乳酸菌胞外多糖(exopolysaccharides,EPS)是乳酸菌产生并分泌到细胞外的一类高分子糖类聚合物。根据其与细菌表面的黏附关系,可分为释放型多糖(released polysaccharide,RPS)和荚膜型多糖(capsular polysaccharides,CPS)两类。RPS通常游离于培养基中,而CPS则紧密附着于细菌细胞壁表面[1]。近年来,由于EPS在改善食品质地与风味方面的独特优势,乳酸菌EPS已在食品工业中得到广泛应用[2]。然而,目前针对乳酸菌EPS的研究多集中于RPS,对CPS的理化性质及功能活性的探讨仍十分有限[3]。
衰老是一种贯穿生命全过程的不可逆生理过程,与个体寿命密切相关。其特征为生理功能的渐进性衰退,包括形态完整性破坏、生理能力下降以及功能稳态失衡[4]。尽管衰老的分子机制尚未完全阐明,但大量研究提示氧化应激是驱动该过程的核心因素。当机体防御功能减弱时,易导致活性氧(reactive oxygen species,ROS)的产生与积累,破坏原有的氧化还原平衡,进而引发各类慢性疾病、造成机体损伤并加速衰老进程[5-6]。目前,针对ROS清除的干预手段已被证实可恢复机体氧化稳态,从而延缓衰老并减轻年龄相关病理改变[7]。然而,化学合成抗氧化剂因可能引起肝肾毒性及胃肠功能紊乱等不良反应,使其应用受到一定限制[8]。相比之下,天然多糖具有良好的生物相容性与低毒性特点,因而在抗衰老及相关氧化应激疾病防治方面展现出良好的应用潜力。
秀丽隐杆线虫具有寿命短、易培养及与人类遗传高度保守等特点,已成为研究膳食成分抗衰老作用的经典模型[9]。目前已有多种多糖被报道具有延长线虫寿命的作用,例如YUAN等[10]发现黄连多糖可通过清除ROS并减少脂褐素积累来延长线虫寿命;黄花菜多糖也显示出良好的抗衰老效果[11]。然而,关于乳酸菌CPS抗衰老作用的研究仍鲜有报道。
本研究从发酵粘液乳杆菌S1菌株中分离纯化CPS-3,解析其分子质量、单糖组成等基本结构特征;进一步通过测定线虫的寿命、抗应激能力以及ROS和脂褐素积累等指标,系统评价CPS-3的抗衰老活性以期为乳酸菌CPS-3作为抗衰老活性成分的开发与应用提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
发酵粘液乳杆菌(Limosilactobacillus fermentum)S1分离自富源酸菜[12]。N2野生型秀丽隐杆线虫及大肠杆菌OP50来自美国线虫遗传中心。线虫生长培养基(nematode growth medium,NGM)和M9缓冲液参照WANG等[1]的方法配制。线虫于23 ℃下,在涂有大肠杆菌OP50菌膜的NGM平板上培养。其传代与同期化操作参照高永娇等[13]的方法进行。
发酵培养基配制参考WANG等[12]的方法进行。溶菌酶、5-氟尿嘧啶,美国Sigma公司;DEAE-Cellulose 52,英国Whatman公司;LB肉汤,青岛海博生物技术有限公司。胆固醇、考马斯亮蓝、乙醇、NaOH等药品均为国产分析纯。
1.2 仪器与设备
BS-160F自动部分收集器,上海精科实业有限公司;HL-2B数显恒流泵,上海沪西分析仪器厂有限公司;1260 infinity II高效液相色谱仪、7820A-5977B气质联用仪,安捷伦科技有限公司;凝胶渗透色谱/尺寸排阻色谱(gel permeation chromatography/size exclusion chromatography,GPC/SEC)分析仪、OMNISEC REVEAL三重检测器,英国马尔文仪器有限公司;UV-1100紫外可见分光光度计,上海凌析达仪器公司;AVANCE AV-500核磁共振(nuclear magnetic resonance,NMR)仪,瑞士布鲁克公司;MF52-N倒置荧光显微镜,广州明美光电技术有限公司。
1.3 实验方法
1.3.1 CPS的分离和纯化
CPS的提取参照WANG等[1]的方法进行。将S1菌株用发酵培养基在33 ℃下连续活化2次,随后于相同温度下发酵培养24 h。发酵液在4 ℃、8 000×g离心10 min,收集菌体并用8.5 g/L的NaCl溶液清洗2次后,用含20 μg/mL溶菌酶的磷酸盐缓冲液(10 mmol/L,pH 6.7)重悬,于37 ℃、140 r/min振荡孵育48 h,离心收集上清液。上清液经浓缩、醇沉、重溶、透析和冻干后获得粗CPS。
粗CPS进一步采用DEAE-52离子交换柱(26 mm×300 mm)进行纯化。以1 mL/min的流速依次用0、0.1、0.3 mol/L NaCl溶液进行梯度洗脱,并采用苯酚-硫酸法[14]监测多糖含量。将目标洗脱峰合并、浓缩、透析并冷冻干燥,最终获得纯化CPS组分。
1.3.2 分子质量与链构象分析
采用配备三重检测器(示差折光、光散射和毛细管黏度检测器)的GPC/SEC系统进行分子质量与链构象的分析。色谱条件:样品质量浓度2 mg/mL,流动相0.1 mol/L NaNO3,色谱柱Viscotek A6000M,柱温35 ℃,流速0.7 mL/min,进样体积150 μL。
1.3.3 化学组成分析
CPS-3的中性糖、蛋白质、硫酸基及糖醛酸含量依次采用苯酚-硫酸法、考马斯亮蓝法、氯化钡-明胶比浊法及间羟基联苯比色法进行测定[15]。
1.3.4 单糖组成分析
CPS-3经三氟乙酸完全水解后,采用1-苯基-3-甲基-5-吡唑酮进行衍生[3]。采用高效液相色谱系统分析其单糖组成。色谱柱为ODS-C18柱,柱温30 ℃,流动相0.1 mol/L磷酸盐缓冲液(pH 6.7)-乙腈(体积比为83∶17),流速0.9 mL/min,进样体积20 μL,检测波长245 nm。
1.3.5 甲基化和NMR分析
依据WANG等[1]的方法,对CPS-3依次进行完全甲基化、水解、还原及乙酰化处理。随后采用气质联用系统分析其糖苷键连接模式。色谱条件:进样量1 μL,分流比10∶1,载气为高纯He;柱温程序为初始140 ℃保持2 min,再以3 ℃/min升至230 ℃并维持3 min。
CPS-3(30 mg/mL,溶剂为D2O)的1H和13C NMR谱图在313 K下使用NMR仪(500 MHz)进行采集。
1.3.6 秀丽隐杆线虫体内抗氧化能力分析
同期化的L4期线虫转移至含不同质量浓度的CPS-3(0、40、80、160、320 μg/mL)及50 μmol/L 5-氟尿嘧啶的NGM/OP50平板上。23 ℃培养4 d并每日移至新鲜平板;随后收集线虫,清洗后于Chaps缓冲液中匀浆,离心取上清液作为待测样本。使用总抗氧化能力(total antioxidant capacity,T-AOC)与总超氧化物歧化酶(total superoxide dismutase,T-SOD)活性分析试剂盒进行抗氧化能力测定。
1.3.7 CPS-3对秀丽隐杆线虫的抗衰老活性分析
1.3.7.1 寿命测定
将同期化的L4期线虫转移至含不同质量浓度CPS(0、40、80、160 μg/mL),以及50 μmol/L 5-氟尿嘧啶的NGM/OP50平板上(每板约40条线虫),于23 ℃下培养。每个浓度设3个重复。每天将存活线虫转移至新鲜平板,并记录死亡个体数,直至全部死亡。
1.3.7.2 生殖能力测定
将5条同期化的L4期线虫置于含不同浓度CPS-3的NGM/OP50平板(不含5-氟尿嘧啶)上,23 ℃培养并每天转移至新鲜平板。每个浓度设3个重复。原平板继续孵育24 h,统计其孵化幼体数量作为前一日的产卵量。持续观察直至线虫停止产卵。
1.3.7.3 热应激与氧化应激耐受性评估
将CPS-3预处理4 d的线虫分为2组,分别进行热应激和氧化应激实验。热应激组转移至NGM平板并于35 ℃培养;氧化应激组转移至含15 mmol/L叔丁基过氧化氢的NGM平板,于23 ℃培养。每2 h记录死亡数直至全部死亡。每个浓度设3个重复,每重复约40条线虫。
1.3.7.4 咽泵率和运动能力测定
按照寿命分析条件进行线虫分组处理,分别于第0、3、6、9、12天测定线虫咽泵率和体弯频率。咽泵率以30 s内咽部泵动次数计算;体弯频率则以30 s内沿虫体纵轴传播的完整波形次数统计。各处理均设5个重复。
1.3.7.5 ROS和脂褐素水平分析
对照组(不加CPS-3)和处理组(添加160 μg/mL CPS)线虫培养8 d后,采用2′, 7′-二氯二氢荧光素二乙酸酯(2′, 7′-dichlorodihydrofluorescein diacetate,DCFHDA)荧光探针法测定线虫体内ROS水平[16]。将线虫与DCFHDA溶液室温避光孵育2 h。然后用M9缓冲液洗涤2次后制片。使用荧光显微镜在488 nm激发/525 nm发射波长下拍摄荧光图像,利用Image J软件对荧光强度进行定量。
脂褐素水平参照王猛等[17]的方法测定。收集线虫以2 mmol/L盐酸左旋咪唑溶液固定,转移至20 g/L琼脂糖凝胶垫。随后在荧光显微镜下于485 nm激发/530 nm发射波长进行成像,并利用Image J软件对荧光强度进行定量。
1.4 数据处理
所有数据采用SPSS 25.0软件进行单因素方差分析,组间P<0.05表明差异性显著。图形采用Origin 2021、SPSS 25.0和GraphPad Prism 9软件进行绘制。
2 结果与分析
2.1 CPS的分离与纯化
CPS的得率为0.135 g/L。经DEAE-52阴离子交换色谱分离,获得一个主要组分CPS-3和2个次要组分,CPS-1与CPS-2(图1)。基于其较高的得率,后续研究选取CPS-3进行结构与抗衰老活性研究。
图1 CPS的阴离子交换色谱图
Fig.1 Anion exchange chromatogram of CPS
2.2 分子质量及链构象
图2-a为CPS-3基于多检测器的GPC/SEC色谱图。其中,示差折光、直角光散射、小角度光散射及黏度检测信号分别以红、绿、黑、蓝色曲线表示。CPS-3的示差信号呈单一对称窄峰,表明样品均一性较好。CPS-3的数均分子质量(number-average molecular weight,Mn)、重均分子质量(weight-average molecular weight,Mw)和Z-均分子质量(Z-average molecular weight,Mz)分别为2.36×104、4.47×104、2.68×105 Da。其多分散指数(Mw/Mn)为1.90,表明分子质量分布较窄,分子大小较为均一。
a-CPS-3多检测信号图;b-CPS-3分子质量分布和Mark-Houwink曲线图
图2 CPS-3的GPC/SEC色谱图
Fig.2 GPC/SEC chromatogram of CPS-3
特性黏度[η]是反映聚合物链在溶液中流体力学行为的重要参数。对多糖而言,其[η]在给定溶剂体系中主要取决于分子质量,两者之间的关系符合Mark-Houwink方程(1)[18]:
[η]=K·Mvα
(1)
式中:Mv,黏均分子质量;K和α为Mark-Houwink-Sakurada常数,反映分子链的构象与形态。
对于分子质量分布较窄的样品,可采用Mw近似代替Mv。因此,对上述方程取对数后可得方程(2):
log[η]=logK+α·logMw
(2)
通过黏度检测器测得CPS-3的[η]为0.28 dL/g。基于Mark-Houwink曲线(图2-b),通过拟合Mw与[η]之间的双对数关系,得到CPS-3的logK与α值分别为-4.26和0.74。其中,α为该曲线的斜率,常作为判断聚合物链构象的参数。当α介于0.5～0.8时,聚合物通常呈无规卷曲构象[19]。因此,本研究中CPS-3在0.1 mol/L NaNO3溶液中以无规卷曲构象存在。
2.3 基本组成及单糖组成
基本组成分析表明,CPS-3的中性糖、蛋白质和硫酸基含量分别为94.09%、0.23%和0.74%,而糖醛酸未检出。
单糖组成分析(图3)表明,CPS-3主要由鼠李糖、葡萄糖和半乳糖构成,三者的物质的量比为1.00∶1.58∶12.39。这与发酵粘液乳杆菌GBJ和植物乳植杆菌70810 的CPS存在明显差异[1,15],表明乳酸菌CPS的单糖组成具有菌株特异性。
a-标准单糖;b-CPS-3
图3 单糖组成液相色谱图
Fig.3 Liquid chromatogram of monosaccharide composition
注:Man,甘露糖;Rha,鼠李糖;Glc,葡萄糖;Gal,半乳糖;Ara,阿拉伯糖。
2.4 甲基化分析
甲基化分析结果(表1)表明,CPS-3处理后生成的甲基化糖醇衍生物主要包括:3,4,6-三-O-甲基-鼠李糖醇;2,3,4,6-四-O-甲基-半乳糖醇;3,4,6-三-O-甲基-葡萄糖醇;2,4,6-三-O-甲基-半乳糖醇;3,4-二-O-甲基-葡萄糖醇及3,4-二-O-甲基-半乳糖醇,其物质的量为5.02∶11.49∶17.17∶51.94∶3.28∶11.10。该结果表明,CPS-3的主链主要由L-Rhap-(1→2),D-Glcp-(1→2),D-Galp-(1→3),D-Glcp-(1→2,6)和D-Galp-(1→2,6)残基连接构成,支链末端则以D-Galp-(1→)残基终止。这一推断与CPS-3的单糖组成分析结果相符。
表1 CPS-3的甲基化分析数据
Table 1 Methylation analysis data of CPS-3
保留时间/min甲基化糖残基碎片离子峰(m/z)物质的量比/%糖苷键类型9.4653,4,6-Me3Rhap59, 72, 89, 100, 115, 131, 160.1, 190.1, 211.15.02→2-L-Rhap-(1→10.6602,3,4,6-Me4Galp59, 75, 87, 102.1, 118, 129, 145, 161.1, 173.1, 205.111.49T-D-Galp-(1→13.3203,4,6-Me3Glcp71.1, 87, 101, 113.1, 129, 145, 161.1, 190.1, 205.117.17→2-D-Glcp-(1→13.6782,4,6-Me3Galp59, 74, 87, 101, 118, 129, 143.1, 161.1, 174.1, 203, 234.151.94→3-D-Galp-(1→19.1093,4-Me2Glcp59, 75, 87, 99, 117, 129, 162.1, 189.13.28→2,6-D-Glcp-(1→19.3013,4-Me2Galp75, 87, 99, 113.1, 129, 144, 159, 190.1, 233.111.10→2,6-D-Galp-(1→
2.5 NMR分析
NMR分析表明,CPS-3糖链同时含有α型和β型糖苷键。其1H NMR谱(图4-a)在4.5～5.2 ppm呈现的多重异头氢信号证实了这一点[1]。在对应的13C NMR谱(图4-b)中,δ 95 ～110 ppm及δ 60～85 ppm区间信号分别归属于异头碳及糖环上其他碳原子[15]。结合单糖组成、甲基化分析结果及相关文献[20-24],进一步推测13C NMR谱中异头碳信号δ 109.40、109.15、106.24、104.11、102.34、100.13、98.10 ppm,分别对应→2,6)-β-D-Galp-(1→、→2,6)-β-D-Glcp-(1→、β-D-Galp-(1→、→2)-β-D-Glcp-(1→、→3)-β-D-Galp-(1→、→2)-α-L-Rhap-(1→和→3)-α-D-Galp-(1→糖残基。以上结果表明,CPS-3糖链的主链主要由β-D-Galp-(1→2,6)、β-D-Glcp-(1→2,6)、β-D-Glcp-(1→2)、β-D-Galp-(1→3)、α-L-Rhap-(1→2)和α-D-Galp-(1→3)残基构成,其支链末端为β-D-Galp-(1→残基。
a-1H NMR谱图;b-13C NMR谱图
图4 CPS-3的1H和13C NMR谱图
Fig.4 1H and 13C NMR spectra of CPS-3
2.6 体内抗氧化活性
如表2所示,随着CPS-3浓度的增加,线虫体内T-AOC与T-SOD活性均先升高后降低。2项指标均在160 μg/mL时达到最高值,其中T-AOC为(22.99±2.09) U/mg蛋白,T-SOD为(56.02±1.35) U/mg蛋白,与对照组相比分别提高了176.99%和61.01%。然而,当质量浓度增至320 μg/mL时,二者均出现回落。基于此,本研究最终选取40～160 μg/mL的浓度范围,用于后续基于线虫模型的抗衰老实验。
表2 CPS-3对线虫体内T-AOC及T-SOD活性的影响
Table 2 Effects of CPS-3 on T-AOC and T-SOD activity in C.elegans
质量浓度/(μg/mL)T-AOC/(U/mg蛋白)提高率/%T-SOD/(U/mg蛋白)提高率/%08.30±0.76d—34.79±0.51d—4012.45±1.07c50.0043.51±0.57c25.048016.88±1.17b103.3747.90±1.10b37.6616022.99±2.09a176.9956.02±1.35a61.0132018.29±1.72b120.3646.52±0.50c33.70
注：同列不同字母表示差异显著(P<0.05);—表示无此计算项/不适用。
2.7 CPS-3的抗衰老活性
2.7.1 CPS-3对线虫寿命的影响
如图5所示,处理组线虫生存曲线整体右移,且偏移程度随CPS-3浓度增加而加大。具体而言,CPS-3以浓度依赖的方式延长了线虫的平均寿命。与对照组的8.89 d相比,40、80、160 μg/mL CPS-3处理可使线虫寿命分别达到9.22、9.73、10.60 d,最大提升幅度为19.24%,表现出显著的延寿效果。多种多糖已被证实能够延长秀丽隐杆线虫的寿命。例如,枸杞多糖可使线虫平均寿命提高25.70%[5];三七多糖在500 μg/mL质量浓度下可延长平均寿命23.02%[25]。这些延寿效果的差异,可能与不同多糖的化学结构及其对应的作用机制有关。
图5 CPS-3对线虫寿命的影响
Fig.5 Effect of CPS-3 on C.elegans lifespan
2.7.2 CPS-3对线虫生殖能力的影响
研究表明,线虫可能通过降低繁殖能力为长寿提供能量支持[26]。为评估CPS-3对线虫生殖能力的影响,本研究测定了线虫产卵量。结果显示(图6),与对照组相比,CPS-3处理显著增加了线虫的产卵数,且该效应具有剂量依赖性。对照组与CPS-3处理组的产卵期均为6 d,并于第2天达到峰值。统计显示,对照组线虫平均总产卵量为231.67个,而CPS-3在40、80、160 μg/mL质量浓度下,总产卵量分别增至250.33、304.33、321.67个。其中,160 μg/mL组的产卵量最高,较对照组提升约38.85%。上述结果表明,CPS-3不仅能够延长线虫寿命,还可增强其繁殖能力,说明其延寿作用并非通过牺牲繁殖能力来实现。
图6 CPS-3对线虫生殖能力的影响
Fig.6 Effect of CPS-3 on reproductive capacity of C.elegans
注:*表示差异显著,P<0.05;**表示差异极显著,P<0.01(图8～图10同)。
2.7.3 CPS-3对线虫应激耐受性的影响
如图7所示,与寿命实验结果一致,CPS-3处理在2种应激条件下均引起生存曲线浓度依赖性右移。对照组线虫在氧化应激和热应激下的平均存活时间分别为5.47、8.06 h;而经160 μg/mL CPS-3处理后,分别延长至7.27、10.48 h,分别提升了32.91%和30.02%。该增强效果优于部分已报道的多糖,黄花菜多糖可使热应激下线虫寿命延长17.71%[11];金银花多糖则使氧化应激下线虫寿命增加16.76%[27]。
a-氧化应激环境;b-热应激环境
图7 CPS-3对线虫应激耐受性的影响
Fig.7 Effect of CPS-3 on the stress tolerance of C.elegans
2.7.4 CPS-3对线虫咽泵速率及运动能力的影响
咽泵速率是反映线虫摄食能力的关键生理指标,也是评估衰老进程的重要标志之一。如图8-a所示,从3～12 d,线虫的咽泵速率呈逐步下降趋势。与对照组相比,CPS-3处理能显著延缓该下降趋势(P<0.05)。其中,160 μg/mL处理组的效果最为明显,在第3、6、9、12天分别使咽泵速率提高了14.45%、36.50%、26.78%和21.42%。在包括哺乳动物在内的多种生物中,寿命延长常与饮食限制相关联[28]。本研究中CPS-3在提升咽泵速率的同时仍能延长寿命,表明其延寿机制可能不依赖于热量限制途径。
a-咽泵速率;b-运动能力
图8 CPS-3对线虫咽泵速率和运动能力的影响
Fig.8 Effects of CPS-3 on the pharyngeal pumping rate and locomotion ability of C.elegans
运动能力随年龄下降是线虫衰老的另一个典型表现,常被用作评价机体衰老程度的重要行为指标[4]。如图8-b所示,补充CPS-3能剂量依赖性地缓解线虫运动能力的衰退,且这一保护作用随时间推移更加明显。与对照组相比,160 μg/mL CPS-3处理在第3、6、9、12天使线虫运动能力分别提升20.18%、39.56%、33.33%、52.38%。上述结果表明,CPS-3能在衰老过程中维持线虫的运动表现,从而有助于延长其健康寿命。
2.7.5 CPS-3对线虫体内ROS水平的影响
ROS是一类含氧的活性分子或自由基,其水平变化与衰老进程密切相关[29]。如图9所示,对照组线虫体内呈现明显绿色荧光,而CPS-3处理组线虫的荧光强度显著降低。定量分析发现,160 μg/mL CPS-3处理可使线虫ROS水平较对照组下降76.02%。同类研究显示,峨眉岩白菜多糖在200 μg/mL质量浓度下能使线虫ROS水平降低46.78%[30]。上述结果表明,CPS-3能有效降低线虫体内ROS水平,该作用可能与其可以提升线虫体内T-SOD活性,进而增强了机体整体抗氧化防御能力有关[31]。
a-显微图像;b-定量分析
图9 CPS-3对线虫体内ROS水平的影响
Fig.9 Effect of CPS-3 on ROS level in C.elegans
2.7.6 CPS-3对线虫体内脂褐素积累的影响
脂褐素(亦称“老年色素”)是一种具有自发荧光的衰老相关色素,其积累水平常被用作评价线虫氧化应激与衰老程度的关键指标[32]。如图10所示,CPS-3处理组线虫的蓝色荧光强度较对照组明显减弱。在160 μg/mL质量浓度下,CPS-3使线虫脂褐素水平降低了59.63%。类似研究也报道了多糖对脂褐素积累的抑制作用,如1 mg/mL食用菌多糖可使线虫脂褐素减少22.8%[33];1 mg/mL卡拉胶寡糖可使脂褐素积累降低38.46%[34]。脂褐素的形成与细胞组分的氧化、自噬及氧化应激等过程密切相关[35]。CPS-3能够显著减少脂褐素积累,可能与其抑制自由基生成、缓解氧化应激能力有关。综上,CPS-3在延长氧化应激下线虫寿命的同时,能够降低ROS及脂褐素水平,提示其可能通过增强线虫内源性抗氧化防御系统发挥延寿作用。
a-显微图像;b-定量分析
图10 CPS-3对线虫肠道脂褐素累积的影响
Fig.10 Effect of CPS-3 on the accumulation of intestinal lipofuscin in C.elegans
3 结论与展望
从发酵粘液乳杆菌S1中分离纯化出一种荚膜多糖CPS-3。该多糖重均分子质量为4.47×104 Da,由鼠李糖、葡萄糖和半乳糖构成,且结构中同时含有α和β两种构型的糖残基。在秀丽隐杆线虫模型中,CPS-3表现出良好的抗衰老活性,能有效延长线虫寿命,增强其氧化应激与热应激耐受性,缓解咽泵速率与运动能力的衰老性下降,并降低体内ROS和脂褐素积累。本研究初步解析了CPS-3的结构并证实其抗衰老潜力,然而其构效关系、分子机制及在更高阶动物模型中的有效性仍需深入探索。后续工作将围绕上述方面展开,以期为乳酸菌CPS在抗衰老食品中的应用提供更充分的科学依据。
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