细胞基食品(cell-based foods)是通过在生物反应器中培养动物细胞来生产的一种新兴的蛋白质资源,代表了细胞工程与合成生物学在食品生产中的综合应用[1]。相较于传统畜牧养殖,该技术在环境可持续性、动物福利、食品安全及高效转化方面具有显著优势。培养基作为细胞的“饲料”,为细胞在体外生存、增殖和发育提供了最佳环境,并供给必需的营养物质和功能因子[2]。传统培养基需添加5%～20%胎牛血清(fetal bovine serum, FBS),但FBS价格昂贵、存在伦理争议且批次间差异显著[3]。因此,无血清培养基的配方开发与建立低成本生产技术体系,是实现细胞基食品规模化生产的前提条件。
近期,已有研究报道了一些无血清培养基配方,应用于动物干细胞(如猪或牛肌肉卫星细胞、间充质干细胞)在细胞基食品生产中的扩增或分化,尽管这些培养基含有不同的生长因子或其他功能因子,但绝大多数仍需白蛋白作为其中不可或缺的组分。白蛋白对脂肪酸、激素及微量营养素具有较高的结合能力,并能够促进这些物质进入细胞,此外,其抗氧化特性可以减轻细胞氧化应激与损伤,并在细胞培养条件下维持渗透平衡[4]。传统细胞培养所用的白蛋白主要从牛血浆或人血浆中提取,其工业应用面临着朊病毒或病毒污染及批次间成分不稳定等问题[3]。此时,基于微生物宿主的重组生产技术提供了理想替代方案,可实现高纯度、高稳定性的标准化大规模白蛋白生产。目前虽有重组白蛋白表达的研究报道,但多数聚焦于重组人血清白蛋白(human serum albumin, HSA),且主要用于临床输注。然而在细胞基食品领域使用人血清白蛋白(血浆来源或重组来源)可能引发伦理争议和消费者担忧[2]。因此,建立高效重组牛血清白蛋白(bovine serum albumin, BSA)表达平台,对于动物细胞的无血清培养以及细胞基食品的规模化生产具有关键意义[5]。
BSA是一种不对称的心形球状蛋白,分子质量为66.4 kDa,与HSA具有87.7%的序列同源性[6]。与HSA类似,BSA在肝细胞中合成,最初合成的是前白蛋白原,该前白蛋白原在内质网腔内经信号肽切除形成白蛋白原,随后在高尔基体中通过N端寡肽水解加工,最终生成成熟BSA[6]。成熟BSA的结构由其35个半胱氨酸残基形成的17对二硫键所稳定。目前,重组牛血清白蛋白(recombinant BSA, rBSA)的微生物表达系统可分为原核与真核两类。原核表达宿主难以支持蛋白质正确折叠及翻译后修饰,而真核表达系统具备更复杂的蛋白质折叠机制,能对异源蛋白进行更优异的翻译后修饰,因此成为功能性蛋白质生产的首选宿主[7]。毕赤酵母(Komagataella phaffii)是最广泛应用的真核表达系统,其特点是生长迅速、基因操作简便且内源性蛋白分泌极少,这极大便利了重组蛋白的纯化工作[7-8]。然而,迄今对rBSA的重组表达研究仍然较少,并没有进行系统地表达元件优化的研究,且缺少rBSA与天然BSA的结构及活性对比。
在此,为实现rBSA的高效表达,本研究选取K.phaffii GS115菌株作为宿主菌株,首先筛选出rBSA的最优信号肽与启动子。随后系统筛选辅助因子以增强rBSA的表达与分泌水平。此外,将纯化所得的rBSA,进行二级结构的检测,并在原代牛间充质干细胞(bovine mesenchymal stem cells, bMSCs)培养体系中对其生物活性进行评估。本研究优化了rBSA的外源表达,为细胞基食品产业提供了可持续发展的白蛋白供应解决方案。
1 材料与方法
1.1 实验材料
1.1.1 菌株及质粒
以大肠杆菌DH5α为宿主进行基因克隆。使用毕赤酵母GS115作为重组表达BSA的宿主。质粒pPIC9K用于表达BSA,质粒pGAPZA和pPICZA用于共表达辅助因子。本研究构建的所有菌株及其基因型和质粒如电子版增强出版附表1、附表2所示(https://doi.org/10.13995/j.cnki.11-1802/ts.045999,下同)。
表1 rBSA和天然BSA的二级结构的组成百分比
Table 1 The percentages of the secondary structure elements of rBSA and BSA
二级结构波长190～260 nm/%BSArBSAα-螺旋5857.8β-折叠2.22.7β-转角19.219.3无规卷曲20.420.4
1.1.2 主要试剂
质粒DNA抽提试剂盒、酵母总RNA提取试剂盒、酵母基因组DNA快速抽提试剂盒、BCA蛋白检测试剂盒、氨苄青霉素、博来霉素、遗传霉素,上海生工生物工程公司。限制性内切酶 Sac I、Bln I、Sal I或Xba I,宝日医生物技术有限公司;逆转录试剂盒、ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix试剂盒、CCK-8试剂盒、无缝克隆试剂盒,南京诺唯赞生物科技有限公司;游离巯基检测试剂盒,上海碧云天生物技术有限公司;天然BSA标准品,美国GLPBIO公司;EdU Flow Cytometry Kits(Cy5)试剂盒,美国APExBIO公司;DMEM培养基、FBS、1%抗生素-抗真菌剂,美国Gibco公司。
1.1.3 仪器与设备
UV2450紫外分光光度计,日本Shimadzu公司;ZQZY-HC恒温摇床,上海知楚仪器有限公司;C1000 PCR仪、蛋白电泳仪、Mini-PROTEAN Tetra Cell蛋白电泳仪、Gel Doc凝胶成像系统及Gene Pulser Xcell电转化仪,美国Bio-Rad公司;QuantStudio 3实时荧光定量PCR系统,美国ThermoFisher公司;5290R离心机,德国Eppendorf公司;Cytation3 imaing reader酶标仪,美国BIOTEK公司;JASCO-1700圆二色光谱仪,日本JASCO公司;MF53-N倒置荧光显微镜,广州市明美光电技术有限公司。
1.1.4 培养基
LB培养基(g/L):酵母粉5,蛋白胨10,NaCl 10。
YPD培养基(g/L):酵母粉10,蛋白胨20,葡萄糖20。
MD培养基(g/L):YNB 13.4,葡萄糖20,生物素4×10-4,琼脂粉20。
BMGY培养基(g/L):酵母粉10,蛋白胨20,YNB 13.4,K2HPO4 2.3,KH2PO4 11.8,甘油10,生物素4×10-4。
BMMY培养基(g/L):酵母粉10,蛋白胨20,YNB 13.4,K2HPO4 2.3,KH2PO4 11.8,1%(体积分数)甲醇溶液,生物素4×10-4。
1.2 实验方法
1.2.1 rBSA表达质粒的构建
为构建质粒pPIC9K-α-BSA,使用引物9K-BSA-F/R线性化初始载体质粒pPIC9K,用引物BSA-F/R扩增合成的密码子优化后的BSA基因(编码19-607氨基酸)(GenBank:NP_851335.1)。将BSA片段和线性化质粒pPIC9K利用Gibson组装系统组装成pPIC9K-α-BSA。为了构建具有不同N端信号肽的BSA表达质粒,将pPIC9K-α-BSA质粒中的α-factor分别替换为不同信号肽片段。为了构建具有不同N端杂交信号肽的BSA表达质粒,将pPIC9K-α-BSA质粒中α-factor的pre区分别替换为不同信号肽片段,插入到α-factor的pro区序列的N端上游。为了构建具有不同启动子的BSA表达质粒,将pPIC9K-α-BSA质粒中的PAOX1分别替换为不同启动子片段。所有质粒均由苏州金唯智生物科技有限公司测序。使用的所有引物列表如附表3,本研究中使用的信号肽序列及启动子序列分别见附表4、附表5。
1.2.2 辅助因子共表达质粒的构建
为了构建表达不同辅助因子的质粒,从毕赤酵母基因组中分别扩增出不同的辅助因子片段,然后使用Gibson组装系统分别组装进pGAPZA和pPICZA质粒空载中,以实现基于组成型启动子PGAP的辅助因子共表达及基于诱导型启动子PAOX1的辅助因子共表达。
为了构建能够同时表达两个不同的辅助因子,选择毕赤酵母基因组上的中性位点PNSI-6,设计上下游同源臂,用于共表达的位点整合。为了能够在组成型启动子下构建同时表达CUP5和PAB1的质粒,使用pGAPZA-PAB1质粒扩增PAB1表达框,并从毕赤酵母基因组中扩增启动子PGCW14、终止子TGCW14和CUP5基因,将这些基因片段及PNSI-6的上下游同源臂融合成质粒pGAPZA-PAB1-GCW14-CUP5。为了能够在诱导型启动子下构建同时表达HRD1和HAC1的质粒,使用pPICZA-HRD1质粒扩增HRD1表达框,并从毕赤酵母基因组中扩增启动子PDAS2、终止子TDAS2和HAC1基因,将这些基因片段及PNSI-6的上下游同源臂融合成质粒pPICZA-HRD1-DAS2-HAC1。
所有质粒和引物对序列列于附表2、附表3,本研究中使用的辅助因子基因序列列于附表4。
1.2.3 重组毕赤酵母菌株的构建
使用Sac I、Bln I、Sal I或Xba I酶对质粒进行线性化,然后将纯化后的酶切产物电转至相应的毕赤酵母感受态细胞中,电转仪设定为1.5 kV,电容25 μF,电阻200 Ω,时间5 ms。电击后,迅速加入1 mL的1 mol/L山梨醇溶液,并置于30 ℃、220 r/min条件下培养1 h,在3 000 r/min下离心5 min,弃上清液(900 μL)后将剩余的细胞重悬,涂布至MD平板或含有100 μg/mL博来霉素的YPD平板中,30 ℃下培养2～4 d,筛选阳性克隆用于保藏及后续实验。
1.2.4 重组毕赤酵母菌株的发酵
孔板发酵时,挑选单菌落接种于含1 mL BMGY培养基的24深孔板中,在30 ℃和220 r/min条件下培养24 h后,4 000 r/min离心5 min,在4 ℃条件下收集细胞,并用无菌水洗涤2次,随后用1 mL BMMY培养基重悬,在30 ℃和220 r/min条件下培养72 h,每间隔12 h加入1%(体积分数)甲醇。
摇瓶发酵时,挑选单菌落接种于5 mL YPD培养基中,在30 ℃和220 r/min条件下作为种子液培养16 h。将种子培养液转移至50 mL BMGY培养基中,在相同的培养条件下培养至OD600=15,在6 000 r/min下离心5 min,在4 ℃下收集细胞,并用无菌水洗涤2次,随后用50 mL BMMY培养基重悬,在30 ℃和220 r/min条件下培养72 h,每间隔12 h加入1%(体积分数)甲醇溶液。
1.2.5 转录水平分析
将待测酵母菌株根据上述摇瓶发酵步骤进行发酵时,取甲醇诱导72 h时的酵母菌体,使用酵母总RNA提取试剂盒从酵母细胞中提取总RNA,随后采用逆转录试剂盒将提取的RNA逆转录为cDNA。使用ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix试剂盒配置qPCR体系,使用QuantStudio 3实时荧光定量PCR系统进行实时定量PCR(RT-qPCR)分析。反应结束后,根据实验数据中组别的Ct值,计算2-ΔΔCt值,从而可以确定目的基因的相对转录水平。Ct值是指反应体系的荧光信号达到阈值时的扩增循环数,因此模板浓度越高,Ct值越小。GAPDH作为本次实验的内源性参考基因,进行标准化校正。qPCR所用引物详见附表3。
1.2.6 rBSA产量测定
发酵结束时,通过测量600 nm波长下的吸光度(OD600)测定细胞密度。同时,将发酵液以9 000 r/min离心10 min,取离心后上清液与蛋白上样缓冲液均匀混合后,于100 ℃下加热10 min,取10 μL处理后样品在120 V条件下进行蛋白电泳90 min。使用考马斯亮蓝R250对蛋白胶进行染色10 min,再进行过夜脱色处理后,使用凝胶成像仪在统一参数下对蛋白胶进行曝光拍照后,将采集到的图像导入到Image J软件中,对其蛋白条带进行灰度分析。
在评估不同菌株的rBSA相对表达水平时,使用0.1 g/L的天然BSA(记为std)作为阳性对照,保持与待测发酵样品统一的样品处理方式及上样量,在同一蛋白胶中进行电泳,用于辅助计算rBSA表达水平的倍数变化。rBSA相对表达倍数变化是待测样品中rBSA表达量相对于参比菌株rBSA蛋白表达量的倍数。对于rBSA相对表达倍数变化的计算,其中信号肽、启动子、高拷贝筛选部分,是以GA1αB菌株表达的rBSA为参比蛋白;在辅助因子共表达部分,则是以#2菌株的rBSA样品为参比蛋白;在不同诱导时间点的发酵对比中,是以72 h处表达的rBSA样品为参比蛋白。
在定量评估rBSA的产量时,使用浓度为0.50、0.40、0.35、0.30、0.25、0.20、0.15 g/L及0.10 g/L的天然BSA绘制灰度标准曲线,并在0.1～0.5 g/L BSA范围内获得了线性标准曲线(R2>0.99),从而能够将样品条带灰度直接转换为rBSA的浓度。
1.2.7 rBSA蛋白纯化
将离心收集的培养上清液进行镍柱纯化,使用纯化A液(50 mmol/L PBS, pH 7.4)作为结合缓冲液,纯化B液(50 mmol/L PBS, 20 mmol/L咪唑, pH 7.4)作为洗涤缓冲液,纯化C液(50 mmol/L PBS, 300 mmol/L咪唑, pH 7.4)作为洗脱缓冲液,进行rBSA的纯化。将得到的rBSA溶液通过过夜透析除盐后进行超滤浓缩。采用BCA蛋白检测试剂盒测定浓缩后rBSA浓度。
1.2.8 rBSA的二级结构检测
游离的巯基与5,5′-二硫代双[2-硝基苯甲酸,5,5′-dithio-bis-(2-nitrobenzoic acid),DTNB]发生反应会生成黄色可检测的2-硝基-5-硫代苯甲酸盐阴离子(2-nitro-5-thiobenzoate anion,TNB),其在412 nm处有强吸收峰。使用游离巯基检测试剂盒测定天然BSA标准品和rBSA的游离巯基浓度。通过圆二色光谱仪对天然BSA标品和rBSA的二级结构进行分析,蛋白质用无菌水稀释至浓度为0.02 g/L,并加入厚度为1 mm的石英比色皿中,在190～260 nm波长范围内进行扫描,以水作为空白对照,测定样品的CD值。
1.2.9 rBSA的生物活性验证
采用CCK-8 Cell Counting Kit测定法来检测rBSA对细胞活力的作用。将bMSCs置于含体积分数1% FBS以及体积分数1%青/链霉素(P/S)的DMEM中,在37 ℃和体积分数5% CO2条件下培养。将2×103个细胞接种到3个96孔板中,待细胞贴壁后,更换为含有1 g/L rBSA或天然BSA的培养基中,其中对照组加入等体积的DMEM。待分别培养3、5、7 d后,进行明场观察拍照,并向每个孔中加入10 μL CCK8溶液,于37 ℃、体积分数5% CO2条件下孵育2 h,使用酶标仪测定450 nm处测定各孔的吸光值。
采用APE BIO的EdU Flow Cytometry Kits(Cy5)试剂盒来测定rBSA对细胞增殖的作用,其中EDU/Cy5 azide可以荧光标记增殖细胞的DNA。将1.5×105个细胞接种至6孔板中,经不同培养基孵育72 h后,每个组别设置空白对照(无EdU组),其余分别添加EdU试剂,使其终浓度为30 μmol/L,继续培养4 h。用含质量分数1% BSA的PBS将细胞洗涤2次,加入体积分数4%多聚甲醛室温避光孵育15 min,固定完成后,再用含质量分数1% BSA的PBS将细胞洗涤2次。加入体积分数0.5% TritonX-100室温孵育15 min,透化完成后,用PBS洗涤细胞1次。加入按照说明书配制的含Cy5 azide的Click反应液,充分混匀后,室温避光孵育30 min,用体积分数0.5% TritonX-100洗涤细胞1次。加入DAPI室温避光孵育10 min后,进行显微镜荧光拍摄。
1.3 数据分析
实验分别独立进行,并且至少重复了3次。结果以“平均值±标准差”的形式呈现。对于多组间的差异分析,使用GraphPad Prism软件进行ANOVA检验分析,P<0.05被认为具有统计学意义。不同的小写字母表示存在显著差异(P<0.05),相同的小写字母表示无显著差异(P>0.05)。
2 结果与分析
2.1 毕赤酵母表达rBSA的信号肽优化
将pPIC9K-α-BSA质粒整合进GS115基因组中,得到菌株GA1αB,是以PAOX1为启动子,α-factor为信号肽的rBSA表达菌株。α-factor是毕赤酵母中表达外源分泌蛋白的经典信号肽,其分泌信号包含2个区域:引导蛋白质进行翻译后向内质网(endoplasmic reticulum, ER)转位的pre区,以及介导受体依赖性包装进入COIPII运输囊泡的pro区[9]。但α-factor分泌信号肽的局限性在于其pre区的引导效率相对较低,研究表明,使用其他信号肽或替换α-factor的pre区序列以构建杂交信号肽,可以提高重组蛋白质的分泌表达水平[9]。
为了提高rBSA的分泌表达水平,在菌株GA1αB的基础上,使用其他19种信号肽替代α-factor,同时将α-factor的pre区序列替换为上述19个信号肽,得到19种杂交信号肽,以此替换菌株GA1αB的α-factor。这19种信号肽包括10种毕赤酵母内源信号肽(PRI1、0030、PHO1、SCW11、DSE4、EXG1、GAS1、DAN4、MSB2、FRE2)、6种异源信号肽(OST1、SUC2、INU1A、Killer、HFBI、HFBII)、1种BSA自身信号肽和2种α-factor的突变体(α-m、M4FI)[10-11]。在24深孔板中进行的信号肽及杂交信号肽的初步筛选显示,4种信号肽(α-m、M4FI、HFBI-α和α-m-α)菌株显著提高了rBSA的表达水平(图1-a～图1-d)。在摇瓶水平进一步验证表明,M4FI信号肽菌株(GA1M4FIB)的rBSA表达水平最高,是GA1αB菌株的2.07倍(图1-e和图1-f)。
a-携带不同信号肽的rBSA表达菌株在孔板发酵72 h后的蛋白胶图;b-携带不同信号肽的rBSA表达菌株在孔板发酵72 h后的OD600值和rBSA相对表达倍数;c-携带不同杂交信号肽的rBSA表达菌株在孔板发酵72 h后的蛋白胶图;d-携带不同杂交信号肽的rBSA表达菌株在孔板发酵72 h后的OD600值和rBSA相对表达倍数;e-携带不同信号肽的rBSA表达菌株在摇瓶发酵72 h后的蛋白胶图;f-携带不同信号肽的rBSA 表达菌株在摇瓶发酵72 h后的OD600值和rBSA相对表达倍数
图1 rBSA表达中信号肽的优化
Fig.1 Optimization of signal peptides for rBSA expression
注:不同小写字母表示差异显著(P<0.05)(下同)。
M4FI是α-factor的突变体,是通过在α-factor起始密码子后插入AIP三个氨基酸及在α-factor的引导序列和内切蛋白酶间插入EEAEAEAEPK十个氨基酸得到的[11]。其中,AIP氨基酸是AOX1基因起始密码子后的3个氨基酸,借助AOX1启动子能够高效启动AOX1基因在毕赤酵母中的表达,实现M4FI信号肽引导的目的蛋白的高效转录[11]。而EEAEAEAEPK氨基酸序列的插入可以优化Kex2内切酶的切割,进一步提高目的蛋白的分泌表达[9]。因此,选用M4FI信号肽用于rBSA的重组表达,并继续筛选和优化表达元件,寻找最佳的表达元件组合。
2.2 毕赤酵母表达rBSA的启动子优化
毕赤酵母重组表达中常用的启动子可以分为组成型启动子和诱导型启动子[12]。为了提高 rBSA 的重组表达,选取其他17种毕赤酵母内源启动子替代GA1αB菌株中的PAOX1,其中包括6种组成型启动子(PGAP、PGAPm、PTEF1、PGCW14、PSDH、PGTH1)[13]、3种乙醇诱导型启动子(PADH2、PADH2m、PICL1)[14]、8种甲醇诱导型启动子(PCAT1、PCAT1-m、PDAS1、PDAS2、PFLD1、PAOX2、PAOX2m、PAOX1m)[15-16]。孔板发酵结果显示,PDAS2、PAOX2m和PAOX1m启动子菌株的rBSA表达水平较高(图2-a和图2-b)。摇瓶水平的进一步验证结果显示,PAOX2m启动子菌株(GA2mαB)的rBSA表达水平最高,是GA1αB菌株的2.04倍(图2-c和图2-d)。
a-携带不同启动子的rBSA表达菌株在孔板发酵72 h后的蛋白胶图;b-携带不同启动子的rBSA表达菌株在孔板发酵72 h后的OD600值和rBSA相对表达倍数;c-携带不同启动子的rBSA表达菌株在摇瓶发酵72 h后的蛋白胶图;d-携带不同启动子的rBSA表达菌株在摇瓶发酵72 h后的OD600值和rBSA相对表达倍数;e-携带PAOX1-M4FI、PAOX2m-α-factor和PAOX2m-M4FI的rBSA表达菌株在摇瓶发酵72 h后的蛋白胶图;f-携 带PAOX1-M4FI、PAOX2m-α-factor和PAOX2m-M4FI的rBSA表达菌株在摇瓶发酵72 h后的OD600值和rBSA相对表达倍数
图2 rBSA表达中启动子的优化
Fig.2 Optimization of promoters for rBSA expression
PAOX2m是PAOX2的突变体,是通过将PAOX2中含AOX2-URS1、AOX2-UAS元件的-1 529到-274位置序列删除,并在-273位置依次插入AOX2-UAS的正向序列和反向序列得到的[15]。AOX2启动子包含3个转录调控原件:正向调控原件AOX2-UAS、负向调控原件AOX2-URS1和AOX2-URS2[17]。甲醇诱导的转录活性是通过AOX2-UAS实现的,但负向调控原件AOX2-URS1和AOX2-URS2共同作用时会抑制AOX2-UAS的功能,导致AOX2基因在野生型启动子中的表达水平较低[17]。而PAOX2m中AOX2-URS1的删除破坏了负向调控原件的共同作用,解除了对AOX2-UAS功能的抑制,同时再插入AOX2-UAS的正向序列和反向序列,进一步增强了启动子的转录活性[18]。因此,选用PAOX2m启动子用于rBSA的重组表达,并与筛选的最优信号肽M4FI相结合,以实现rBSA的高效分泌表达。
2.3 毕赤酵母表达rBSA的最优启动子信号肽结合及高拷贝菌株筛选
将筛选到的最优启动子PAOX2m和最优信号肽M4FI结合,得到rBSA表达菌株GA2mM4FIB。通过对GA1αB、GA1M4FIB、GA2mαB、GA2mM4FIB菌株进行摇瓶发酵,SDS-PAGE对比结果显示,GA2mM4FIB菌株的rBSA表达水平最高,是GA1αB菌株的2.57倍(图2-e和图2-f)。
同时,为了得到高拷贝rBSA表达菌株,将5 μg线性化pPIC9K-AOX2m-M4FI-BSA质粒电转进GS115感受态细胞中,涂布的MD平板中长出的单菌落转移至含4 g/L G418 YPD平板中筛选,共获得24株抗性菌株。通过24株抗性菌株的孔板发酵对比,SDS-PAGE结果显示GA2mM4FIB-2、GA2mM4FIB-7、GA2mM4FIB-9、GA2mM4FIB-11菌株(分别记为#2、#7、#9、#11菌株)的rBSA表达水平较高(图3-a和图3-b),将这4株菌进行摇瓶发酵及转录水平对比后显示,尽管#2菌株的rBSA转录水平不是最高的,但其蛋白表达量最高,是起始菌株GA1αB的3.89倍(图3-c～图3-e)。这种差异可能是由mRNA调控过程、mRNA翻译效率或蛋白折叠分泌过程的差异所导致的,从而造成蛋白质表达与转录之间的不匹配,这一发现与之前的研究结果一致,并且表明高拷贝菌株中的蛋白质表达水平具有很大的多样性,需要从多个角度进行深入研究[19]。综上所述,最终得到了1株PAOX2m和M4FI信号肽结合的高拷贝rBSA表达菌株#2菌株,后续将在此菌株上进一步增强rBSA的胞外表达。
a-不同多拷贝菌株在孔板发酵72 h后的蛋白胶图;b-孔板中不同多拷贝菌株在孔板发酵72 h后的OD600值和rBSA相对表达倍数;c-菌株#2、#7、#9、#11和GA1αB中rBSA的相对mRNA表达水平;d-菌株#2、#7、#9、#11和GA1αB在摇瓶发酵72 h后的蛋白胶图;e-菌株#2、#7、#9、 #11 和GA1αB在摇瓶发酵72 h后的OD600值和rBSA相对表达倍数
图3 rBSA表达中的高拷贝菌株筛选
Fig.3 Screening of high-copy strains for rBSA production
2.4 毕赤酵母表达rBSA中辅助因子基因的共表达
为了进一步提高rBSA的表达量,在#2菌株中分别过表达20种辅助因子,以研究它们对rBSA胞外分泌表达的影响。其中包括7种伴侣蛋白(PDI1、KAR2、ERO1、CPR5、SRP54、CUP5、HRD1)、3种蛋白转录因子(HAC1、GAL4-like、AFT1)、3种蛋白翻译因子(PAB1、eIF4E、BCY1)、4种囊泡转运相关蛋白(SEC1、SLY1、KEX2、Sso)和3种甲醇启动子转录因子(Mxr1、Mit1、Prm1)。在基于PGAP的辅助因子共表达中,初步孔板发酵的结果显示,ERO1、CUP5、HAC1、GAL4-like、HRD1、PAB1的过表达对rBSA的表达水平有所提升(图4-a和图4-b),而通过进一步的摇瓶发酵结果显示,伴侣蛋白CUP5共表达菌株(GA2mM4FIB2G-CUP5)的rBSA表达水平最高,是#2菌株的1.35倍,其次是蛋白翻译因子PAB1共表达菌株(GA2mM4FIB2G-PAB1),其rBSA表达水平是#2菌株的1.16倍(图4-c和图4-d)。
a-基于PGAP的辅助因子共表达菌株在孔板发酵72 h后的蛋白胶图;b-基于PGAP的辅助因子共表达菌株在孔板发酵72 h后的OD600值和rBSA相对表达倍数;c-基于PGAP的辅助因子共表达菌株在摇瓶发酵72 h后的蛋白胶图;d-基于PGAP的辅助因子共表达菌株在摇瓶发酵72 h后的OD600值和rBSA相对表达倍数;e-基于PAOX1的辅助因子共表达菌株在孔板发酵72 h后的蛋白胶图;f-基于PAOX1的辅助因子共表达菌株在孔板发酵72 h后的OD600值和rBSA相对表达倍数;g-基于PAOX1的辅助因子共表达菌株在摇瓶发酵72 h后的蛋白胶图;h-基于PAOX1的辅助因 子共表达菌株在摇瓶发酵72 h后的OD600值和rBSA相对表达倍数
图4 #2菌株中辅助因子的共表达
Fig.4 Co-expression of helper factors in strain #2
CUP5p是酵母液泡(H+)ATP酶(V-ATP 酶)V0域的c亚基[20]。V-ATP酶属于一类依赖ATP的质子泵,可使包括酵母中央液泡、内体、高尔基体网络和分泌小泡在内的多个细胞器酸化,且其功能对许多过程都很重要,包括内吞作用、蛋白质加工、降解、靶向、液泡膜上的偶联运输、铜铁代谢及线粒体代谢等[21]。其中V0域是一个由5个亚基组成的跨膜结构,负责跨膜质子运输,而CUP5p对V0域的组装至关重要[20]。由此通过过表达CUP5,可能增强了V-ATP酶对蛋白质加工和液泡膜偶联运输等方面的作用,从而提高rBSA的细胞外表达。
在基于PAOX1的辅助因子共表达中,初步孔板发酵的结果显示,PDI1、HAC1、GAL4-like、HRD1、AFT1、Sso的过表达可显著提升rBSA的表达水平(图4-e 和图4-f),而通过进一步的摇瓶发酵结果显示,伴侣蛋白HRD1共表达菌株(GA2mM4FIB2A-HRD1)的rBSA表达水平最高,是#2菌株的1.25倍,其次是蛋白转录因子HAC1共表达菌株(GA2mM4FIB2A-HAC1),其rBSA表达水平是#2菌株的1.18倍(图4-g和图4-h)。
HRD1p是内质网相关降解(ERAD)中最重要的E3泛素连接酶之一[22]。ERAD能够将错误折叠、未组装或过剩的蛋白质从内质网中清除,从而减轻细胞的应激反应。HRD1p是一个多次跨膜蛋白,它的N端和C端都朝向细胞质,它作为一个大型复合物的核心进行运作,其特定的跨膜螺旋还参与底物识别和易位[23]。HRD1p自身形成一个蛋白跨膜通道,负责将错误折叠的蛋白从ER腔/膜内易位到细胞质侧进行泛素化,多聚泛素链标记的底物被完全转至到细胞质中,递送至26S蛋白酶体降解[24]。因此,HRD1基因的过表达,可以提高ERAD效率,缓解内质网的压力,从而为rBSA的重组表达提供更好的环境。
2.5 毕赤酵母表达rBSA中双辅助因子的串联共表达
根据上述结果,构建菌株GA2mM4FIB2G-CP,使其基于组成型启动子同时过表达CUP5和PAB1;构建菌株GA2mM4FIB2A-HH,使其基于诱导型启动子同时过表达HRD1和HAC1(图5-a)。同时2株菌均利用PAOX2m和信号肽M4FI来驱动rBSA的表达。在摇瓶实验中,GA2mM4FIB2A-HH菌株的rBSA表达水平最高,是#2菌株的1.51倍(图5-b和图5-c)。随后,在GA2mM4FIB2A-HH菌株的摇瓶发酵中,对不同的诱导时间点进行取样,SDS-PAGE结果显示,rBSA的表达在144 h达到峰值(图5-d和图5-e)。此外,通过灰度分析对菌株GA1αB和GA2mM4FIB2A-HH在144 h培养后的上清液中的rBSA含量进行了定量检测。结果表明,GA2mM4FIB2A-HH菌株的rBSA产量为0.40 g/L,是起始菌株GA1αB的8倍(图5-f～图5-h)。
a-用于构建菌株GA2mM4FIB2G-CP和GA2mM4FIB2A-HH的DNA片段;b-共表达不同辅助因子菌株在摇瓶发酵72 h后的蛋白胶图;c-共表达不同辅助因子菌株在摇瓶发酵72 h后的OD600值和rBSA相对表达倍数;d-GA2mM4FIB2A-HH菌株在摇瓶发酵不同诱导时间点的蛋白胶图;e-GA2mM4FIB2A-HH菌株在摇瓶发酵不同诱导时间点的OD600值和rBSA相对表达倍数;f-菌株GA1αB和GA2mM4FIB2A-HH在摇瓶发 酵144 h处的蛋白胶图;g-BSA浓度与其灰度值之间的标准曲线;h-菌株GA1αB和GA2mM4FIB2A-HH在摇瓶发酵144 h处的rBSA产量
图5 #2菌株中双辅助因子的共表达
Fig.5 Co-expression of dual helper factors in strain #2
异源蛋白表达会消耗额外的细胞资源,给细胞带来负担,导致细胞应激,从而可能会降低胞外蛋白表达水平。过表达HAC1可以直接激活UPR通路,而过表达HRD1可以提高ERAD的效率,联合表达HRD1和HAC1后大幅度缓解了内质网压力,释放应激维持内质网稳态,有助于外源蛋白的高效表达。现有rBSA重组表达的研究中,KHERSONSKY等[25]在大肠杆菌中实现了rBSA的重组表达,并针对其热稳定性的提高,设计了相关突变体蛋白的表达,在摇瓶水平中实现了2～100 mg/L的表达水平;AGUIAR等[26]在大肠杆菌中重组表达了BSA的结构域II,在摇瓶中达到了14.7～23.3 mg/L的表达量,同时验证了rBSA片段对赭曲霉毒素A的结合作用;KIM等[27]在毕赤酵母中实现了rBSA的重组表达,并将rBSA应用至牛肌肉卫星细胞中的培养中。但仍没有对比rBSA与天然BSA的结构和生物活性差异的研究。
2.6 rBSA的二级结构检测
在结构分析前,通过镍亲和层析对rBSA进行纯化,随后进行透析和超滤处理(图6-a)。由此获得高浓度rBSA溶液,经BCA法测定浓度为28.5 g/L。为评估rBSA是否具有天然结构,进一步检测了其二硫键的稳定性以及二级结构特征。rBSA中的游离巯基浓度与血浆提取的天然BSA相比无统计学显著差异(图6-b),表明rBSA在毕赤酵母中完成了正确的折叠,未发生二硫键配对错误。随后通过圆二色谱分析了rBSA的二级结构。结果显示rBSA与天然BSA的圆二色谱图高度重叠,两者均在208 nm和222 nm附近呈现2个特征性负峰,表明存在α-螺旋结构(图6-c)。通过CDNN软件估算的二级结构元素百分比结果一致,其中螺旋结构占主导地位(表1)。综合结果表明,由毕赤酵母表达的rBSA与天然BSA具有高度相似的结构。
a-rBSA经镍柱纯化前后的蛋白胶图,其中第1、2、3、4和5个泳道分别代表发酵液、流穿液、洗涤液、平衡缓冲液和洗脱出的rBSA;b-天然BSA和rBSA的游离巯基含量;c-天然BSA和rBSA的CD图谱;d-不含/含天然BSA/rBSA培养基孵育3、5、7 d后的细胞形态;e-不含/含天然BSA/rBSA孵育3、5、7 d后的细胞活力;f-不含/含天然BSA/rBSA孵育3、5、7 d后的细胞绝对细胞数量;g-EDU染色,其中EDU标记增殖期细 胞,DAPI标记总细胞;h-EDU+细胞定量分析
图6 rBSA的二级结构及生物活性验证
Fig.6 Secondary structure and bioactivity validation of rBSA
KOBAYASHI[28]以及SUGIO等[29]的研究表明,重组白蛋白与天然白蛋白具有相同的一级、二级结构,且根据X射线晶体结构分析,两者的均方根偏差(root mean square deviation, RMSD)为0.24 Å,三级结构几乎相同。刘卿[30]研究发现,重组白蛋白和天然白蛋白的翻译后修饰的种类相同,都具有乙酰化、琥珀酰化、磷酸化、巴豆酰化、β-羟基丁酰化等翻译后修饰,且均未检出N-糖基化,但两者的修饰位点不完全相同,这是由于毕赤酵母与动物细胞表达系统对蛋白的翻译后修饰具有一定的差异。毕赤酵母重组蛋白的二级结构与三级结构与天然蛋白高度相似,但翻译后修饰的不完全相同,从而rBSA和天然BSA的CD谱图存在一定的差异(表1)。
2.7 rBSA在细胞培养中的生物活性验证
为评估rBSA是否具有生物活性,检测了其对bMSCs存活率和增殖能力的影响。首先,将bMSCs在含1% FBS的DMEM培养基中培养3、5 d和7 d,其中培养基中不添加任何补充剂或添加1 g/L天然BSA或rBSA。CCK-8检测显示,两种BSA均显著提升细胞活力(相较于对照组),且rBSA在所有时间点均优于天然BSA(图6-d～图6-f)。EdU实验结果同样显示,rBSA与天然BSA对bMSCs增殖具有相似作用。与对照组相比,rBSA和天然BSA分别使EdU+细胞比例增加95%和50%(图6-g和图6-h)。
这些结果与已有的研究结果一致,该研究已表明重组HSA的活性相较于天然HSA更为显著[31]。天然血清白蛋白和重组血清白蛋白在二级结构与三级结构上具有高度的相似性[32],但由于重组蛋白与天然蛋白的翻译后修饰位点或数量的不同,影响着蛋白对脂肪酸等物质的结合与运载作用,进而影响其与细胞生长的生物学功能[30]。且白蛋白通过胞饮作用进入细胞后,可以通过其III结构域与FcRn受体结合被运送至细胞外,实现白蛋白的回收利用,延长其半衰期[33]。因此,白蛋白可以共价或非共价的方式与多种内源性和外源性配体结合,且白蛋白与细胞表面相互作用,进而与细胞内空间相互作用,所以其可以通过相关配体载荷的性质影响广泛的细胞过程[34]。而由于重组白蛋白和天然白蛋白的翻译后修饰不完全相同,从而影响白蛋白与脂肪酸等物质的结合以及与FcRn位点的结合效率,导致重组白蛋白在细胞增殖中的效果优于天然白蛋白。
3 结论与展望
在本研究中,对毕赤酵母GS115进行了基因工程改造,以实现BSA的重组表达。通过对18个启动子和38个信号肽的系统筛选,确定了最优的启动子为PAOX2m,最优的信号肽为M4FI。它们的结合使细胞外rBSA的产量相对于起始菌株提高了2.57倍。在此基础上,伴侣蛋白HRD1和蛋白质转录因子HAC1的共表达进一步增强了胞外rBSA的表达,达到0.40 g/L,是原始菌株的8倍。对rBSA与天然BSA的二级结构进行比较,发现它们具有高度相似性和正确的折叠。此外,在牛间充质细胞培养中,rBSA的效果优于天然BSA,证实了重组表达产物的生物活性。本研究提供了一种无动物源成分的血浆衍生BSA的替代品,以及细胞基食品可持续生产的关键辅助试剂。
本研究只检测了菌株诱导72 h处rBSA的mRNA相对表达水平,对整个发酵过程中基因转录动态过程并不清晰,并且未验证菌株的蛋白转录翻译因子、UPR及ERAD等相关基因的转录水平变化。后续可以在转录水平发生显著变化期间,进行多点采样,以绘制完整的转录动力学曲线,为后续的发酵工艺放大和蛋白生产提供时间指导,并为蛋白表达水平变化提供解释基础。同时,本研究仅在目的基因表达元件、辅助基因过表达层面进行rBSA表达水平的提高,后续可通过优化发酵温度、甲醇添加剂量、pH、培养基成分等[7],进一步提高摇瓶中的rBSA表达水平,并通过发酵罐扩大培养及发酵参数优化,得到rBSA的最大产量。
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