浓香型白酒作为中国传统蒸馏酒的典型代表,以独特的窖香风味和醇厚口感享誉国内外[1],其典型风味特征主要来源于以己酸乙酯为代表的酯类化合物,这些风味物质的形成与传统的泥窖窖池固态发酵工艺密切相关[2-3]。窖池在长期生产实践中形成的复杂微生物群落(包括己酸菌、甲烷菌、酵母菌等)构建了稳定的代谢网络,成为决定白酒风味品质的关键因素[4-5]。然而,这种浓香型白酒的酿造方式面临劳动强度大、生产周期长、工艺稳定性差等突出问题,难以适应现代白酒产业规模化发展的需求[6-7]。
近年来,随着白酒产业的技术升级,机械化酿造通过实现入窖、起窖、上甑蒸馏、摊晾、下曲等关键工序的自动化控制,在提升生产效率、保证工艺稳定性方面展现出显著优势,已成为行业转型升级的重要方向。但不论是机械化还是传统的酿造过程,工艺控制与发酵过程的调控尤为关键[8-10]。如糟醅的酸度直接影响发酵过程中微生物的代谢活性和糖化效率[11],淀粉含量则决定了发酵底物的供给水平,而不同窖龄窖池中微生物群落结构的差异也可能导致工艺参数响应机制的显著不同[4,12]。任海伟等[13]研究使用统计学方法证实了窖龄与微生物多样性的正相关性(P<0.01),且对窖泥微生物群落组成的影响程度要强于窖池位置。与传统工艺相比,机械化酿造在窖池规模、参数控制、酿造环境等方面存在明显差异[14-15],特别是机械化酿造过程在不同窖龄条件下对白酒酿造具有的长期影响也尚未明确,从而成为制约浓香型白酒机械化发展的重要瓶颈。
本研究以不同窖龄机械化酿造窖池的正常生产数据为基础,系统分析窖龄对糟醅理化特性及原酒主要风味成分在窖池空间分布上的影响,以揭示机械化酿造过程中窖池微生态随窖龄的演替规律及其对发酵产物空间分异的作用机制,以期为浓香型白酒机械化酿造工艺的优化与窖池管理提供理论依据和数据支撑。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 实验材料
糟醅和原酒:在川南某浓香型白酒酒厂的3个机械化酿造车间,窖龄分别为11、5、4年,选择发酵时间为3个月窖池的出窖糟醅以及对应原酒。
1.1.2 主要试剂
NaOH、葡萄糖、HCl、CuSO4、亚甲基蓝、酒石酸钾钠、K4[Fe(CN)6]、KH2PO4、可溶性淀粉、乙酸、CH3COONa、酚酞等(分析纯),成都市科龙化工试剂厂;NaCl(分析纯),国药集团化学试剂有限公司;无水乙醇(色谱纯),德国默克公司;甲醇、正丙醇、异丁醇、正丁醇、仲丁醇、异戊醇、乙醛、乙酸乙酯、丁酸乙酯、戊酸乙酯、己酸乙酯、乳酸乙酯、乙酸、乙酸正戊酯、叔戊醇等标准品(色谱纯),天津光复化工有限公司。
1.2 仪器与设备
8890-5977B GC-MS联用仪,美国Agilent公司;945/940离子色谱仪,Metrohm(瑞士万通)有限公司;ml503T/02电子分析天平,梅特勒-托利多(上海)仪器有限公司;Labserv-LS-0610电热恒温干燥箱,上海一恒科仪器有限公司。
1.3 实验方法
1.3.1 样品采集
每个机械化酿造车间中随机选取10口窖池作为取样对象。对于选定取样的窖池,分别于窖池上层(表层下方0.5 m处)、中层(表层下方1.5 m处)及下层(黄水线下方0.2 m处)的水平面上,沿窖池四周和中心位置五点取样并混合均匀,分别获得该窖池的上、中、下层糟醅样品。同时根据糟醅所在层次,在车间摘酒区域从对应层次的全部原酒中采集具有代表性的原酒样品,将取得的糟醅和原酒样品置于4 ℃冰箱中保存。
1.3.2 糟醅理化指标的测定
参照T/CBJ 004—2018《固态发酵酒醅通用分析方法》对糟醅水分、淀粉、还原糖含量(均为质量分数)和酸度进行检测。
1.3.3 原酒主要风味成分测定
采用直接进样法,取10 mL酒样于试管中,加入100 μL混合内标(255.24 mg/L叔戊醇、215.10 mg/L乙酸正戊酯),充分振荡均匀后进行GC分析。
气相色谱条件:色谱柱为DB-WAX UI聚乙二醇毛细管柱(30.00 m×0.53 mm×0.50 μm),气相进样口温度250 ℃,检测器温度250 ℃,载气为高纯度N2,流速1.0 mL/min,进样量1 μL,分流比40∶1,程序升温条件为初始温度35 ℃,保持1 min,以3 ℃/min升到70 ℃,再以3.5 ℃/min升到180 ℃,再以15 ℃/min升到210 ℃,保持6 min。
半定量分析:以各酯类、醇类组分单标准品色谱峰的保留时间为依据进行定性,采用内标法进行半定量分析。
1.3.4 数据处理
结果以“平均值±标准差”表示,并采用SPSS 23.0软件进行单因素方差分析及线性回归分析;柱状图基于Origin 2024软件绘制;主成分分析(principal component analysis,PCA)及相关图形在R 4.4.3环境中主要使用ggplot2与FactoMineR等程序包完成。
2 结果分析与讨论
2.1 各窖池不同层次出窖糟醅理化指标对比
2.1.1 各窖池不同层次出窖糟醅水分含量对比
如图1所示,各个窖池相同层次之间的糟醅水分差异均未达到显著水平(P>0.05)。但对于同一窖龄窖池,下层糟醅水分普遍高于中层和上层糟醅水分含量,其中11年和5年窖池的上层和下层糟醅之间水分差异达到显著水平(P<0.05),5年和4年窖池的中层和下层糟醅之间水分差异达到显著水平(P<0.05)。各窖池糟醅水分整体呈现大致相同的波动趋势,窖内发酵过程中糟醅水分的迁移与分布特征相对稳定。
图1 各窖池不同层次出窖糟醅水分含量对比
Fig.1 Comparison of moisture contents in fermented grains from different layers of various fermentation pits
注:不同小写字母表示差异显著(P<0.05)(下同)。
2.1.2 各窖池不同层次出窖糟醅酸度对比
如图2所示,11年窖池的糟醅酸度在各层次间波动较小,下层略高,各层次糟醅间的差异均不显著(P>0.05)。5年窖池的中层糟醅酸度达到峰值,上层与下层相对较低,4年窖池的上层和下层糟醅酸度较高,中层最低。总体来看,出窖糟醅的酸度随窖龄增加呈上升趋势,表现为11年>5年>4年,这一现象可能与窖池微生态随时间的演替有关。研究表明,随着窖龄增长,窖泥中微生物群落结构趋于稳定,功能菌群(如己酸菌、丁酸菌等)的丰度和代谢活性增强,从而促进了有机酸(如己酸、乳酸、丁酸等)的积累[5,16]。这些有机酸不仅是白酒风味的关键前体物质,还可通过与乙醇发生酯化反应生成相应的酯类(如己酸乙酯、乳酸乙酯等),增强原酒的香气复杂性和层次感[2]。此外,窖池内温度、湿度、氧气分布及微生物群落本身存在明显的空间异质性,这可能是导致不同层次间酸度分布差异的主要原因。
图2 各窖池不同层次出窖糟醅酸度对比
Fig.2 Comparison of acidity in fermented grains from different layers of various fermentation pits
2.1.3 各窖池不同层次出窖糟醅淀粉含量对比
如图3所示,对于11年窖池,各层次的淀粉含量差异不大,均在12%左右,且没有显著性差异(P>0.05)。5年窖池的糟醅淀粉含量在中层达到最高,上层和下层相对较低,其中中层与下层之间的差异显著(P<0.05)。4年窖池的糟醅淀粉含量在中层最高,上层和下层相对较低,它们之间的差异不显著(P>0.05)。这些结果表明,浓香型白酒窖池的不同层次出窖糟醅淀粉含量存在一定的差异,不同的窖池空间位置对发酵过程中糖化和发酵效率的影响程度明显不同,这些差异可能成为发酵过程中优势微生物群落演替的关键驱动因素[17-18]。
图3 各窖池不同层次出窖糟醅淀粉含量对比
Fig.3 Comparison of starch content in fermented grains from different layers of various fermentation pits
2.1.4 各窖池不同层次出窖糟醅还原糖含量对比
如图4所示,对于11年窖池,各层次糟醅的还原糖含量具有一定波动,其中下层的还原糖含量略高,但各层之间的差异未达到显著水平(P>0.05)。5年窖池的糟醅还原糖含量在下层达到最高,上层最低,下层与上层之间的差异显著(P<0.05)。4年窖池的糟醅还原糖含量在下层最高,中层最低,下层与中层之间的差异显著(P<0.05)。出窖糟醅还原糖对比结果与淀粉含量结果相似,对于较年轻的窖池(5年和4年窖池),还原糖含量的分布差异相对较大,随窖龄的增加,窖池糟醅各层次间的差异逐渐呈现上层<中层<下层的规律性。
图4 各窖池不同层次出窖糟醅还原糖含量对比
Fig.4 Comparison of reducing sugar content in fermented grains from different layers of various fermentation pits
2.2 各窖池不同层次原酒主要风味指标对比
如表1所示,在11年窖池不同层次原酒风味成分的对比结果中,正丙醇、乙酸乙酯、仲丁醇、正丁醇、丁酸乙酯、戊酸乙酯和己酸乙酯等酯类和醇类物质均在下层呈现最高浓度,其中乙酸乙酯[(420.04±158.32) mg/100 mL]、己酸乙酯[(325.36±151.65)mg/100 mL]、丁酸乙酯[(19.74±8.94) mg/100 mL]等关键香气成分在下层显著高于中层或上层(P<0.05),表明下层糟醅更有利于浓香白酒主体酯类物质的合成与积累。异丁醇和异戊醇等高级醇则在上层含量较高,可能与该区域相对较高的氧含量相关,氧气含量虽然不直接参与高级醇的合成反应,但能促进酵母菌的生长增殖,高级醇主要通过酵母在指数生长期的Ehrlich途径(氨基酸分解代谢)大量产生[19-20]。甲醇、乙酸和乳酸乙酯在三层间无显著差异,说明其形成受层次影响较小[21]。上述结果表明,糟醅空间分层对风味物质的形成与分布具有选择性影响,尤其是酯类与部分醇类的合成方面在11年窖池中表现出明显的层次效应。
表1 各窖池不同糟醅层次原酒风味成分的对比结果 单位:mg/100 mL
Table 1 Comparison of flavor components in raw liquor from different fermented grain layers across various fermentation pits
注:11、5、4年窖池不同层次间的差异分别使用小写字母、大写字母、希腊字母表示,同一行数据中不具有相同字母的表示差异显著(P<0.05)。
成分11年窖池5年窖池4年窖池上层中层下层上层中层下层上层中层下层乙醛7.03±1.25b11.14±4.56a9.31±2.55ab6.69±1.596.29±1.568.77±3.658.05±2.157.87±3.9710.36±3.61甲醇20.96±3.6320.51±4.9519.86±3.7121.11±3.8825.76±4.7921.14±4.0521.3±3.19α17.64±4.02β17.88±2.26αβ正丙醇36.78±12.93b55.88±14.63a65.79±12.84a27.15±7.7733.71±10.5233.71±10.5328.73±21.8327.84±7.8425.9±5.82乙酸乙酯268.57±65.10b239.01±65.54b420.04±158.32a198.68±40.80155.31±34.50224.41±109.30214.91±50.46β315.26±137.44αβ360.87±150.84α仲丁醇4.77±3.02b14.06±7.44a14.11±5.04a3.64±1.535.85±3.376.77±5.394.07±5.574.14±2.294.14±2.43异丁醇8.94±2.24a6.21±1.92b8.78±2.09a8.7±1.31A6.72±1.00B7.65±1.41AB8.69±1.3011.38±2.9610±3.29正丁醇33.76±10.27b44.12±12.96ab55.54±8.17a37.9±10.9344.11±10.6643.28±17.1933.97±12.8730.76±10.1025.92±10.56乙酸99.25±3.69100.34±9.0897.77±8.73101.59±12.18AB110.2±10.62A93.81±10.18B96.32±11.1084.85±8.0999.4±19.12异戊醇30.05±6.03a19.28±8.68b25.03±4.9ab40.63±8.09A30.12±6.38B33.31±7.33AB36.86±6.2543.49±7.5735.96±10.49丁酸乙酯7.89±4.01b11.25±5.16b19.74±8.94a6.7±2.095.92±2.259.88±6.218.35±3.988.69±4.007.89±3.68乳酸乙酯179.45±25.73170.95±18.65161.8±32.65217.78±43.61244.11±41.97219.29±48.37208.81±21.80β173.99±43.38β258.73±53.93α戊酸乙酯9.06±5.18b16.57±9.58ab24.29±10.68a4.26±2.275.55±2.719.64±8.214.68±6.143.47±2.073.93±2.61己酸乙酯99.64±35.15b205.54±118.80ab325.36±151.65a85.56±18.8697.9±38.13114.54±59.56100.67±47.01114.17±38.90119.97±48.82
在5年及4年窖池中不同层次原酒风味成分对比结果中,下层原酒中的乙酸乙酯、乳酸乙酯等仍呈富集趋势。在5年窖池中,异丁醇在上层较高[(8.70±1.31) mg/100 mL],乙酸在中层较高;在4年窖池中,乳酸乙酯下层显著高于中上层(P<0.05),甲醇在中层最低,并与其他层次差异显著(P<0.05),而其余多数成分层次间差异未达显著水平。该结果表明5年和4年窖池中风味代谢仍具有一定空间波动性,但层次间分布差异规律不如11年窖池明显。
总体来看,11年窖池下层在酯类物质积累方面表现出更强的聚集效应,各层次间风味成分差异显著,空间分异规律明确。相比之下,5年与4年窖池虽也呈现一定的层次差异,如酯类在下层、部分醇类在上层或中层含量较高,但差异幅度较小、显著性成分较少,层次间分异不显著。说明随着窖龄增长,窖池微生态系统趋于稳定,空间异质性增强,下层厌氧环境更利于酯类合成代谢的持续进行,而新窖池中微生物群落结构与代谢功能在垂直方向上尚未形成显著的功能梯度,风味成分分布相对均匀[22-23]。因此,窖龄的增长可能强化了糟醅层次对原酒风味形成的空间调控作用[24]。
2.3 窖龄对糟醅理化特性与原酒风味的空间异质性分析
2.3.1 基于PCA的关键风味与理化指标筛选
为筛选区分糟醅层次与窖龄的关键变量,对所有样本的理化及风味指标进行了PCA,在保留大部分原始信息的基础上,将高维数据降维至少数主成分展现样本差异及其驱动因素[25]。特征值分析结果(图5-a)显示,前4个主成分特征值均大于1(PC1-PC4:6.35、3.62、1.52、1.46),其中PC1和PC2分别解释37.35%和21.28%的变异,累计贡献率达58.63%,可有效捕捉数据主要信息;前4个主成分累计解释76.16%的总方差,足以代表原始17个指标的大部分变异特征。PCA得分图(图5-b)综合反映了糟醅层次与指标间的关系。不同层次样本(上层蓝、中层黄、下层红)呈明显分离趋势,各层在理化与风味特性上存在较为明显的差异,上层样本多分布于PC1负轴区域,而下层样本集中于PC1正轴,表明下层糟醅可能富含更多关键风味物质。
a-PCA碎石图;b-PCA得分图
图5 理化指标与风味成分的PCA分析结果
Fig.5 PCA results of physicochemical indices and flavor components
根据表2载荷矩阵的进一步分析表明,戊酸乙酯、仲丁醇、正丙醇、己酸乙酯和丁酸乙酯等在PC1上具有极高的正载荷,且酸度也呈正载荷,可能主要代表了酯类和醇类物质的合成代谢强度,其综合反映了以酯类积累为核心的风味形成过程,高分值样本对应于发酵效率更高、风味物质更丰富的糟醅层次或窖龄[26-27]。异丁醇和乙酸乙酯在PC2上具有较高的正载荷,而乙酸和甲醇则表现出较高的负载荷,可能体现发酵过程中醇、酸代谢的平衡关系,标识微生物代谢路径的差异:正载荷方向关联酯化及高级醇生成途径,负载荷方向则与有机酸积累及部分副产物代谢相关[28]。PC3和PC4共同指向发酵底物的利用状态及水分分布特征,PC3与淀粉和还原糖呈正相关,同时与水分呈负相关;PC4则与糖和水分呈正相关,与淀粉呈负相关,可能代表窖池内传质效率或物料持水能力对发酵进程的影响[29]。综上所述,通过PCA降维一定程度上揭示了糟醅层次分异的主要驱动因素。
表2 PCA分析变量载荷矩阵
Table 2 Variable loading matrix based on PCA
变量主成分PC1PC2PC3PC4戊酸乙酯0.9590.0310.031-0.073仲丁醇0.923-0.030-0.032-0.104正丙醇0.903-0.056-0.191-0.170己酸乙酯0.8950.1800.107-0.102丁酸乙酯0.8630.3330.149-0.043正丁醇0.762-0.245-0.231-0.199异戊醇-0.6060.610-0.023-0.099酸度0.574-0.412-0.030-0.058乙醛0.5200.3200.3990.290乙酸乙酯0.4840.6670.3720.106水分0.3800.323-0.5430.571乳酸乙酯-0.303-0.4290.2450.496乙酸0.262-0.7470.1960.152还原糖0.253-0.1980.4210.642异丁醇-0.1950.8460.162-0.153淀粉-0.156-0.3620.693-0.465甲醇-0.006-0.767-0.146-0.100
2.3.2 不同窖龄下糟醅特性的垂直分布趋势及其强度比较
选择表2中载荷绝对值≥0.7的关键变量,对其进行线性回归分析(将糟醅层次赋值为:上层=1,中层=2,下层=3),并以决定系数(R2)量化各窖龄下糟醅指标沿垂直方向的趋势强度。如图6所示,这些关键指标主要分为2类:一类是乙酸、异丁醇、甲醇等指标在不同窖龄窖池空间层次上几乎无线性趋势,其分布模式无明显的规律性;第二类为包括多种酯类和醇类在内的指标,其在11年窖池多数呈现出线性递增的趋势,含量从上层到下层呈现出稳定、连续的增加,如己酸乙酯、仲丁醇、正丙醇、己酸乙酯、丁酸乙酯、正丁醇均表现出极显著的线性递增趋势(P<0.01)。而5年和4年窖池仅部分指标存在较弱的线性趋势,在这些窖池中,物质的分布趋于随机、混乱或无规律的,其微生物代谢空间分异不稳定。该结果表明,窖龄增长主要促进糟醅空间梯度规律的形成与稳定,而非单纯扩大层间差异。
图6 基于决定系数(R2)的不同窖龄糟醅指标线性趋势强度对比结果
Fig.6 Comparison of linear trend strength of fermented-grain indices across different cellar ages based on the coefficient of determination (R2)
注:NS、*、**分别表示P≥0.05、0.01≤P<0.05、0<P<0.01。
为理解窖龄在塑造糟醅空间异质性中具有的核心作用,研究认为这种差异的根源在于窖池微生态系统随窖龄增长而发生的演替与功能分化。首先,11年窖池中核心风味物质(如己酸乙酯、丁酸乙酯)呈现出的显著线性递增梯度,本质上是窖泥功能微生物群落(如己酸菌、丁酸菌)在垂直空间上成功定殖并形成稳定代谢功能梯度的直接体现。老窖泥中丰富的微生物多样性及其复杂的互营关系(如己酸菌与甲烷菌的互营共生),在下层严格的厌氧、适宜酸度和湿度环境中达到了代谢活性的巅峰,从而高效地合成酯类等风味物质[23,30-31]。这种“下层富集效应”是优质浓香型白酒风味物质生成最理想的空间模式。反之,5年与4年窖池中趋势较弱且混乱,表明其窖泥微生物群落仍处于演替的初级阶段。其菌群结构可能尚不稳定,功能冗余度低,未能形成有组织的空间功能分化[32]。不同层次间环境因子(如氧气渗透率、酸度、温度)的波动可能超过了微生物群落的缓冲能力,导致其代谢输出呈现随机性和不稳定性,无法形成如老窖池般可预测的、定向的化学梯度。此外,存在乙酸、异丁醇等物质在不同窖龄中均无一致规律,其生成途径可能受更多元化的因素控制(如原料、操作工艺、酵母菌群分布等),或其对窖池微环境的响应不如核心酯类物质敏感,因此其空间分布受窖龄的影响相对较小。这一发现说明,在推进机械化酿造进程中,模拟和加速窖池微生态的定向空间功能分化,而非单纯追求微生物总量的扩增,是实现基酒风味品质突破的关键策略。
3 结论
本研究通过系统分析机械化酿造车间不同窖龄糟醅理化特性与原酒风味成分的空间分布,首次揭示了窖龄增长对窖池垂直梯度规律具有强化作用。结果表明,11年窖池中己酸乙酯、正丁醇等关键酯类物质呈现稳定的自上而下递增趋势,且空间分异显著,这说明老窖池微生物群落代谢功能存在高度空间分化。相比之下,4年与5年窖龄车间糟醅特性空间规律性较弱,风味分布随机性较高,其窖池微生态系统尚未成熟。因此,在机械化酿造模式下,窖龄仍是塑造窖池微生态空间结构与代谢功能的关键因素。本研究从空间维度深化了对机械化酿造过程中窖龄增长对浓香型白酒酿造过程影响的理解,并为调控窖池微生态空间分布、优化工艺参数以提高机械化白酒品质一致性提供了重要理论依据。
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