酱香型白酒作为中国传统固态发酵蒸馏酒的典型代表之一,其独特的风味品质与复杂的微生物发酵过程密切相关[1]。传统的酿造车间经过数十年的连续生产,环境微生物与窖池系统已演化为稳定、成熟的微生态系统,是形成优质白酒风味与品质的关键[2]。十四五期间,随着消费市场需求扩大,各大酱香型白酒企业纷纷通过新建酿酒厂房来扩充产能,以满足市场需求,但其产品品质一般难以与传统老厂房媲美,不利于酱香型白酒品质提升。可见,新老厂房虽然采用了统一的标准化工艺流程和熟练的工艺操作,其品质差异与传统老厂房长期驯化后稳定的酿造微生态环境密不可分[3-5]。因此,从微生物生态学角度解析酱香型白酒新老厂房差异,对于理解传统发酵机制,未来实现新建厂房酿造微生物的调控具有重要意义。
近年来,高通量测序技术的发展为深入研究白酒酿造微生态系统提供了强大工具[6]。已有研究初步揭示了酒醅、窖泥等不同酿造微环境中的微生物群落结构,并发现其与风味物质形成存在关联[7-8]。乳杆菌属(Lactobacillus)、芽孢杆菌属(Bacillus)等细菌属,毕赤酵母属(Pichia)、酵母属(Saccharomyces)等真菌属已被证实是产酸、产酯的关键功能菌群[9]。然而,现有研究多集中于单一厂房或特定酿造环节的分析,对于新老厂房在微生态系统层面的整体性比较仍显不足,尤其是在整合环境微生物组、酒醅菌群动态与风味化合物的多尺度、多界面分析方面尚不清晰[10-11]。同时,研究表明酿酒厂房晾堂、器具表面及空气等环境介质可能作为酿造微生物的“种子库”,通过沉降、接触等方式向酒醅中迁移,并参与酒醅菌群组装[12-13]。然而,环境微生物对不同投产年限厂房发酵酒醅菌群组装的具体影响机制,尤其是其如何调控微生态演替与功能形成,目前尚不明确[14]。因此,亟待明确导致酒醅中风味化合物差异的关键功能微生物及其潜在环境来源,以及驱动其代谢活动的关键理化因子,为初步解析新老厂房酿造微生态差异对酒醅菌群组成及其风味化合物的影响作用提供理论依据。
酱香型白酒第三轮次发酵作为“大回酒”的起始阶段,在整个酿造周期中具有承上启下的关键地位。此时,发酵体系已初步稳定,微生物群落结构趋于丰富,是风味物质形成与积累的重要时期,对于揭示新老厂房微生态功能差异具有一定代表性[15]。基于此,本研究通过对比分析新老厂房三轮次酿造环境(晾堂地面、窖泥、器具表面等)及发酵酒醅中理化因子、微生物菌群结构及其演替规律,及其风味化合物组成,并结合SourceTracker贝叶斯溯源模型量化环境微生物的贡献率,旨在初步解析不同厂房酿造环境微生态对酱香型白酒堆积和窖池发酵过程酒醅理化因子、微生物菌群结构及风味物质组成差异的影响作用,以期为不同厂房微生态差异提供理论支撑。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
DNA提取试剂盒,美国Omega Bio-Tek公司;聚合酶链式反应引物,上海翌圣生物科技股份有限公司;NaCl、KH2PO4,均为分析纯,国药集团化学试剂有限公司;乙酸、乳酸、己酸、丁酸、乙酸乙酯、乳酸乙酯、己酸乙酯、丁酸乙酯、乙缩醛、糠醛、苯甲醛、正丙醇、丁醇、异戊醇、苯甲醇、苯丙酸乙酯、苯乙醇等标准品,纯度≥99.0%,阿拉丁试剂(上海)有限公司。
1.2 仪器与设备
SB25-12DT超声波清洗机,宁波新芝生物科技股份有限公司;KG-AP32L自动蒸汽灭菌器,日本ALP公司;GC 8890气相色谱仪、1260高效液相色谱仪、CP97723 CP-Wax 57 CB毛细管柱(50 m×0.25 mm×0.25 μm),美国Agilent公司。
1.3 方法
1.3.1 样品采集
酒醅样品和环境样品均取自贵州省遵义市某酱香型酒厂制酒厂房三轮次生产,其中新厂房(X)来源于投产时间<3年的制酒厂房,老厂房(L)来源于投产时间>20年的制酒厂房,取样前向生产部门询问酒醅的情况,包括生产过程是否稳定,之前出酒率如何。同时避免因酿造工艺、原料等因素对酱香白酒发酵过程的干扰。
为保证采样的均一性及代表性,酒醅样品按图1方式进行采集,其中堆积样品取糖化堆完堆(WD)、堆积中期(DZ)及下窖(XJ)3个阶段的样品,当发酵堆酒醅表层温度达到50 ℃左右即视为堆积发酵结束,将6个点位的样品均匀混合后视为一份综合样。窖池样品如图1所示,取发酵中期(FJZ)以及出窖的上层(CJS)、中层(CJZ)、下层样品(CJX)取样时分为上中下三层取样,每层取5点混合后视为一份综合样,样品采集后立即装入无菌自封袋中,立即带回实验室分析。
a-堆积样采集示意图;b-窖池样采集示意图
图1 堆积样品与窖池样品取样位置示意图
Fig.1 Schematic diagram of sampling sites for stacking and pit fermentation samples
环境样品采集:堆积发酵前1 d,针对晾堂堆积地面(DJDM)、未堆积地面(WDJDM)、生产器具表面(QJ,含工具架上的铲子、钉耙、扫帚等)及窗台墙壁等物体表面(WT),均选择糟醅堆积发酵附近不同位置(器具直接取样对应工具),用无菌水浸湿脱脂棉擦拭3次后混合为1个综合样;厂房内、外空气样(分别命名为CNKQ、CWKQ)采用自然沉降法采集,即各在厂房内外前、中、后位置地面放置3块无菌培养皿并开盖,2 d后回收,再用无菌水浸湿脱脂棉擦拭培养皿3次后混合为1个综合样。入窖前1 d,对空窖池墙壁上层(JCS)、中层(JCZ)、下层(JCX),每层选取3点用无菌水浸湿脱脂棉擦拭,将同层3个样品混合为1个综合样。糟醅入窖后,采用五点取样法对窖池四周和中心点采集窖泥并混合为1个综合样,且按发酵时间将不同阶段窖泥分为前期(JNQ)、中期(JNZ)、后期(JNH)。
1.3.2 理化指标检测
参照T/CBJ 004—2018《固态发酵酒醅通用分析方法》对酒醅水分、酸度、还原糖和淀粉含量进行测定[16]。
酒醅中乳酸、乙酸的含量采用高效液相色谱法进行测定[17]。酒醅样品处理:准确称取1.00 g发酵酒醅于10 mL离心管中,加入6 mL体积分数为50%的乙醇搅匀。在室温下浸泡30 min,6 000 r/min离心5 min;收集上清液,再往滤渣中加入3 mL体积分数为50%的乙醇溶液,再次离心并收集上清液,全部上清液定容于10 mL容量瓶得到液相检测样品。标准混合液的配制:分别准确量取0.1 mL乳酸和乙酸的标准品,用流动相溶解并定容于100 mL容量瓶中,分别量取0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL标准混合母液用去离子水稀释、定容于10 mL容量瓶。流动相的配制:准确称取6.80 g KH2PO4,用去离子水溶解、定容于1 000 mL容量瓶,并用H3PO4,调节pH值至2.50,再经0.45 μm水相滤膜过滤、超声波脱气30 min后使用;色谱级乙腈经0.22 μm有机滤膜过滤、超声波脱气30 min后使用。液相色谱条件:T13色谱柱;流动相V(乙腈)∶V(0.05 mo1/L KH2PO4)=8∶92;流速1.0 mL/min;柱温30 ℃;进样量20 μL;检测波长210 nm。将乳酸及乙酸的色谱级标准样品利用倍比稀释法进行梯度稀释并测定,根据标样浓度、稀释倍数以及峰面积计算得出不同有机酸的标准曲线,如表1所示。
表1 乳酸及乙酸标准曲线
Table 1 Lactic acid and acetic acid standard curve
有机酸标准曲线R2乳酸y=23.215x+415.790.998 7乙酸y=267.99x+60.7210.999 3
1.3.3 风味成分前处理与检测
酒醅中风味物质采用气相色谱法检测。酒醅样品前处理方法同1.3.2节一致,GC标准品及GC条件均参照王金龙等[18]的方法。
1.3.4 微生物群落结构扩增子测序
高通量测序采用Illumina MiSeq测序平台,分别对细菌16S rRNA基因V3～V4区、真菌ITS3～ITS4区进行高通量测序分析。使用E.Z.N.ATMMag-BindSoil DNA Kit试剂盒提取DNA。细菌16S rRNA基因的V3～V4区域片段,选择341F(5′-CCTACGGGNGGCWGCAG-3′)和805R(5′-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3′)为扩增引物;真菌采用ITS3(5′-GCATCGATGAAGAACGCAGC-3′)和ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)为扩增引物。PCR扩增条件:95 ℃预变性3 min;94 ℃变性20 s;55 ℃退火20 s;72 ℃延伸30 s;25次循环;72 ℃终延伸5 min降至4 ℃。PCR反应体系为:2×Hieff® Robust PCR Master Mix15 μL,正向及反向引物各1 μL,DNA模板20～30 ng,使用ddH2O补齐体系至30 μL。高通量测序分析由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。
1.4 数据处理
微生物分类注释基于UNITE和Silva数据库,Chao1、Shannon和Simpson指数等Alpha多样性分析利用QIIME软件进行分析。基于16S rRNA和ITS测序获取酒醅样本的微生物群落数据(属水平),利用OriginPro 2024软件对微生物相对丰度进行绘图,采用SPSS 24.0软件计算Spearman相关性系数,使用R语言(v.4.4.3)软件进行溯源分析、计算微生物相对丰度数据、差异微生物柱状图绘制以及理化指标与风味成分分面柱状图的绘制,使用联川生物平台进行Mantel-test以及冗余分析(redundancy analysis,RDA)的绘制。
2 结果与分析
2.1 新老厂房理化因子差异对比分析
酒醅的理化因子是白酒发酵过程中微生物活动与物质转化的直观表现,水分影响微生物生存环境,酸度调控代谢方向,淀粉和还原糖为发酵提供底物[19]。
由图2-a可知,新厂房酒醅还原糖在堆积中期时达最高值(0.91%)后迅速消耗,至出窖下层降至最低值(0.48%),全周期消耗幅度的相对比例达47.25%;而老厂房还原糖最高值出现在下窖时期(0.81%),出窖中层降至最低值(0.54%),全周期消耗相对比例为33.33%,表明新厂房微生物对还原糖的早期利用和消耗更加迅速。从水分来看,新、老厂房酒醅的水分动态变化趋势较为一致,均随发酵进程推进呈稳步上升趋势,分别由完堆的48.82%和48.11%上升至发酵中期的52.98%和53.58%,老厂房总上升幅度略高于新厂房。老厂房酒醅堆积发酵阶段(完堆至堆积中期)酸度范围为2.52～2.75 mmol/10 g,整体处于较低水平且波动平缓;进入窖池发酵阶段(下窖至出窖),酸度逐步升高,范围扩大至2.91～3.96 mmol/10 g,出窖中层达最大值3.95 mmol/10 g(图2-c)。新厂房酒醅酸度整体高于老厂房:堆积发酵阶段(完堆至堆积中期)酸度范围为3.02～3.24 mmol/10 g,较老厂房同期高0.50～0.52 mmol/10 g;窖池发酵阶段(下窖至出窖)酸度范围进一步扩大至3.29～4.17 mmol/10 g,出窖中层达峰值4.17 mmol/10 g,较老厂房同期最高值高0.22 mmol/10 g。淀粉方面(图2-d),新老厂房酒醅淀粉含量整体呈下降趋势。堆积发酵阶段差异明显,新厂房淀粉消耗较快,由完堆的24.21%降至堆积中期的22.55%;老厂房则基本稳定(24.32%～24.33%)。新老厂房酒醅中乳酸和乙酸的总体含量差距较小,乳酸方面(图2-e),新老厂房全发酵周期平均含量分别为5 390.9、5 081.0 mg/100 g,差值为309.9 mg/100 g,局部差异主要体现在堆积阶段(新厂房比老厂房高约1 000 mg/100 g),窖池发酵后期两者基本持平;乙酸方面(图2-f),老厂房出窖阶段酒醅中乙酸(1 978.66 mg/100 g)较新厂房(1 600.326 mg/100 g)高出23.64%。黄廷财等[20]通过对酱香型白酒2、3轮次发酵酒醅进行研究,发现乳酸是堆积发酵过程中含量最高的有机酸,第2、3轮次酒醅中乳酸含量分别在27.32～32.67、34.41～36.16 mg/g,其次是乙酸,在堆积发酵过程中它们的含量浮动不大,随轮次的增加含量有所上升。SONG等[21]研究发现,乙醇是酱香型白酒发酵酒醅中含量最高的代谢物,其次便是乳酸和乙酸,酸类物质的相对丰度在15～30 d期间上升,平均值从62.70%升至70.34%。其中乳酸和乙酸的相对丰度在15～30 d期间上升,平均值在34.81%～42.62%。
a-还原糖;b-水分;c-酸度;d-淀粉;e-乳酸;f-乙酸
图2 新老厂房不同发酵阶段糟醅理化指标
Fig.2 Physicochemical indicators of fermented grains in new and old workshops across different fermentation phases
注:WD-糖化堆完堆,DZ-堆积中期,XJ-下窖,FJZ-发酵中期,CJ-出窖样品(下同)。
2.2 新老厂房不同发酵阶段酒醅与环境微生物多样性分析
2.2.1 新老厂房酒醅及窖泥微生物多样性指数分析
微生物多样性指数[操作分类单元(operational taxonomic units,OTUs)、Shannon、Simpson、Chao1]是反映群落丰富度与均匀度的核心指标[22-23]。对新老厂房不同阶段酒醅及环境样本进行微生物多样性系统解析,其结果如电子版增强出版附表1(https://doi.org/10.13995/j.cnki.11-1802/ts.044494,下同)和附表2所示。新老厂房环境样本(包括窖泥、空气、地面、器具及空窖池等)的微生物多样性呈现一定差异,这种差异或许与酒醅菌群的动态变化存在密切的潜在关联。
在细菌群落方面,新厂房在完堆阶段(WD)表现出较高水平(OTUs=832.00±32.00),为其酒醅发酵全阶段最高;老厂房则在堆积中期(DZ)优势较明显,(OTUs=589.00±25.00),虽低于新厂房完堆阶段,但高于自身完堆阶段(WD:OTUs=313.00±12.00)与下窖阶段(XJ:OTUs=332.00±14.00)。环境样本中,老厂房窖泥前期(JNQ:OTUs=2 400.00±92.00)、未堆积地面(WDJDM:OTUs=1 444.00±59.00)及器具表面(QJ:OTUs=1 560.00±64.00)均保持高值;新厂房环境样本中,厂房内空气(CNKQ:OTUs=690.00±28.00)和空窖池上层(JCS:OTUs=1 228.00±50.00)为自身较高水平,但均低于老厂房对应位点。均匀度方面,新厂房完堆阶段(WD)均匀度较好,Shannon指数=3.23±0.16、Simpson指数=0.10±0.01;老厂房堆积中期(DZ)均匀度稳定,Shannon指数=2.89±0.18、Simpson指数=0.14±0.01。环境样本中,老厂房窖泥前期(JNQ:Shannon=5.23±0.21、Simpson=0.04±0.01)、器具表面(QJ:Shannon=5.06±0.20、Simpson=0.03±0.01)均匀度较好;新厂房厂房内空气(CNKQ:Shannon=4.30±0.17、Simpson=0.04±0.01)均匀度较好,空窖池上层(JCS:Shannon=3.11±0.15、Simpson=0.26±0.02)则均匀度较弱。
在真菌群落方面,老厂房窖泥中期(JNZ:OTUs=343.00±13.00)为其环境真菌最高值;新厂房操作器具表面(QJ:OTUs=351.00±14.00)、空窖池上层(JCS:OTUs=352.00±14.00)丰富度更高,且略高于老厂房窖泥中期样本。发酵阶段酒醅无明确主导优势,新厂房窖池中期(FJZ:OTUs=266.00±10.00)与老厂房出窖下层(CJX:OTUs=233.00±9.00)均处于中等水平。均匀度方面,新厂房在完堆期(WD:Shannon=2.37±0.14、Simpson=0.15±0.02)和窖池中期(FJZ:Shannon=2.97±0.16、Simpson=0.08±0.01)均匀度较高;老厂房则在出窖阶段最优,尤其是下层酒醅(CJX:Shannon=3.23±0.16、Simpson=0.08±0.01)。环境样本中,新厂房操作器具表面(QJ:Shannon=2.07±0.12、Simpson=0.28±0.02)和空窖池上层(JCS:Shannon=2.52±0.14、Simpson=0.21±0.02)均匀度相对平衡;老厂房窖泥中期(JNZ:Shannon=1.87±0.11、Simpson=0.30±0.02)虽丰富度较高,但均匀度一般。WEI等[24]观察到优质窖泥通常具有较高的微生物多样性,但多样性高并不直接等同于代谢功能优异,特定功能类群的稳定富集同样至关重要:即使某些退化窖泥在物种数量上可能与优质窖泥相差不大,但其菌群结构可能已失衡,关键功能微生物的丰度显著降低,导致窖泥代谢功能衰退。老厂房在窖泥环境、出窖酒醅和生产器具表面等关键位点保持较高的微生物丰富度,而新厂房则在完堆阶段、窖池中期以及部分环境样本中表现出多样性优势,这或许反映了两者在微生态成熟度上的差异。
2.2.2 新老厂房不同发酵阶段酒醅及环境优势微生物组成和演替规律
新老厂房不同发酵阶段酒醅及环境样本中相对丰度>1%的微生物(属水平)如图3所示,对于细菌优势微生物组成和演替规律而言,新老厂房在堆积中期即呈现出一定差异:老厂房酒醅中以芽孢杆菌属为绝对优势菌,相对丰度为35%,该菌属以其强大的分泌酶系(如蛋白酶、淀粉酶)和抗逆性著称,能够在堆积前期的高温、富氧环境下迅速定殖,分解大分子营养物质,为后续的厌氧发酵奠定丰富的物质基础[25]。而新厂房酒醅在堆积中期则由乳杆菌属(71%)为优势菌。在出窖酒醅中,新老厂房都较为一致,不同分层酒醅中乳杆菌属丰度都达到了70%以上。这一现象并非酱香型白酒特有,在其他香型白酒发酵中同样存在共性规律。在浓香型白酒中,XU等[3]发现无论是使用新糟醅还是老糟醅,窖内发酵后期的细菌群落均收敛于以乳杆菌属为绝对主导的结构。类似地,邱显平等[11]在对比浓香型新老窖池时也明确指出,出窖酒醅中的优势菌群均为乳杆菌。
a-老厂房细菌;b-老厂房真菌;c-新厂房细菌;d-新厂房真菌
图3 新老厂房不同发酵阶段糟醅与环境中微生物相对丰度(属水平)
Fig.3 Relative abundance of microorganisms at genus level in fermented grains and environmental samples from new and old workshops across fermentation stages
注:DJDM-晾堂堆积地面;WDJDM-未堆积地面;QJ-生产器具表面;WT-窗台墙壁等物体表面;CNKQ-厂房内空气;CWKQ-厂房外空气;JN-窖泥样品;JC-空窖池样品。
对于真菌优势微生物组成和演替规律而言,真菌群落的对比揭示了老厂房发酵过程的高度稳定性。老厂房糟醅从完堆至窖池发酵中期,毕赤酵母属的相对丰度持续保持在70%以上。毕赤酵母是白酒产酯的重要酵母之一,其如此高的占比和稳定性,确保了整个发酵过程酯化动力强劲且可预测[26]。
环境作为微生物种源库的功能分化对环境样本的分析进一步揭示了两厂房微生态环境的差异:老厂房物体表面以醋酸菌属(Acetobacter)为主。这类好氧酸菌在厂房内长期存在,可能通过空气沉降或人为活动,持续为酒醅提供产酸功能菌种的接种,是老厂房酸度稳定和高乙酸含量的重要环境来源。新老厂房地面样本的差异尤为显著:老厂房地面(无论是否堆积)均以乳杆菌属为绝对优势菌,这表明老厂房的整个环境已被酿造核心功能微生物深度定殖,形成了一个稳定、均一的“功能菌强化环境”。而新厂房地面优势菌为果糖杆菌属(Fructobacillus)和葡萄球菌属(Staphylococcus)。葡萄球菌能够产生脂肪酶,水解脂肪生成游离脂肪酸和甘油,这些物质是白酒中酯类香味物质的重要前体[27]。
2.2.3 新老厂房不同发酵阶段酒醅及环境差异微生物分析
为揭示新老厂房不同发酵阶段微生物群落的异同,从主坐标分析(principal coordinates analysis,PCoA)结果中提取了细菌与真菌菌群分组数据。研究数据显示,基于细菌群落(附图1-a)和真菌群落(附图1-b)的前2个主坐标轴,其累计解释方差率分别达到89.89%和60.76%。这一结果表明,所采用的PCoA方法能够较为全面地反映各样本的微生物群落特征,为后续分析提供了可靠的数据基础。
由附图1-a可知,2个厂房的细菌群落在堆积发酵阶段与窖池发酵阶段有一定差异(P<0.005);不过,当处于相同发酵阶段时,新厂房与老厂房在OTU水平上的细菌群落结构呈现出较高的相似性。与细菌群落不同,真菌群落展现出独特的分布特征。如附图1-b所示,在堆积发酵阶段,2个厂房基于真菌属水平的样本点出现明显分离,表明相较于细菌群落,真菌群落对厂房环境条件的差异更为敏感。即发酵过程中真菌群落的构建,其微生物来源可能主要依赖于所处的厂房环境,这与WANG等[28]的研究相一致。
为进一步识别组间具有统计学意义的生物标志物,采用线性判别分析效应量(linear discriminant analysis effect size,LEfSe)分析对新老厂房不同发酵阶段及环境样本中的微生物类群进行了多级筛选(从门到种)[29]。在堆积阶段(附图1-c、1-d),新厂房酒醅中以鞘氨醇盒菌属(Sphingopyxis)、平面球菌属(Planomicrobium)以及拟拜氏接合酵母(Zygosaccharomyces pseudobailii)等类酵母真菌为主要差异微生物;而老厂房则以盐水球菌属(Salinicoccus)、高温放线菌属(Thermoactinomyces)及链格孢属(Alternaria)、库德里阿氏毕赤酵母(Pichia kudriavzevii)为差异微生物。进入窖池发酵阶段后(附图1-e、1-f),老厂房主要以未归类固醇杆菌科(unclassified Steroidobacteraceae)、纤维单胞菌属(Cellulomonas)、克诺尔氏菌属(Knoellia)及砷球菌属(Arsenicicoccus)等细菌为差异微生物;新厂房则富集了柯达酵母属(Kodamaea)、木霉属(Trichoderma)、洛德酵母属(Lodderomyces)等差异真菌。对于环境微生物而言(附图1-g、1-h),老厂房中以耐乙酸乳杆菌(Lactobacillus acetotolerans)、未分类梭菌科(unclassified Clostridiaceae)等为主要差异微生物;新厂房中则以未分类芽孢杆菌纲(unclassified Bacilli)以及金担子菌属(Aureobasidium)、生丝毕赤酵母属(Hyphopichia)等真菌为主要差异微生物。以上结果表明,新老厂房在不同发酵阶段及环境介质中均拥有其特有的差异物种。
2.3 新老厂房微生物溯源分析
基于R语言使用贝叶斯概率工具SourceTracker[30]进一步分析新老厂房堆积和窖池发酵糟醅中优势细菌和真菌菌群的来源及比例,其结果如附图2-a～附图2-d、附图3-a～附图3-d所示。在堆积发酵阶段,新老厂房的完堆与下窖酒醅中的细菌群落表现出相似的来源模式,其主要贡献均来自于厂房地面(贡献率均超过50%)。然而,两厂房在真菌群落的来源上则呈现出明显不同的路径。老厂房酒醅中的真菌主要来源于物体表面和堆积地面,表明其环境中的真菌群落分布相对均匀且稳定。相比之下,新厂房酒醅中的真菌则更多地依赖于操作器具和物体表面作为主要来源,暗示其真菌群落的定植与传播路径与老厂房存在差异。进入窖池发酵阶段后,新老厂房出窖酒醅的细菌来源再次趋同,均主要来自于空窖池,说明窖池在塑造窖内细菌群落方面起着决定性作用。然而,在真菌来源上,两厂房的差异依然显著:老厂房出窖酒醅中的真菌持续以物体表面为主要来源,而新厂房则转变为以操作器具为主要来源(对毕赤酵母的贡献率达47.6%)。这些结果表明,新老厂房微生态系统的差异集中体现在真菌群落的来源与传输路径上。老厂房其真菌来源稳定地集中于空间环境(物体表面、空气),而新厂房其真菌群落则表现出对特定操作界面(如器具)更强的依赖性,这可能反映了其环境真菌群落尚未达到空间上的均一与稳定。
根据贡献度分析结果采用贝叶斯公式进一步计算发酵糟醅中微生物主要来源,其结果如附图2-e～附图2-h、附图3-e～附图3-h所示。分析揭示了两厂房在微生物传输路径上既有共性,也存在关键的生态位差异。在开放的堆积阶段,新老厂房的核心细菌属,如枝芽孢杆菌、乳杆菌属和克罗彭斯特菌属,其最主要的来源均高度一致地指向厂房地面(贡献率均超过50%)。这一共性清晰地表明,在堆积这一开放工艺环节,晾堂地面作为微生物“种源库”的功能是普适性的,扬尘与人员走动是驱动微生物向酒醅迁移的关键物理力量,凸显了厂房基础环境对酿造起始菌群的深远影响。然而,随着发酵进入封闭的窖池环境,两厂房的微生物来源路径出现了分化,这或许反映了其微生态系统成熟度的差异。在老厂房中,窖池环境展现出强大的菌群定殖与供给能力,窖内糟醅中的核心细菌(如乳杆菌、枝芽孢杆菌)主要来源于空窖池中层。这表明老窖池的窖壁/窖泥已形成一个稳定的微生物富集层,能在窖内发酵这一关键阶段,持续为酒醅接种功能菌群。相比之下,新厂房的窖池系统则表现出不同的生态特征。其窖内糟醅的细菌来源呈现出明显的空间异质性与对非窖池环境的依赖性。例如,枝芽孢杆菌虽也主要来源于空窖池,但更集中于上层(55%),同时有相当一部分(25%)来源于物体表面;而葡萄球菌属更是极度依赖于窖池上层,贡献率高达86.7%。这一现象说明,新厂房的窖池环境在菌群定殖的深度与均匀性上可能尚未成熟,导致其供给菌群的能力较弱且不均,使得酒醅菌群更容易受到窖外环境(如物体表面)的干扰。
真菌群落的溯源结果更为深刻地揭示了两厂房微生态的差异。老厂房展现出高度稳定和集中的真菌传输路径:无论是堆积期还是窖内期,其优势真菌属[如嗜热真菌属(Thermomyces)、毕赤酵母属、红曲霉属(Monascus)]的来源都高度集中于物体表面和厂房内空气。这暗示老厂房经过长期驯化,已在整个空间内形成了一个稳定、均一的“真菌气溶胶库”,确保了功能真菌可预测且持续地向酒醅进行接种。而新厂房则呈现出不同的真菌组装模式。其窖内糟醅中的优势真菌,如毕赤酵母属(47.6%)和红曲霉属(43.9%),主要来源于操作器具,其次才是物体表面。这表明,新厂房尚未形成稳定、弥散的空间真菌环境,酒醅中功能真菌的获取更大程度上依赖于与特定物体(如工具)的直接接触,这种来源路径可能更具随机性和不稳定性。
2.4 新老厂房发酵过程糟醅中驱动因子分析
通过Mantel检验对酒醅微生物群落结构与理化指标进行相关性分析,结果如图4-a及图4-b所示。老厂房中,细菌与水分、酸度、淀粉、乙酸呈显著正相关(P<0.05);真菌与多数理化指标呈负相关(P≥0.05),但整体相关性较弱。可见老厂房细菌群落与水分、酸度、淀粉、乙酸的正向关联特征明确,与水分、酸度、淀粉、乳酸的显著正向关联更突出;真菌群落与多数理化指标的负向关联较弱,与乙酸的正向关联较弱,水分、酸度、淀粉、乙酸或为与老厂房酒醅中细菌菌群演替关联性较强的理化因子。
a-老厂房Mantel检验;b-新厂房Mantel检验;c-新老厂房细菌RDA;d-新老厂房真菌RDA
图4 新老厂房糟醅微生物与理化因子Mantel检验与RDA
Fig.4 Mantel test and RDA of microbial communities and physicochemical factors in fermented grains from new and old workshops
新厂房中,细菌与水分、酸度、淀粉、还原糖呈显著正相关(P<0.05),与乙酸、乳酸呈负相关(P≥0.05);真菌与水分、酸度、还原糖、乳酸呈显著正相关(P<0.05),与乙酸呈负相关(P≥0.05)。进一步对比Mantel检验结果可知,老厂房微生物群落与酸类因子(酸度、乳酸、乙酸)的相关性更集中,细菌与酸度、乳酸显著正相关(P<0.05),真菌与乙酸呈正相关;新厂房微生物群落与水分的相关性更普遍,细菌、真菌均与水分显著正相关(P<0.05),且前文提及“新厂房酒醅水分更稳定”,这或许表明水分与新厂房微生物群落的关联更具广泛性。
为了进一步分析新老厂房不同环境酒醅中理化因子对微生物演替的影响,本研究通过RDA解释微生物群落之间与理化因子之间的相互关系。细菌群落RDA结果显示,RDA1轴和RDA2轴分别解释了58.94%和14.06%的变异,水分、酸度以及乳酸的箭头较长,乳杆菌属(Lactobacillus)与这些因子同向富集于第四象限,表现出一定的趋酸、趋水特性;而老厂房前期的代表性菌群芽孢杆菌属(Bacillus)及克罗彭斯特菌属(Kroppenstedtia)则与酸类因子反向聚集。真菌群落RDA结果显示,RDA1轴的解释度为43.62%,老厂房各个发酵阶段的样本以及新厂房的部分堆积样本在真菌群落结构上表现出高度的聚集性,主要受到乙酸和还原糖的驱动,并与毕赤酵母属(Pichia)及假丝酵母属(Candida)同向分布;而新厂房出窖阶段样本则显著向左上方偏移,主要受水分、酸度及乳酸的剧烈驱动,与之协同聚集的是柯达酵母属(Kodamaea)和节担菌属(Wallemia)等耐酸真菌类群。
2.5 新老厂房不同发酵阶段酒醅微生物与酒醅风味成分关联性探究
风味成分作为发酵产品品质的核心评价指标,其动态变化直接反映生产过程稳定性与产品特性[31]。如图5所示,两类厂房酒醅中的风味物质积累存在一定差异:总酯方面(图5-a),老厂房含量从完堆阶段的48.08 μg/g持续增至出窖阶段的385.55 μg/g,而新厂房在发酵中期阶段达峰值199.31 μg/g后回落至146.52 μg/g,整体低于老厂房,表明老厂房发酵环境或许更利于酯类合成。总酸含量上(图5-b),老厂房在完堆阶段为1 036.39 μg/g,堆积中期短暂下降后逐步回升至出窖阶段的1 305.71 μg/g,新厂房则全程波动较小(520.88～695.05 μg/g),整体水平较低,可能与微生物群落或酸代谢路径差异相关;总醇含量(图5-c)差异贯穿全周期,老厂房从639.60 μg/g增至888.42 μg/g,新厂房仅为其50%～60%(375.25～418.69 μg/g),提示老厂房中更利于醇类生成;总醛含量(图5-d)相对较低,老厂房在下窖阶段达20.34 μg/g峰值,新厂房则稳定在7.88～12.54 μg/g。除酯酸醇醛外,其他成分差异主要体现在下窖阶段,老厂房在该阶段出现峰值,明显高于新厂房。在窖池阶段两类厂房其他成分含量均快速下降,至出窖阶段均低于10 μg/g。
a-总酯;b-总酸;c-总醇;d-总醛;e-其他物质
图5 新老厂房不同发酵阶段酒醅风味成分柱状图
Fig.5 Bar chart of flavor compounds in fermented grains from new and old workshops across different fermentation stages
采用热图可视化方法对数据进行分析。以颜色梯度展示风味成分含量的分布特征,结合数值统计(图中仅展示整体差异,具体数值未展示),分析新老厂房样本中物质含量的整体差异、关键物质的指标特异性及规律,其结果如图6-a、图6-b所示。酸类物质是酯类风味前体,老厂房酒醅在乙酸的积累上展现出绝对优势(发酵中期至出窖阶段:903.47～1 109.54 μg/g),且在窖内发酵期呈现持续增长趋势,表明其产酸菌群(如醋酸杆菌、乳酸菌)具有高强度且稳定的代谢活性。相比之下,新厂房酒醅中乙酸含量较低(发酵中期至出窖:598.17～692.87 μg/g),且在发酵后期增长动能不足。此外,老厂房在丁酸(156.39～173.19 μg/g)及己酸等短链脂肪酸含量上也明显高于新厂房(76.81～90.37 μg/g),这些脂肪酸是形成复杂酯香(如丁酸乙酯、己酸乙酯)的关键前体。
a-老厂房糟醅风味成分热图;b-新厂房糟醅风味成分热图;c-老厂房微生物-风味网络图;d-新厂房微生物-风味网络图
图6 新老厂房微生物不同发酵阶段酒醅风味成分热图与微生物-风味成分网络图
Fig.6 Heatmap of flavor components and microbe-flavor co-occurrence network in fermented grains from new and old workshops across fermentation stages
注:图6-c、6-d中,degree 代表节点度(节点大小和颜色深浅均反映节点度的大小);group 代表节点分组;abs_rho 代表相关系数的绝对值(线条越粗表示相关性越强);relation 代表相关性,其中 positive(实线)表示正相关,negative(虚线)表示负相关。
酯类是构成白酒香气的主体成分[32]。乳酸乙酯作为白酒中最主要的酯类之一,其动态变化尤为关键。如图6-a、图6-b所示,在窖内发酵阶段,新老厂房酒醅中乳酸乙酯含量均大幅上升,但老厂房的合成效率与最终产量更高(老厂房出窖下层酒醅:308.75 μg/g,新厂房出窖中层酒醅:201.94 μg/g)。乙酸乙酯的生成也存在一定差异,老厂房在堆积中期(16.71 μg/g)即检测到明显积累,而在新厂房堆积阶段未检出。
为解析新老厂房酒醅中风味差异形成与优势微生物的关联作用,进一步基于Pearson相关性分析,构建了微生物属水平关键类群与显著差异风味物质的相关性网络,其结果如图6-c、图6-d所示。分析结果表明,同一微生物属在新老厂房环境中可能扮演不同的生态角色,其代谢功能发生了显著的功能分化或生态位转换。乳杆菌属作为核心菌群,在2个厂房均与关键风味物质相关,但其代谢重心截然不同。在老厂房,其与1,2-丙二醇、2,3-丁二醇、乙酸、辛酸等呈正相关。相比之下,新厂房的乳杆菌则与乙酸异戊酯、苯乙醇等酯类和高级醇关联更强,表明其代谢活动可能更倾向于酯的合成或前体物质的提供。在两个厂房中,乳杆菌属均与异丁酸、戊酸等支链和直链短链脂肪酸呈正相关,表明该菌属是这些特征性风味酸的重要生产者。克罗彭斯特菌属和芽孢杆菌属的相关性特征均指向它们在新厂房可能扮演了更积极的风味消耗者或转化者角色。这2个属在新厂房网络中与2,3-丁二醇、乳酸乙酯、异戊醇、苯乙醇等多种有益风味物质呈负相关。毕赤酵母属在老厂房,其仅与亚油酸乙酯负相关,而在新厂房,它表现出更活跃的代谢状态,与乙醛、乙偶姻等羰基化合物前体的正相关,或许表明其在吡嗪类等风味物质合成中有潜在作用。微生物功能依赖于其所在的生态群落背景,在复杂发酵体系中已有报道。例如,DENG等[9]研究了库德里阿兹威氏毕赤酵母和酿酒酵母,对乳酸胁迫的协同响应,在高乳酸胁迫下,库德里阿兹威氏毕赤酵母在24 h内将乳酸从40.00 g/L降至35.46 g/L,随后,酿酒酵母恢复了其降解乳酸的能力,最后,乳酸降至26.29 g/L。与单一培养相比,共培养显著提高了库德里阿兹威氏毕赤酵母(90%以上)库德里阿兹威氏毕赤酵母(209%以上)的乳酸消耗量。
3 结论
本研究系统解析了酱香型白酒三轮次发酵过程中新老厂房微生物群落结构及风味代谢特征的差异性。结果表明,两个厂房在微生物群落结构、环境微生物来源及代谢特征等方面存在一定区别。
在理化指标变化方面,新厂房酒醅在发酵早期的还原糖与淀粉消耗较快,且全周期各阶段的酸度及乳酸含量均高于老厂房;而老厂房酒醅的碳源消耗与产酸进程相对平缓,但其在出窖发酵后期的乙酸含量高于新厂房。在微生物多样性方面, 新老厂房在不同阶段与空间位点表现出不同的群落丰富度与均匀度特征。细菌群落方面,老厂房酒醅在堆积中期的丰富度较高(OTUs为589.00±25.00),而新厂房则在完堆阶段达到其全阶段最高水平(OTUs为832.00±32.00);在环境位点中,老厂房窖泥前期和器具表面的细菌丰富度均高出新厂房对应位点。真菌群落方面,两厂房酒醅在发酵各阶段无明确的绝对丰度优势,老厂房在出窖下层酒醅中表现出较好的均匀度,而新厂房则在操作器具表面(OTUs为351.00±14.00)和空窖池上层(OTUs为352.00±14.00)表现出更高的环境真菌丰富度。这种阶段性与空间上的多样性分化,客观反映了新老厂房在微生态定殖规律上的系统差异。微生物溯源分析揭示了环境微生物来源的差异。老厂房真菌主要来源于物体表面,其中嗜热真菌属、毕赤酵母属和红曲霉属的贡献率分别达到80.5%、51.5%和63.2%。而新厂房真菌则主要来源于操作器具,毕赤酵母属和红曲霉属的贡献率分别为47.6%和43.9%。且对具体属水平微生物进行溯源分析发现,在窖池发酵阶段,老厂房真菌主要来源于空窖池中层,而新厂房真菌则更多来源于空窖池上层和物体表面。在风味成分积累与网络关联特征方面,老厂房发酵环境在风味物质的合成与积累上整体优于新厂房,其总酯含量从完堆的48.08 μg/g持续增至出窖的385.55 μg/g(新厂房仅为199.31 μg/g),且在挥发性乙酸、丁酸、己酸以及乳酸乙酯等核心风味物质的最终产量上均展现出明显的数据优势。进一步的相关性分析发现,老厂房微生物与风味物质多呈正相关,如乳杆菌属与乙酸、1,2-丙二醇等风味物质显著正相关。本研究从微生物生态学角度揭示了新老厂房在微生态系统结构和功能方面的差异化特征,这些发现为白酒生产过程的精准调控和质量控制提供了重要的理论依据和实践指导。
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