棉籽油营养丰富,富含亚油酸和维生素E[1]。棉籽毛油需经过精炼加工,主要包括脱胶、脱酸、脱色、脱臭等工序以去除磷脂、脂肪酸、糖类、色素、棉酚等杂质后才能制成成品油[2]。脱胶是油脂精炼过程中的一步重要工序,油脂脱胶不达标,不仅影响油脂加工效果,还会影响成品油的贮存期[3]。常规脱胶方法主要有水化法、酸法、超滤法、吸附法、超临界法等。近年来,酶法脱胶技术因具有环保、节能、脱胶完全和得油率高等特点,在油脂精炼行业应用潜力大[4]。然而,现有脱胶酶的最适温度常介于40～55 ℃之间,与油脂精炼工艺中的温度条件(80 ℃)不匹配[5]。因此,挖掘适用于高温连续脱胶的脱胶酶对油脂精炼工业有重要应用价值。
疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶(Thermomyces lanuginosus lipase,TLL)因具有底物专一性强、酶活性高等特点,广泛应用于洗涤剂、精细化工、油脂加工、生物柴油等领域[6]。TLL与尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)脂肪酶C端融合的融合蛋白形成了磷脂酶活性高的磷脂酶PLA1,其广泛用于各种植物油的脱胶工艺研究中[7]。然而,TLL的最适温度仅为40 ℃,且高温(50～70 ℃)条件下热稳定性不佳,限制了其在油脂精炼工业中的大规模应用,TLL的热稳定性改造也因此成为研究的热点问题[8]。OKAMURA等[9]利用分子动力学模拟技术获取TLL的突变热点,并利用定点突变技术获得了半衰期提高6.7倍的突变体(A28S);HUANG等[10]利用FuncLib和Rosetta cartesian_ddg组合策略进行多点突变获得熔解温度(Tm)提高10.53 ℃的突变体M11。尽管TLL的分子改造已取得较多进展,TLL的热稳定性仍不能满足当前工业应用要求。
近年来,一种基于分子进化推演出现有酶的祖先酶的祖先酶序列重建技术(ancestral sequence reconstruction, ASR)成功用于挖掘高稳定性和高催化活性的新型催化剂[11-12]。该技术在时间尺度上统计氨基酸的变化规律,不仅扩大了酶分子改造中的序列搜索空间,也为极端酶的探索提供了一条新路径。研究表明,与现存酶相比,祖先酶常具有更高的热稳定性和催化底物混杂性[12-13]。WANG等[14]利用祖先酶序列重建和分子动力学模拟组合策略成功获得一极端腈水解酶。MA等[15]以嗜热玫瑰红球菌(Thermomicrobium roseum)脂肪酶为研究对象,通过对其祖先酶空间结构的分析和设计,成功改造了该脂肪酶的底物偏好。本研究针对TLL的热稳定性问题,利用祖先酶重建技术挖掘TLL的祖先酶序列,对祖先酶序列进行异源表达和酶学表征,并探究祖先酶在棉籽毛油脱胶中的应用潜力,以期获得热稳定性好和脱胶性能高的脱胶酶。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 菌株和质粒
菌株和质粒:TLL和祖先酶基因序列由生工生物工程(上海)股份有限公司合成;质粒pET-21a、表达宿主Escherichia coli BL21(DE3),生工生物工程(上海)股份有限公司。质粒测序由生工生物工程股份(上海)有限公司进行。
1.1.2 化学试剂
硝基苯基辛酸酯(p-nitrophenyl octanoate, pNP-C8)、对硝基苯基癸酸酯(p-nitrophenyl decanoate, pNP-C10)、对硝基苯基月桂酸酯(p-nitrophenyl laurate, pNP-C12)、对硝基苯基肉豆蔻酸酯(p-nitrophenyl myristate, pNP-C14)、对硝基苯基棕榈酸酯(p-nitrophenyl palmitate, pNP-C16),北京索莱宝科技有限公司。限制性内切酶Hind Ⅲ、Nde I,大连TaKaRa公司。棉籽毛油由本实验室保存。其他试剂均为分析纯。
1.2 培养基
LB培养基(g/L):酵母粉5、胰蛋白胨10、NaCl 10。含氨苄青霉素(ampicillin, Amp)的培养基中AMP终质量浓度为100 μg/mL。
1.3 实验方法
1.3.1 祖先酶序列重建和序列分析
参考MA等[15]、LI等[16]的方法。首先,以TLL为查询序列,从NCBI reference protein数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov)、PDB数据库(https://www.rcsb.org)和UniProt数据库(https://www.uniprot.org)中获得相似序列(identity >30%、coverage > 40%);去除预测蛋白、未表征蛋白和长度差异较大的蛋白质,并结合酶的活性中心的保守性、各种属中序列不重复等条件,去除序列信号肽后[17](SignalP-6.0,https://services.healthtech.dtu.dk/services/SignalP-6.0),最终获得来自不同物种的相似序列用于祖先酶序列重建。其次,应用MEGA 7.0对蛋白质序列进行多序列比对,选择最大似然法和JTT氨基酸替代模型构建系统进化树。最后,利用PAMLX和EasyCodeML进行祖先酶序列的重建,获得关键节点的祖先酶氨基酸序列[18]。TLL和祖先酶的一级结构分析利用在线工具Expasy(https://web.expasy.org/protparam)进行,蛋白序列的多重比对结果利用ESPript 3.0(https://espript.ibcp.fr/ESPript/ESPript)进行修饰[19]。酶分子中二硫键预测利用在线DbD2服务器(http://cptweb.cpt.wayne.edu/DbD2/index.php)进行[10]。
1.3.2 祖先酶的表达、纯化及SDS-PAGE
TLL和祖先酶基因序列经密码子优化后,由生工生物工程股份(上海)有限公司构建重组质粒和基因工程菌。将基因工程菌划线于含Amp抗性的固体培养基上,于恒温培养箱(37 ℃)中倒置培养8 h,挑取单菌落接种至含Amp抗性的LB液体培养基中,于恒温摇床(37 ℃、180 r/min)中活化培养8 h,然后以1%的体积比例转接至新的含Amp抗性的LB液体培养基中。当培养液OD600值为0.6时,加入IPTG(终浓度0.1 mmol/L),并在16 ℃、180 r /min下诱导培养12 h。
将诱导后的菌液转移至离心管中,4 ℃、5 000 r/min离心20 min后,弃去上清液,收集菌体沉淀。然后,在菌体沉淀中加入预冷的NTA-0(0 mmol/L咪唑、50 mmol/L Tris-HCl、pH 8.0)缓冲液,并振荡混匀。将菌悬液于冰浴中进行超声波破碎,超声波破碎仪条件设定:开3 s、关3 s,总循环时间为5 min。细胞破碎后,离心(4 ℃、10 000 r/min、10 min)分离细胞碎片。离心后的上清液用Ni-NTA层析柱进行亲和层析纯化。纯化步骤:先将上清液加入Ni-NTA层析柱上,然后分别用NTA-30(30 mmol/L咪唑、50 mmol/L Tris-HCl、pH 8.0)、NTA-60(60 mmol/L咪唑、50 mmol/L Tris-HCl、pH 8.0)、NTA-100(100 mmol/L咪唑、50 mmol/L Tris-HCl、pH 8.0)缓冲液洗涤层析柱,用NTA-200 (200 mmol/L咪唑,50 mmol/L Tris-HCl,pH 8.0) 缓冲液洗脱重组蛋白并收集洗脱液。最后,收集得到的蛋白质溶液在NTA-0缓冲液中透析4 h以去除咪唑。纯化得到的蛋白质溶液利用Bradford方法测定蛋白质浓度[20],并用SDS-PAGE进行分析。
1.3.3 酶学性质测定
1.3.3.1 酶活力测定方法
参考杨文娟[19]的方法。首先,将各种不同碳链长度的对硝基苯酚脂肪酸酯(p-NP酯)分别溶于乙腈,配制成终浓度为100 mmol/L的底物溶液。2 mL的反应体系中含1 880 μL Tris-HCl 缓冲液(50 mmol/L)、80 μL无水乙醇、20 μL p-NP脂肪酸酯和20 μL稀释酶液。对照组反应体系中的酶液部分用缓冲液替代。测定反应时,反应体系先在反应温度下预热3 min,然后,加入20 μL稀释的酶液并开始计时,反应5 min后,于冰上终止反应。利用分光光度法测定反应体系中反应产物-对硝基苯酚的含量(OD410)。脂肪酶活力单位(U)定义为:在温度为40 ℃ 和pH 8.5条件下,每分钟产生1 μmol 对硝基苯酚所需的酶量。
1.3.3.2 最适温度
以对硝基苯月桂酸酯(pNP-C12)为底物和Tris-HCl缓冲液(50 mmol/L, pH 8.0)配制反应体系,将反应体系分别置于30、35、40、45、50 ℃水浴锅中预热3 min,然后加入纯化酶液,反应5 min后终止反应,测定OD410值。
1.3.3.3 最适pH测定
以对硝基苯月桂酸酯(pNP-C12)为底物,用不同pH的缓冲液配制反应体系。所用缓冲液为:磷酸盐缓冲液(50 mmol/L, pH 7.0、7.5、8.0)、Tris-HCl缓冲液(50 mmol/L, pH 8.5)、甘氨酸-NaOH缓冲液(50 mmol/L, pH 9.0)。在最适温度条件下,测定酶在各种pH缓冲液中的酶活性。将最适pH条件下的酶活力定义为100%。
1.3.3.4 温度稳定性测定
按1.3.3.1节配制反应体系。测定反应前,先将各种重组酶分别于50、60、70、80 ℃水浴锅中进行热处理。50、60、70 ℃温度处理时,每隔1 h取样测定重组酶热处理后的残余酶活力。80 ℃温度处理时,每隔15 min取样测定重组酶热处理后的残余酶活力。酶活力的测定均在酶的最适温度和最适pH条件下进行。将酶的初始活力定义为100%。
1.3.3.5 底物特异性和酶动力学参数测定
分别以不同碳链长度的对硝基苯酚脂肪酸酯为底物与Tris-HCl缓冲液(50 mmol/L, pH 8.5)配制反应体系。反应体系在40 ℃条件下预处理3 min,然后加入重组酶,反应5 min。反应结束后,迅速冰浴并测定OD410值。依据重组酶对不同碳链长度的对硝基苯酚脂肪酸酯的酶活力确定其最适底物。
以不同终浓度(0.1、10、20、40、80 mmol/L)的对硝基苯基月桂酸酯(pNP-C12)为底物,利用Tris-HCl缓冲液(50 mmol/L, pH 8.5)配制反应体系,测定重组酶在最适反应条件下的酶活力,并利用双倒数作图法计算其动力学参数(kcat, Km和kcat/Km)。
1.3.4 祖先酶的分子动力学模拟和分子对接
利用AlphaFold2(https://neurosnap.ai)对祖先酶进行蛋白质建模。利用Gromacs 2024.3软件包进行分子动力学模拟,力场选择AMBER99SB,将酶蛋白置于立体水盒子中,利用Na+和Cl-平衡系统电荷。随后,利用最陡下降法对系统进行1 000步的能量最小化。系统分别在300 K和350 K温度条件下进行200 ps的位置限制性分子动力学模拟,然后系统分别在300 K和350 K温度条件下进行100 ns的生产分子动力学模拟。模拟结束后,利用软件包自带的分析程序对结果文件进行多种参数的分析,如均方根偏差(root mean square deviation, RMSD)、均方根涨落(root mean square fluctuation, RMSF)、回旋半径(radius of gyration, Rg)和氢键数目等[16]。利用Autodock进行分子对接,LigPlus用于分析酶分子与底物间的相互作用[19]。利用PyMOL和Origin 2024软件对数据进行可视化和作图。
1.3.5 祖先酶的脱胶应用研究
参考张泽栋[2]的方法。先称取15 g棉籽毛油,加入15 μL 450 g/L的柠檬酸溶液,利用磁力搅拌器搅拌(75 ℃、500 r/min)30 min。然后将温度降低至脱胶反应温度(40 ℃和70 ℃),利用40 g/L的NaOH溶液调节反应体系的pH至酶的最适pH,再加入去离子水使其体积分数为3%和150 U纯化酶液。在搅拌条件下反应1～8 h,每隔 1 h终止反应,并于90 ℃水浴锅中灭活10 min。随后,高速离心(11 000 r/min, 20 min)收集上层油相,并于烘箱中烘干水分。最后,取脱水后的油相测定磷含量。油脂中的磷含量分析方法按照GB/T 5537—2008《粮油检验 磷脂含量的测定》进行。
2 结果与分析
2.1 脂肪酶TLL的祖先酶序列重建
以TLL脂肪酶为查询序列在3种数据库中进行序列搜索,获得1 000条相似序列。根据1.3.1中的序列筛选和处理后,保留71条来自不同物种的相似序列用于系统进化树构建,最终获得了8种TLL祖先酶氨基酸序列(ASR75、ASR76、ASR77、ASR102、ASR107、ASR108、ASR109和ASR110)(图1)。酶蛋白的氨基酸组成与其热稳定性有关。有研究表明,酶蛋白的氨基酸组成可用于嗜热酶、中温酶和嗜冷酶的分类。HUANG等[21]基于酶蛋白的氨基酸组成,选择AAC和DPC进行特征编码后,利用机器学习中的支持向量机模型对嗜热酶、中温酶和嗜冷酶进行了分类预测,准确率达76.1%。祖先酶与TLL的氨基酸组成比较分析发现:祖先酶和TLL中的酸性氨基酸(B、D、E、N、Q、Z)比例、非极性氨基酸(G、A、V、L、I)比例未发生较大变化,而含硫氨基酸(C、M)比例和碱性氨基酸(K、R、H)比例却发生较大变化,祖先酶中含硫氨基酸比例显著提高,而碱性氨基酸显著降低,其中ASR75中的含硫氨基酸占比为3.35%,是TLL中含硫氨基酸占比的1.5倍;ASR110中碱性氨基酸占比为5.95%,是TLL中碱性氨基酸占比的59%(表1)。祖先酶中含硫氨基酸含量的增高可能与早期地球的环境有关[22]。DbD2二硫键分析显示:TLL中含有3对二硫键(C22-C268、C36-C41和C104-C107),这些二硫键在ASR102、ASR107、ASR108、ASR109和ASR110中也存在,而在ASR75和ASR76中,还新增了1对二硫键(C238-C246)。有研究表明,二硫键的引入可增加酶蛋白的热稳定性[10]。
表1 TLL和祖先酶的序列分析
Table 1 Amino acid sequence analysis of TLL and ancestral enzymes
一致性/%非极性氨基酸(G、A、V、L、I)/%芳香氨基酸(F、W、Y)/%含S氨基酸(C、M)/%碱性氨基酸(K、R、H)/%酸性氨基酸及其酰胺(B、D、E、N、Q、Z)/%羟基氨基酸(S、T)/%相对分子质量/kDa等电点TLL100.0038.2910.782.2310.0420.8213.3829.3165.00ASR7544.6133.839.673.359.6721.9317.4729.3364.87ASR7649.8138.2910.043.357.8118.9618.2228.6264.60ASR7750.9239.4110.042.978.1819.3316.3628.7074.73ASR10253.1640.528.922.237.8118.5917.8428.4695.01ASR10756.8841.648.922.237.0620.0715.9928.5064.60ASR10859.1141.648.922.236.3219.7017.4728.4144.49ASR10966.5438.6610.042.235.5820.8218.9628.4334.20ASR11070.6338.669.672.235.9520.4519.3328.4404.22
图1 TLL的祖先酶挖掘
Fig.1 Ancestral enzyme mining using TLL as a probe enzyme
注:红色分支-为TLL;红色节点-祖先酶(ASR75、ASR76、ASR77、ASR102、ASR107、ASR108、ASR109和ASR110)。
序列相似性分析结果显示:酶分子间亲缘关系的远近与序列间差异的大小正相关,如亲缘关系较远的祖先酶ASR75与TLL的序列一致性仅为44.61%,而亲缘关系较近的祖先酶ASR110与TLL的序列一致性为70.63%(表1),该结果也表明,祖先酶序列重建技术可获得氨基酸序列变化大的蛋白质序列,为酶资源挖掘提供更广阔的序列搜索空间。近年来,在人工智能技术的驱动下,蛋白质结构生成模型(RFdiffusion)和蛋白质序列生成模型(ProteinMPNN)在蛋白质设计和挖掘新酶源方面表现出较大潜力[23]。多序列比对结果显示:TLL和祖先酶的催化三联体均位于S146、D201和H258,且氧阴离子洞区域也非常保守,位于G82和S83,这些关键位点在酶分子进化过程中非常保守,决定着酶分子的催化功能(图2)。多序列比对结果也显示:在酶分子的269个氨基酸位点中,有76个位点存在3种以上氨基酸残基多样性(图2)。利用AlphaFold2获得了8种祖先酶序列的三级结构。经空间结构比对分析发现,祖先酶ASR75、ASR76、ASR77、ASR102、ASR107、ASR108、ASR109、ASR110与TLL空间结构的RMSD分别为0.900、0.897、0.859、0.686、0.735、0.688、0.511、0.489,该结果表明,尽管祖先酶和TLL在一级结构上差异较大,但这些酶分子的空间结构差异不大(图3),说明酶分子的空间结构与其催化功能密切相关,酶分子的空间结构比一级结构更为保守。
图2 TLL与祖先酶的序列对比
Fig.2 Amino acid sequence alignment of TLL with ancestral enzymes
注:▲-代表催化三联体;●-代表氨基酸种类多于3种的位点。
图3 TLL与祖先酶的空间结构对比
Fig.3 Comparison of the spatial structure between TLL and ancestral enzymes
2.2 祖先酶的异源表达与纯化
为进一步验证祖先酶的催化功能,8种祖先酶基因序列和TLL基因序列均进行了基因工程菌的构建和异源表达。实验结果表明,TLL和祖先酶在低温(16 ℃)诱导表达时,均能获得较好的表达量。Ni-NTA亲和层分离纯化获得重组蛋白后,SDS-PAGE分析显示:TLL和各种祖先酶重组蛋白的大小均与理论大小一致(图4)。尽管这些酶蛋白的氨基酸总数相同,但因氨基酸组成差异较大,因而它们在分子质量大小上表现出一定差异(表1)。SDS-PAGE结果显示,分离纯化后的蛋白质条带单一,说明纯化后得到的酶蛋白纯度高,可用于后续酶学性质分析。
M-蛋白Marker;1-重组TLL;2-重组ASR75;3-重组ASR76;4-重组ASR77;5-重组ASR102;6-重组ASR107;7-重组ASR108;8-重组ASR109;9-重组ASR110。
图4 纯化后的重组TLL和祖先酶的SDS-PAGE分析
Fig.4 SDS-PAGE analysis of recombinant TLL and ancestral enzymes
2.3 祖先酶的最适温度、最适pH和温度稳定性
真核生物在进化过程中可能经历从嗜热生活方式向中温生活方式的转变,因而与现存酶相比,祖先酶可能有更高的温度稳定性,对酶的温度特征的研究可辅助推断祖先生物的生活环境[22]。如图5-a所示,TLL的最适温度为40 ℃。在祖先酶中,温度对ASR109酶活性的影响较大,随着温度升高,其活性呈下降趋势。其余祖先酶和TLL类似,温度曲线呈钟罩型,最适温度均为40 ℃。上述结果显示,TLL的祖先酶可能长期适应于40 ℃左右的环境,推断TLL的祖先可能来自一株中等嗜热菌,其最适生长温度在40 ℃左右。
a-温度;b-pH
图5 温度和pH对TLL和祖先酶活性的影响
Fig.5 Impact of temperature and pH on the catalytic activity of TLL and ancestral enzymes
如图5-b所示,pH对酶活性的影响曲线均呈钟罩型,如ASR110在pH 7.0时,相对酶活力为54.40%;在pH 7.5时,相对酶活力为88.35%;在pH 8.0时,其表现出最大催化活性;当pH 8.5时,相对酶活力下降至56.84%,当pH值达到9.0时,其相对酶活力仅为28.71%。上述结果表明,TLL和祖先酶对pH变化敏感,在应用中应严格控制反应pH,使其为酶的最适pH以充分发挥酶的催化能力。此外,在最适pH方面,ASR75、ASR76、ASR77的最适pH均为 pH 8.5;TLL、ASR102、ASR107、ASR108、ASR109、ASR110的最适pH均为pH 8.0。该结果表明,祖先酶与TLL在最适pH方面存在较小差异,这种差异可能与蛋白质氨基酸组成中碱性氨基酸含量的变化有关[24]。尽管如此,它们的最适pH均在碱性范围内,属碱性水解酶类,因而在洗涤剂行业具有一定应用价值[25]。
如图6所示,在50 ℃条件下,TLL和祖先酶在温度处理12 h后,它们的残余相对酶活力均保持在70%以上,说明它们在50 ℃条件下具有较好的温度稳定性(图6-a);在60 ℃条件下,TLL、ASR107、ASR109和ASR110在处理12 h后均能保持85%以上的残余酶活力,而其他酶的残余酶活力均随着处理时间的延长而快速下降,其中ASR77和ASR108的相对酶活力下降最为显著(图6-b);在70 ℃条件下,ASR107、ASR109和ASR110在处理12 h后仍能保持80%以上的残余相对酶活力,ASR102在处理12 h后残余相对酶活力为45.11%,其他酶的残余相对酶活力均低于20%(图6-c);在80 ℃条件下,随着温度处理时间的延长,所有酶的残余酶活力均表现出快速下降,在该温度条件下处理30 min后,TLL、ASR75、ASR77和ASR108的残余相对酶活力均低于40%,ASR76和ASR102的残余酶活力低于60%(图6-d),而ASR107、ASR109和ASR110在该温度处理1 h后,残余相对酶活力仍在60%以上。以上结果表明,ASR107、ASR109和ASR110在70 ℃时表现出较高的温度稳定性,具有较好的应用潜力。
a-50 ℃;b-60 ℃;c-70 ℃;d-80 ℃
图6 温度对TLL和祖先酶稳定性的影响
Fig.6 Effect of temperature on the thermostability of TLL and ancestral enzymes
2.4 祖先酶的底物特异性和动力学参数
以5种碳链长度不同的对硝基苯基脂肪酸酯为底物,测定TLL和祖先酶的底物特异性,测定结果如图7所示。由图7-a可知,TLL的最适底物为pNP-C12,为中长链底物的脂肪酶。在祖先酶中,ASR75对pNP-C12和pNP-C14的催化活性较高,ASR76、ASR77和ASR108对pNP-C12和pNP-C16有较高的催化活性,ASR102、ASR107、ASR109和ASR110对pNP-C16表现出较高的催化活性。酶分子活性中心的底物结合位点中残基的空间排布、侧链长度和疏水性影响酶分子的底物选择性和特异性。另有研究表明,酶分子中的底物通道是影响酶与底物识别的重要因素,酶分子中的远端区域残基也可调节酶分子的底物特异性[26]。TLL与祖先酶的底物选择性和特异性存在差异。如2.1节所述,尽管TLL和祖先酶在整体空间结构上相差不大,它们在底物选择性上的差异与其活性中心的结构、底物通道特征等因素有关。此外,有研究表明,与现存酶相比,祖先酶可能表现出更高的底物混杂性[12]。因此,TLL和祖先酶的底物谱差异可进一步深入研究。
a-TLL;b-ASR75;c-ASR76;d-ASR77;e-ASR102;f-ASR107;g-ASR108;h-ASR109;i-ASR110
图7 TLL和祖先酶对不同碳链长度的对硝基苯酚酯的催化活性
Fig.7 Catalytic activity of TLL and the ancestral enzymes towards p-nitrophenyl esters with different chain lengths
此外,根据 Linewear-Burk双倒数作图法测得TLL和祖先酶的动力学参数。由表2可知,TLL对pNP-C12的Km值为 3.49 mmol/L,与TLL相比,祖先酶对pNP-C12的Km均明显升高,表明祖先酶对pNP-C12的亲和力下降,说明更早时期的祖先酶可能偏好于其它底物。在酶的转换数方面,TLL对pNP-C12的kcat值为0.428 s-1,祖先酶ASR75、ASR76、ASR102、ASR107、ASR108和ASR109对pNP-C12的kcat值均低于TLL对pNP-C12的kcat值,而ASR77和ASR110对pNP-C12的kcat值分别是TLL对pNP-C12的kcat值的1.76倍和2.26倍,该结果说明,与TLL相比,ASR77和ASR110具有更高的催化能力。在酶的催化效率指数(kcat/Km)方面,TLL的kcat/Km值为122.62×103 L/(s·mol),祖先酶在催化效率指数上均显著低于TLL,其中,ASR110的催化效率指数最大,但仅为TLL催化效率指数的44.94%。
表2 TLL和祖先酶的动力学参数
Table 2 Kinetic parameters of TLL and ancestral enzymes
酶Km/(mmol/L)kcat/s-1kcat/Km/[L/(s·mol)]TLL3.490.428122.62×103ASR759.010.23526.08×103ASR7611.230.32629.02×103ASR7727.130.75527.82×103ASR1024.850.22746.80×103ASR1074.330.13932.10×103ASR1086.270.13221.05×103ASR1098.950.11312.62×103ASR11018.070.99655.11×103
分子对接结果显示,pNP-C12与TLL和ASR110的结合自由能分别为-6.9 kcal/mol和-5.4 kcal/mol,且TLL与pNP-C12结合时形成的氢键数量(3个)多于ASR110与pNP-C12结合时形成的氢键数量(1个)(图8),该结果表明,酶分子与底物结合时形成的氢键数量与酶分子的催化效率正相关。此外,由图8-b和图8-d可知,TLL和ASR110中均有12个不同位点的氨基酸残基参与底物(pNP-C12)的结合,且其中5个位点的氨基酸残基(S83、W89、N92、L93和H110)相同。ASR77也表现出类似特征,尽管在转换数(kcat)上,ASR77是TLL的1.76倍,但其对pNP-C12的亲和力(Km)显著下降,是TLL对pNP-C12亲和力的12.9%。因此,ASR77和ASR110的催化效率指数下降的原因均来自其对底物亲和力的下降,因而后续可针对底物亲和力特征方面进行分子改造以提高它们的催化性能。最后,TLL、ASR75、ASR76、ASR77、ASR102、ASR107、ASR108、ASR109和ASR110对pNP-C12的比活力分别为:430.12、83.36、105.75、97.06、81.27、124.70、49.89、76.64、178.33 U/mg。
a-TLL与pNP-C12的分子对接,蓝色结构为pNP-C12,棕色区域底物结合口袋;b-TLL与pNP-C12的相互作用,绿色虚线代表氢键;c-ASR110与pNP-C12的分子对接,蓝色结构为pNP-C12,棕色区域为底物结合口袋;d-ASR110与pNP-C12的相互作用,绿色虚线代表氢键
图8 TLL和祖先酶ASR与pNP-C12的分子对接
Fig.8 Molecular docking of TLL and ancestral enzyme ASR with p-NP-C12
2.5 祖先酶的热稳定性机制
上述温度稳定性测定结果表明,ASR107、ASR109和ASR110在70 ℃时具有很好的温度稳定性。近年来,分子动力学模拟在阐明蛋白稳定性机制方面发挥了重要作用[14]。针对TLL和8种祖先酶,进行了300 K和350 K温度下的分子动力学模拟对比分析。由表3可知,ASR107、ASR109和ASR110的平均RMSD值均显著低于TLL。RMSD是量化蛋白质构象热波动程度的关键参数,蛋白质的热稳定性与其RMSD值呈负相关,即RMSD值越低,其结构刚性越强,稳定性则越高[12]。分子动力学模拟数据表明ASR107、ASR109、ASR110比TLL具有更好的热稳定性,与实验结果一致。
表3 TLL和祖先酶的分子动力学模拟中的RMSD变化
Table 3 RMSD variation of TLL and ancestral enzymes in molecular dynamics simulation
酶RMSD_300KRMSD_350KRMSD_300K_30 nsRMSD_350K_30 nsTLL0.127 7800.141 7470.131 6670.152 416ASR750.180 8360.199 2920.189 5860.195 714ASR760.207 0730.226 5050.227 2070.257 264ASR770.181 4600.201 1820.185 3700.203 462ASR1020.149 7520.180 8710.160 4330.199 156ASR1070.118 0640.139 8820.124 0410.145 823ASR1080.115 0520.153 0860.115 2770.177 177ASR1090.121 8060.134 6950.125 2250.150 543ASR1100.097 8300.146 2910.109 6430.138 167
因ASR110具有最优的热稳定性和比活力,为阐明ASR110的热稳定性机制,将TLL和ASR110的RMSD和RSMSF进行比较分析。如图9-a所示, TLL和ASR110在300 K时RMSD的波动均较小,但ASR110的RMSD平均值(0.098 nm)明显低于TLL的RMSD均值(0.128 nm)。RMSD反映酶分子构象的整体位移情况,由此表明,ASR110在300 K的整体刚性强于TLL,因而具有更高的稳定性。当温度为350 K时(图9-b),TLL和ASR110的RMSD均发生显著变化,但RMSD的均值分别为0.141 nm和0.146 nm。TLL在80 ns后,RMSD值发生较大变化,而ASR110在60 nm后RMSD趋于稳定。取70～100 ns 的RMSD数据进行比较分析显示,ASR110的平均RMSD(0.138 nm)明显低于TLL(0.152 nm),进一步说明ASR110比TLL刚性更强,因而具有更高的温度稳定性。
a-300 K的RMSD;b-350 K的RMSD;c-300 K的RMSF;d-350 K的RMSF
图9 TLL与ASR110的分子动力学模拟分析
Fig.9 MD simulation analysis of TLL and ASR110
RMSF可反映模拟过程中氨基酸残基的波动情况,较大的RMSF值提示该处氨基酸残基具有较高的柔性[13, 27]。如图9-c和图9-d所示,通过RMSF的对比分析,在300 K和350 K条件下,ASR110中这些区域:残基22～35、残基130～136、残基160～163和残基188～192的RMSF值显著低于TLL,推测该区域的氨基酸残基在提升酶的热稳定性方面发挥了更重要的作用。上述区域的序列比对分析发现:ASR110在上述区域内发生了较多的丝氨酸替换(G23S、D130S、N162S和T188S)。丝氨酸为羟基氨基酸,丝氨酸的引入有利于ASR110在局部区域形成更多的氢键。分子动力学模拟过程中的氢键数量统计显示:TLL和ASR110在300 K时形成的氢键平均数量为213和210,在350 K时形成的氢键平均数量均为210。该结果说明,TLL和祖先酶在300 K和350 K时,氢键数量均未发生显著变化,说明氢键不是维持其温度稳定性的主要原因。现有研究表明,多种因素影响蛋白质的温度稳定性,如氢键数量、离子键、二硫键、脯氨酸含量等,不同酶分子的温度稳定性的主要影响因素各不相同,因而组合策略在提高酶分子稳定性上成功率高[15]。
2.6 祖先酶的脱胶性能分析
在常规的酶法脱胶工艺中,脱胶前需将高温促溶的毛油温度(通常为85 ℃)降低至酶的最适温度,当酶法脱胶结束后,又需将油温提升至80 ℃,以离心去除残留的胶。该工艺流程中的温度不连续性,增加了操作成本和能耗。高温连续脱胶不仅节省时间和能耗,还能降低黏度、促进混合、提高得油率[5]。因祖先酶ASR110具有较好的热稳定性和比活力,因此,选择ASR110用于棉籽毛油的脱胶,探究了其在植物油脱胶应用中的潜力。首先,通过单因素试验获得了该酶的最适脱胶条件:加水量体积分数3%、pH 8.0、加酶量150 U,温度40 ℃。实验结果表明:在最适反应条件下,脱胶反应4 h后,TLL和ASR110将棉籽毛油的残磷量分别降至6.30 mg/kg和4.66 mg/kg,脱胶率分别为92%和94%(图10)。为探究ASR110在高温连续脱胶中的应用潜力,测定了ASR110在70 ℃时的脱胶能力。结果显示:当脱胶温度为70 ℃时,反应 8 h后,ASR110仍能将棉籽毛油的残磷量降至8.52 mg/kg,且脱胶率在90%以上,满足植物油精炼工艺中残磷量的要求(<10 mg/kg)。以上结果说明,ASR110具有较好的脱胶效果,并具备在高温连续脱胶应用中的潜力。
a-40 ℃条件下脱胶油的残磷量;b-40 ℃条件下的脱胶率;c-70 ℃条件下脱胶油的残磷量;d-70 ℃条件下的脱胶率
图10 TLL和祖先酶的脱胶效果
Fig.10 Degumming effect of TLL and ancestral enzymes
3 结论
高温连续脱胶工艺可节约能耗、提高生产效能,因而挖掘热稳定性好的脱胶酶具有重要应用价值。本研究以具有脱胶优势TLL脂肪酶为探针模板,利用祖先酶序列重建技术获得了8种祖先酶序列(ASR75、ASR76、ASR77、ASR102、ASR107、ASR108、ASR109、ASR110)。酶学性质研究表明:ASR107、ASR109和ASR110在70 ℃条件下具有较高的温度稳定性,其中ASR110表现出最优的热稳定性和催化活性。分子动力学模拟分析显示祖先酶ASR110的刚性更高,局部氢键的增加可有利于提升其稳定性。
高温脱胶实验结果说明ASR110在高温脱胶中具有较好的应用潜力。本研究不仅在酶分子改造中进一步扩大了TLL的序列搜索空间,为植物油的高温连续脱胶提供了新的酶源,为也后续酶的分子改造提供了研究基础。
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