接触效率等方式,为酶的高效催化提供重要的空间与结构支持。

2.6 KEGG富集分析

以P<0.05为显著性阈值,筛选得到显著富集的30条KEGG通路,按照富集丰度(富集丰度=GeneRatio /BgRatio,GeneRatio表示差异基因集中注释到某个通路的基因数目与总差异基因数目的比值;BgRatio表示背景基因集中注释到该通路的基因数目与总背景基因数目的比值)排序绘制气泡图。

蛋白酶KEGG富集分析结果见图4-a,DEGs在糖基磷脂酰肌醇(glycosyl phosphatidyl inositol,GPI)锚定生物合成、MAPK信号通路、赖氨酸生物合成、淀粉和蔗糖代谢、线粒体自噬等通路中显著富集。MAPK信号通路极显著富集表明环境感知与应激响应在蛋白酶合成过程中发挥核心调控作用。GPI锚定生物合成和自噬途径同步富集,表明细胞可能通过优化膜定位机制及增强蛋白质周转以维持高效的蛋白酶分泌能力。此外,淀粉和蔗糖代谢通路富集反映了碳源代谢与氮源代谢之间存在协同调控关系,该现象与酿酒酵母中的相关研究结果一致[17]。综合分析表明,扣囊覆膜酵母蛋白酶的产酶机制涉及许多与蛋白质合成、加工相关通路,可能影响整体蛋白稳态网络,并对细胞自噬和细胞周期等多种生命过程产生影响。

淀粉酶KEGG富集分析结果见图4-b,DEGs在角质、木栓质和蜡质生物合成、维生素B6代谢、氮代谢、丙酸代谢、丙酮酸代谢、糖酵解/糖异生、柠檬酸循环等通路中显著富集,其中,较高富集丰度的糖酵解/糖异生通路可以直接利用淀粉酶水解淀粉产生的葡萄糖分子,因此这些中心碳代谢通路对可溶性糖的持续需求是淀粉酶合成的关键诱导信号,促进了扣囊覆膜酵母分泌高活性淀粉酶以维持代谢流平衡。同时,ABC转运通路的协同富集促进酵母细胞激活糖类物质摄取,从而形成正向反馈调控环路,持续驱动下游糖代谢过程。综合分析表明,扣囊覆膜酵母淀粉酶的产酶机制与中心碳代谢和能量代谢网络密切相关。

β-葡萄糖苷酶KEGG富集分析结果见图4-c,DEGs在角质、木栓质和蜡质生物合成、氮代谢、长寿调控、牛磺酸和亚牛磺酸代谢等通路中显著富集。特别地,内吞作用的富集表明细胞膜结构与物质转运方式可能发生变化,同时,泛酸与辅酶A生物合成与C5支链二羧酸代谢通路富集进一步表明,细胞膜形态的变化可能引起能量代谢途径的适应性改变。此外,牛磺酸与亚牛磺酸代谢及过氧化物酶体通路富集也表明脂质代谢伴随着氧化还原稳态的调整。综合分析表明,扣囊覆膜酵母β-葡萄糖苷酶的产酶机制与细胞膜结构及物质转运方式调控密切相关,进而引起能量代谢和氧化还原平衡的系统性响应。

此外,蛋白酶、淀粉酶、β-葡萄糖苷酶的DEGs共同富集于15个代谢通路中,例如MAPK信号通路、氮代谢、核糖体、氨基酸合成、长寿调控等关键通路,其中长寿调控通路在3种酶组中均具有较高的富集丰度和基因数量。已有研究表明,该通路能够协同调控酿酒酵母细胞寿命与蛋白质合成过程[18],据此推测,扣囊覆膜酵母可能存在该类调控机制,即同步调控细胞生理状态与蛋白质合成以支持高产酶需求。此外,O-聚糖生物合成通路在β-葡萄糖苷酶与淀粉酶组中特异性富集,表明糖基化修饰对β-葡萄糖苷酶和淀粉酶的酶活性具有重要影响。

2.7 关键调控基因分析

为系统性解析不同产酶类型的基因遗传调控特征,对蛋白酶、淀粉酶及β-葡萄糖苷酶3组DEGs进行了交叉分析,由图5可知,淀粉酶组与β-葡萄糖苷酶组存在106个共同基因,而蛋白酶组与淀粉酶组存在19个共同基因,与β-葡萄糖苷酶存在15个共同基因。尤为关键的是,3组存在13个共同DEGs,推测其为支撑多种酶合成的核心遗传基础,参与扣囊覆膜酵母产酶过程中的共性调控机制。

结合GO和KEGG通路富集结果,根据DEGs的Log2FC变化倍数,从3种酶独有的DEGs中共筛选出12个显著上调和下调的基因,结果如表3所示。这些基因在各自的产酶组中具有最显著的变化,对调控相关酶合成代谢起到关键作用。

在蛋白酶组中,上调基因TAL1作为戊糖磷酸代谢途径的关键基因,其表达增强有助于提供充足的NADPH与糖磷酸骨架,为蛋白质合成与正确折叠提供必需的还原力及前体物质;同时,蛋白质翻译因子基因SUI1A上调与翻译延伸因子基因TEF1下调,共同参与了对蛋白质翻译过程的精细调控,优化了核糖体功能与mRNA的翻译效率;此外,下调基因NCE102作为参与跨膜运输的非分泌蛋白,其表达抑制暗示蛋白质分泌更依赖于经典Sec/COPII路径,从而增强分泌效率与目标蛋白的定向转运。上述差异表达基因共同说明扣囊覆膜酵母产蛋白酶的关键机制涉及蛋白质翻译折叠调整与分泌模式改变。

在淀粉酶组中,上调基因GPH1与FRP1协同增强了胞内能量循环,促进ATP的快速生成,从而为淀粉酶的高效合成与分泌提供能量保障;与此同时,下调基因PMM1与ACS1分别抑制N-糖基化前体供应和乙酰辅酶A的同化过程,该调控模式可以减少其他糖基化代谢支路对碳源的消耗,促进碳代谢更多的导向糖酵解途径,以支持淀粉酶合成所需的前体与能量供应。上述差异表达基因共同说明,扣囊覆膜酵母产淀粉酶的关键机制涉及ATP生成体系并重构糖代谢流向,实现了能量供给与碳源分配的系统性优化。

在β-葡萄糖苷酶组中,上调基因 SAR1与PLO1分别参与内质网中蛋白质加工和细胞形态调控,二者协同高表达有助于提升蛋白分泌通量与胞外释放效率;下调基因ATG4,为细胞自噬的关键基因,其显著下调可以减少分泌蛋白的胞内周转,储存更多能量与膜物质资源分配用于分泌表达;此外,下调基因BET2影响囊泡运输,进一步优化分泌路径效率。上述差异表达基因共同说明,扣囊覆膜酵母产β-葡萄糖苷酶的关键机制涉细胞形态结构变化与囊泡运输过程调控,实现了分泌能力的整体提升。

除了上述12个特异产酶DEGs外,本研究对3个产酶组共同表达的13个DEGs进行深入分析,如表2所示,结果显示这些基因主要参与RNA加工与翻译调控(NUP57、MRPL25、RRP36、DBP9、LSM3)、能量代谢(MRPL25、CYC3)、信号传导(CMD1、WOR3)及碳源利用(PCEST)等过程。表达模式分析表明,多数基因在蛋白酶和淀粉酶组中普遍上调,而在β-葡萄糖苷酶组中呈下调趋势,推测蛋白酶和淀粉酶的高效表达依赖于核心转录翻译效率与能量代谢的协同增强,而β-葡萄糖苷酶的表达可能通过适度抑制上述过程以适配其特有的代谢分流需求。特别地,钙调蛋白基因CMD1在蛋白酶组和淀粉酶组中显著下调,在β-葡萄糖苷酶组中显著上调,结合已有研究报道,在其他微生物中钙信号通过钙调磷酸酶-Crz1信号通路调控多种酶活性[19],因此,扣囊覆膜酵母可能存在类似机制,可通过CMD1介导的钙调磷酸酶-Crz1信号通路调控多种水解酶活性[20]。

2.8 RT-qPCR验证

选取12个特异产酶DEGs和3个共同DEGs(PCD1、CMD1、PCEST),共计15个基因进行RT-qPCR验证。如图6所示,以15个基因在RT-qPCR的结果为X轴,在转录组测序中的差异倍数为Y轴,二者的相关系数R2为0.860 8,结果表明15个DEGs的RT-qPCR表达趋势与转录组测序的结果基本一致,证实了本试验转录组的测序数据具有较高的可靠性。

3 结论与讨论

扣囊覆膜酵母作为中国传统发酵体系中的核心菌种,在酿酒、酱制品等食品发酵中发挥着关键作用。目前,关于扣囊覆膜酵母产酶分子机理,特别是不同酶系间调控网络的异同仍缺乏深入解析。

本研究系统探究了扣囊覆膜酵母产蛋白酶、淀粉酶、β-葡萄糖苷酶的产酶机制,旨在揭示其共同调控策略与酶系特异性代谢适应路径。结果表明,蛋白酶组共得到显著差异基因2 162个,其中上调基因217个,下调基因1 945个;淀粉酶组共得到显著差异基因373个,其中上调基因210个,下调基因163个;β-葡萄糖苷酶组共得到显著差异基因293个,其中上调基因147个,下调基因146个;3组产酶组DEGs数量的差异揭示了3种酶在高产状态下对细胞全局调控需求截然不同,蛋白酶合成涉及差异基因数量多,且下调基因占主导,表明该过程通过广泛抑制与目标非直接相关的生命活动(如部分基础代谢,细胞周期等),实现细胞内资源的再分配,以节省资源并全力保障蛋白酶的合成。而淀粉酶和β-葡萄糖苷酶合成涉及的差异基因数量相对较少且上下调基因数量较为均衡,则表明其高产更侧重于对特定代谢通路的精准优化,无需引发细胞状态的大幅重构,反映出更为高效的靶向调控策略。

GO及KEGG富集分析反映出3种水解酶调控网络呈现“共性基础-特性分支”的架构。3种酶共享一个基础调控框架,MAPK信号通路作为环境感知的核心模块,协调细胞对外界条件的响应;氮代谢和氨基酸合成提供前体物质基础;核糖体生物合成和翻译机制确保蛋白质合成能力;长寿调控通路则通过平衡细胞生理状态与代谢需求来维持长期产酶能力。这一共性网络由13个核心基因支撑,其中包括参与RNA加工与翻译调控的NUP57基因等,能量代谢相关的CYC3基因等,以及信号传导相关的CMD1基因等,共同构成了扣囊覆膜酵母高效产酶的分子基础。

此外,各酶系展现出特异的调控策略,蛋白酶合成以“前提供给-翻译调控-分泌输出”链式调控为核心:在合成起始阶段,TAL1基因上调增强磷酸戊糖途径,为后续蛋白质合成提供必需的NADPH和核糖-5-磷酸等关键前体物质;随后,基因SUI1A上调和TEF1下调形成协同调控,SUI1A作为翻译起始因子促进蛋白质合成的启动,而TEF1下调则可能通过减缓延伸速率确保翻译准确性,二者共同优化了从基因到蛋白质的转化效率;最后,基因NCE102下调改变细胞分泌模式,增强蛋白酶的分泌效率。

淀粉酶合成以能量代谢和碳流调控为核心:首先通过上调GPH1、FRP1基因,增强糖原磷酸化酶和果糖-1,6-二磷酸酶的活性,加速糖原分解和糖异生途径,显著提升ATP生成效率,为淀粉酶合成提供充足能量;随后,通过下调PMM1、ACS1基因分别抑制磷酸甘露糖变位酶和乙酰辅酶A合成酶的活性,既减少了糖基化修饰对碳源的消耗,又降低了乙酰辅酶A合成对丙酮酸的竞争性利用,从而将碳代谢流优先导向糖酵解途径,确保了葡萄糖-6-磷酸等关键前体物质的高效供给,为淀粉酶的大量合成提供了充足的底物支持。

β-葡萄糖苷酶合成以膜系统结构重塑为核心:首先,通过上调SAR1基因表达,增强内质网-高尔基体间囊泡出芽能力,为β-葡萄糖苷酶的转运提供充足的分泌载体;同时上调PLO1基因,促进细胞壁与膜结构的协同重塑,优化分泌微环境;随后,通过下调ATG4基因的表达,减少自噬过程对膜脂质的消耗,将有限的膜物质资源优先分配给β-葡萄糖苷酶分泌途径;同步下调BET2基因则调控囊泡运输关键蛋白的异戊二烯化修饰,优化运输效率;这一系列相互衔接的调控共同构建了一个独特的分泌体系,显著提升了β-葡萄糖苷酶的胞外转运效率。

基于本研究,未来可在以下方面开展深入探索:对挖掘获得的关键调控基因进行系统的功能验证,通过基因编辑技术阐明其在产酶网络中的具体作用机制;建立基于分子靶点的选育技术体系,通过筛选具有目标基因表达谱的菌株,开发适用于高蛋白、高淀粉、高纤维原料的专用菌株,提升不同原料体系的发酵效率;这些研究将有力推动我国传统发酵产业从经验导向向精准选育的转型升级,为提升传统食品品质和产业竞争力提供科技支撑。

参考文献

[1] 班世栋, 张建星, 宗春阳, 等.从传统发酵食品到大健康食品:功能微生物的新机遇[J].中国酿造, 2025, 44(6):8-13.BAN S D, ZHANG J X, ZONG C Y, et al.From traditional fermented foods to health-focused foods:New opportunities in functional microorganism[J].China Brewing, 2025, 44(6):8-13.

[2] 陈坚, 汪超, 朱琪, 等.中国传统发酵食品研究现状及前沿应用技术展望[J].食品科学技术学报, 2021, 39(2):1-7.CHEN J, WANG C, ZHU Q, et al.Research status and application prospect of frontier technology of traditional fermented food in China[J].Journal of Food Science and Technology, 2021, 39(2):1-7.

[3] 姚粟, 王鹏辉, 白飞荣, 等.中国传统发酵食品用微生物菌种名单研究(第二版)[J].食品与发酵工业, 2022, 48(1):272-285.YAO S, WANG P H, BAI F R, et al.Research on the inventory of microbial food cultures in Chinese traditional fermented foods (2nd edition)[J].Food and Fermentation Industries, 2022, 48(1):272-285.

[4] 孙雅芳, 张静洁, 郭天芬, 等.一株高产淀粉酶扣囊复膜酵母的生理特性研究[J].中国酿造, 2024, 43(10):118-123.SUN Y F, ZHANG J J, GUO T F, et al.Physiological characteristics of a high amylase-producing Saccharomycopsis fibuligera[J].China Brewing, 2024, 43(10):118-123.

[5] 王茜, 陈晖, 何国庆, 等.高产糖化酶的扣囊复膜酵母菌株筛选及其在清香型白酒酿造中的应用[J].酿酒科技, 2024(12):71-76.WANG Q, CHEN H, HE G Q, et al.Screening and application of Saccharomycopsis fibuligera strains with high-yield of saccharifying enzyme[J].Liquor-Making Science &Technology, 2024(12):71-76.

[6] CHEN L C, DAI J W, SHU Y, et al.Effects of Saccharomycopsis fibuligera on the formation of flavor substances and functional enzymes during turbid rice wine brewing[J].International Journal of Food Microbiology, 2025, 439:111238.

[7] 杨克胜, 王沛, 董华, 等.扣囊复膜酵母Y11固态发酵对麦麸理化特性的影响[J].南京农业大学学报, 2023, 46(2):377-386.YANG K S, WANG P, DONG H, et al.Effects of solid-state fermentation with Saccharomycopsis fibuligera Y11 on physicochemical properties of wheat bran[J].Journal of Nanjing Agricultural University, 2023, 46(2):377-386.

[8] TANAKA M.Transcriptional and post-transcriptional regulation of genes encoding secretory proteins in Aspergillus oryzae[J].Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry, 2024, 88(4):381-388.

[9] ZHANG T, LIU H, LYU B, et al.Regulating strategies for producing carbohydrate active enzymes by filamentous fungal cell factories[J].Frontiers in Bioengineering and Biotechnology, 2020, 8:691

[10] FARH M E, ABDELLAOUI N, SEO J A.pH changes have a profound effect on gene expression, hydrolytic enzyme production, and dimorphism in Saccharomycopsis fibuligera[J].Frontiers in Microbiology, 2021, 12:672661.

[11] CELTON M, SANCHEZ I, GOELZER A, et al.A comparative transcriptomic, fluxomic and metabolomic analysis of the response of Saccharomyces cerevisiae to increases in NADPH oxidation[J].BMC Genomics, 2012, 13(1):317.

[12] CUPP-ENYARD C.Sigma’s non-specific protease activity assay-casein as a substrate[J].Journal of Visualized Experiments, 2008(19):899.

[13] ZULFIQAR S, BLANDO F, ORFILA C, et al.Chromogenic assay is more efficient in identifying α-amylase inhibitory properties of anthocyanin-rich samples when compared to the 3, 5-dinitrosalicylic acid (DNS) assay[J].Molecules, 2023, 28(17):6399.

[14] YAN F Y, XIA W, ZHANG X X, et al.Characterization of β-glucosidase from Aspergillus terreus and its application in the hydrolysis of soybean isoflavones[J].Journal of Zhejiang University:Science B, 2016, 17(6):455-464.

[15] CONESA A, MADRIGAL P, TARAZONA S, et al.A survey of best practices for RNA-seq data analysis[J].Genome Biology, 2016, 17(1):13.

[16] ENDRULLAT C, GLÖKLER J, FRANKE P, et al.Standardization and quality management in next-generation sequencing[J].Applied &Translational Genomics, 2016, 10:2-9.

[17] BROACH J R.Nutritional control of growth and development in yeast[J].Genetics, 2012, 192(1):73-105.

[18] KAEBERLEIN M, POWERS R W 3rd, STEFFEN K K, et al.Regulation of yeast replicative life span by TOR and Sch9 in response to nutrients[J].Science, 2005, 310(5751):1193-1196.

[19] OSHIQUIRI L H, PEREIRA L M S, MAUÉS D B, et al.Regulatory role of vacuolar calcium transport proteins in growth, calcium signaling, and cellulase production in Trichoderma reesei[J].Journal of Fungi, 2024, 10(12):853.

[20] THEWES S.Calcineurin-Crz1 signaling in lower eukaryotes[J].Eukaryotic Cell, 2014, 13(6):694-705.

Revealing the enzyme production mechanism of Saccharomycopsis fibuligera based on transcriptomic analysis

GUO Tianfen1,2, LYU Yang1,2, ZHANG Jingjie1,2, ZHANG Yan1,2,3, SUN Yafang1,2,3*

1(Angel Yeast Co.Ltd., Yichang 443000, China)

2(Hubei Key Laboratory of Yeast Function, Yichang 443000, China)

3(National Key Laboratory of Agricultural Microbialogy, Yichang 443000, China)

ABSTRACT Saccharomycopsis fibuligera is an important microorganism in Chinese traditional fermentation systems, renowned for its exceptional enzyme production capabilities.This study used transcriptomics technology to systematically analyze the enzyme production mechanisms of protease, amylase, and β-glucosidase.The results revealed that 2 162 DEGs were identified in the proteasome group;373 DEGs were identified in the amylase group;293 DEGs were identified in the β-glucosidase group.GO and KEGG enrichment analysis indicated that the regulation of the three enzyme systems exhibited a “common basic characteristic branch” regulatory pattern.The MAPK signaling pathway, nitrogen metabolism, ribosomes, amino acid synthesis and longevity regulation constitute the basis of a common regulatory network.At the specific level, protease expression relies on the synergistic enhancement of protein synthesis, processing and secretion pathways;amylase expression is closely linked to the central carbon metabolism and energy metabolism network;while β-glucosidase expression emphasizes the reconstruction of cell membrane structure and transport system.The study provides theoretical foundations and molecular targets for developing industrial strains capable of degrading protein, starches, and cellulose.It contributes to improve raw material utilization, enhance product flavor quality, and promotes technological advancements within China’s traditional fermentation industry.

Key words Saccharomycopsis fibuligera;transcriptome;protease;amylase;β-glucosidase

DOI：10.13995/j.cnki.11-1802/ts.044809

引用格式：郭天芬,吕阳,张静洁,等.基于转录组学分析揭示扣囊覆膜酵母产酶机制研究[J].食品与发酵工业,2026,52(13):46-55.GUO Tianfen, LYU Yang, ZHANG Jingjie, et al.Revealing the enzyme production mechanism of Saccharomycopsis fibuligera based on transcriptomic analysis[J].Food and Fermentation Industries,2026,52(13):46-55.

第一作者：硕士,中级工程师(孙雅芳正高级工程师为通信作者,E-mail:sunyf@angelyeast.com)

基金项目：湖北省自然科学基金项目(2024AFD168)

收稿日期：2025-10-14,改回日期:2025-12-10