剁辣椒是中国传统发酵辣椒制品之一。其制作工艺简单、风味独特、美味可口,深受消费者欢迎[1]。剁辣椒是指将新鲜无病虫害的朝天椒洗净去蒂、晾干后,剁成小段,加入一定量食盐、白酒等拌匀后装坛,发酵1个月以上[2]。剁辣椒发酵过程以酵母菌和乳酸菌为主导,与其他有益微生物共同作用经发酵和生理生化反应产生香气物质[3]。研究发现,剁辣椒挥发性成分复杂,其中酯类物质种类最多、含量最丰富[4],如异戊酸乙酯、乙酸乙酯、水杨酸甲酯、辛酸乙酯等,这些酯类物质可以赋予剁辣椒花香及果香,是剁辣椒香味的主要来源,也是传统中盐(盐的质量分数为12%～13%)发酵的剁辣椒风味优于工业中高盐剁辣椒的主要原因之一。
微生物发酵是剁辣椒风味物质生成的主要因素,而盐添加量可通过影响发酵食品中的微生物种群结构从而导致产品质地、风味品质等质量指标的改变[5]。利用接种发酵不仅可以缩短发酵时间,还能有效改善剁辣椒风味。罗凤莲等[6]将植物乳杆菌接种至剁辣椒中,有机酸含量高于自然发酵。颜宇鸽[7]则利用产香假丝酵母与植物乳植杆菌复合菌种发酵制备的遵义辣椒酱,其风味物质组成较传统高盐发酵产品更为丰富。尤其是酯类物质的种类和含量显著提升,主要贡献果香和花香等愉悦香气特征。
非酿酒酵母是传统发酵食品中常见的产酯微生物,适宜生长在pH 3.0～7.5,温度0～47 ℃ 的环境,尤其适应于含糖量较高的偏酸性环境[8]。非酿酒酵母可通过糖酵解生成乙醇和乙酸,经酯酶催化形成酯类;亦可通过脂解作用释放脂肪酸,在醇酰基转移酶的作用下与乙醇酯化生成脂肪酸乙酯。酵母菌产香、产酯的特性使其常用于各类发酵饮料、酒、调味品、发酵蔬菜等食品发酵以提升发酵产品的风味[9]。然而,在高盐(盐的质量分数为12%)环境下,接种耐高盐产酯酵母菌以提升发酵剁辣椒风味物质的形成作用仍未见研究。
本研究主要利用从发酵辣椒中筛选出的8株产酯酵母菌 (M1、M2、M3、M4、M5、M6、M7、M8) 为研究对象,比较分析不同菌株YPDA液体培养中的产酯能力,并通过接种强化发酵剁辣椒(盐的质量分数为12%),测定剁辣椒发酵30 d后理化指标以及挥发性物质组成差异,探究接种发酵对剁辣椒香气的贡献,以期对后续发酵辣椒工业化生产提供数据支撑和理论参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 菌株与材料
酵母菌,从不同自然发酵剁辣椒样本中进行筛选,经美兰染色及显微镜镜检,获得酵母菌株;艳红朝天椒,市场采购;食盐,超市采购。
1.1.2 化学试剂
NaCl、NaOH、葡萄糖、HCl、甲醛、乙醇、邻苯二甲酸氢钾(分析纯),国药集团化学试剂有限公司;DNS显色液(分析纯),飞净生物科技有限公司;酚酞(分析纯)、仲辛醇(色谱纯),上海麦克林生化科技有限公司;正己烷(色谱纯),天津市科密欧化学试剂有限公司。
1.1.3 培养基
YPDA培养基,青岛高科技工业园海博生物技术有限公司;平板计数培养基、孟加拉红培养基,广东环凯微生物科技有限公司。
1.2 仪器与设备
血球计数板,上海市求精生化试剂仪器有限公司;SCIENTZ-10N冷冻干燥机,宁波新芝生物科技股份有限公司;ReadMax 1900光吸收型全波长酶标仪,上海闪谱生物科技有限公司;7890-5977气相色谱-质谱联用仪,美国Agilent公司;DF-101S集热式恒温加热磁力搅拌器,巩义市予华仪器有限责任公司;DJ-1大功率磁力搅拌器,长沙索拓科学仪器设备有限公司;pH计,希玛仪表集团有限公司;TG16-WS台式高速离心机,湖南湘仪实验室仪器开发有限公司。
1.3 方法
1.3.1 菌种扩大培养
将8种供试菌株(M1、M2、M3、M4、M5、M6、M7、M8) 采用YPDA液体培养基进行扩大培养,28 ℃培养 72 h,6 000 r/min离心5 min后,弃上清液,使用无菌生理盐水稀释菌体,血球计数板计数,将菌液浓度调整为1×107 CFU/mL备用。
1.3.2 剁辣椒的制备
选用肉质厚实、辣度适中、色泽红亮、无病虫害的艳红朝天椒去蒂洗净后用剁刀式辣椒切段机切成 0.5 cm×0.5 cm 左右的小片,加入质量分数为12%的食盐,混匀后,沥干水分。将上、下口直径均为7 cm,中间直径为14 cm,高为20 cm的陶坛沸水浴10 min并喷洒食用酒精进行灭菌。向无菌陶坛中加入1.5 kg剁辣椒,并将制备好的菌液按质量分数为4%的比例加入剁辣椒中,用无菌勺子混匀并压实,坛口加入厚度约2～3 mm食盐,盐封,室温发酵30 d,获得发酵剁辣椒成品[10],对照组为质量分数12%的盐分且不接种酵母的剁辣椒。
1.3.3 产酯能力的测定
将8株供试酵母菌株 (M1、M2、M3、M4、M5、M6、M7、M8) 接种于YPDA液体培养基,置于 28 ℃恒温培养箱活化培养 24 h,用血球计数板计数并调整菌液浓度为1×106 CFU/mL后,按2%的接种量接种于YPDA液体培养基中,于28 ℃恒温培养箱中发酵72 h。参照GB/T 10345—2022《白酒分析方法》的方法,并在杜宇庆[11]的方法上稍作修改,采用皂化回流法测定酵母菌的产酯能力。
1.3.4 pH值、总酸、氨基酸态氮、总糖和还原糖的测定
使用pH计测定剁辣椒的pH值。参照GB 12456—2021《食品安全国家标准 食品中总酸的测定(含第1号修改单)》,采用pH电位滴定法测定剁辣椒的总酸含量。参照GB 5009.235—2016《食品安全国家标准 食品中氨基酸态氮的测定》,采用甲醛滴定法测定剁辣椒的氨基酸态氮含量。参照高文军等[12]的方法并稍作修改,采用DNS比色法测定剁辣椒还原糖和总糖含量。
1.3.5 剁辣椒挥发性香气化合物的检测
顶空固相微萃取(headspace solid-phase microextraction,HS-SPME)条件:参照Xu等[13]的方法并稍作修改。准确称取2.50 g剁辣椒样品置于15 mL顶空进样瓶中,加入3 mL饱和NaCl溶液,再加入2-辛醇 (20 μL,86 mg/L) 作为内标,用密封垫封口。将其放入70 ℃恒温加热磁力搅拌器中平衡15 min,使剁辣椒挥发性组分充分挥发。然后将SPME针插入顶空进样瓶中推出纤维头,保持70 ℃顶空吸附40 min,随后迅速将萃取头插入GC进样口,并推出纤维头,250 ℃解吸5 min后进行数据采集。升温程序为初始温度40 ℃并保持3 min,以5 ℃/min的速度升温至150 ℃,保持 0 min;后以10 ℃/min的速度升温至 250 ℃,保持5 min;He流速1 mL/min;压力56.78 kPa;进样口温度250 ℃;不分流。电子轰击离子源;电子能量70 eV;传输线温度280 ℃;离子源温度 230 ℃;质量扫描范围m/z 45～500。
1.3.6 M3和M8产酯酵母菌菌株的分子生物学鉴定
将M3和M8分离酵母菌种子液,10 000 r/min离心5 min后,弃上清液,将菌体送至杭州联川生物技术股份有限公司进行鉴定,将测序结果提交至NCBI的Gen Bank数据库中与已知序列进行基本局部比对搜索工具BLAST同源性比对,选取同源性较高的模式菌株的ITS基因序列,采用 MEGA 12.0 软件中的邻接(neighbor-joining, NJ)法构建系统发育树。
1.4 数据处理
每组试验均重复3次,结果以“平均值±标准差”表示。采用IBM SPSS Statistics 27处理数据,进行显著性分析和聚类分析,使用SIMCA处理数据,计算VIP值,以及MEGA 12.0软件处理数据。使用Origin 2024进行数据绘图。利用OmicStudio工具进行偏最小二乘-判别分析 (partial least squares discrimination analysis,PLS-DA) 和相关性分析 (https://www.omicstudio.cn/tool)。
2 结果与分析
2.1 酵母菌产酯能力的测定
产酯酵母在一定条件下可生成乙酸乙酯[3]。由图1可知,在质量分数为12%盐分的发酵液中,8株酵母菌总酯产量为0.94～1.85 g/L,其中M1、M3、M5、M6、M8 5株酵母菌都表现出较强的产酯能力,总酯产量在(1.66±0.08) g/L以上。
图1 酵母菌产酯含量对比
Fig.1 Comparison of ethanol content by yeast strains
注:M1、M2、M3、M4、M5、M6、M7、M8均代表接种产酯酵母菌;不同字母表示有显著性差异 (P<0.05)(下同)。
2.2 理化指标变化
2.2.1 pH值和总酸含量
pH值和总酸反应接种发酵高盐剁辣椒中的酸味物质含量,是影响风味和口感的重要指标。由图2-a可知,与对照组相比,酵母接种发酵时样品pH值更高。有机酸方面(图2-b),除M1和M2组样品外,其他产酯酵母接种发酵样品的有机酸含量均低于对照组,与pH值结果一致。特别是M7和M8总酸含量最低,分别为 (2.58±0.45)、(2.60±0.41) g/kg。由于酵母菌与细菌之间有一定的拮抗作用,可抑制乳酸菌等产酸微生物的产酸能力,以及酸类物质与醇类物质发生酯化反应生成酯类物质[14],从而导致总酸含量降低。
a-pH值;b-总酸;c-氨基酸态氮;d-总糖;e-还原糖
图2 发酵剁辣椒理化指标含量对比
Fig.2 Comparison of physicochemical indicators in fermented chopped chili peppers
注:C代表自然发酵,下同。
2.2.2 氨基酸态氮含量
剁辣椒中氨基酸态氮能反映辣椒中蛋白质的降解情况,对其鲜味具有重要影响。由图2-c可知,相较于自然发酵,除M1、M2组样品的氨基酸态氮含量无明显变化外,其余6组样品氨基酸态氮含量降低,其中M8样品降低最多,降低了44.36%。由于朝天椒本身蛋白质含量较低,酵母菌与细菌之间的拮抗作用,抑制细菌的生长,降低了水解酶的水解反应[15],导致氨基酸态氮含量减少。
2.2.3 还原糖与总糖含量
由图2-d 和图2-e可知,接种M2和M4酵母菌样品中的总糖含量与对照组无显著性差异,其余6组样品总糖含量较低,特别是M1、M5、M6 3组样品。同时,接种M1、M3、M6、M8酵母菌样品中的还原糖含量显著 (P<0.05) 低于对照组,其中接种M8组样品还原糖含量最低仅(0.058±0.006) mg/mL,说明酵母菌生长消耗了大量碳源。
2.3 8株酵母菌接种发酵GC-MS的结果分析
2.3.1 8株酵母菌接种发酵剁辣椒的挥发性物质类别
9组发酵剁辣椒中共检测出113种挥发性物质,共有挥发性物质17种,其中酯类10种、醇类1种、醛类2种、烃类4种。发酵过程中生成的酯类物质种类最多,赋予剁辣椒独特的香味[16]。
由图3-a可得,8组接种发酵剁辣椒中挥发性成分均以酯类、醇类以及烃类物质含量占比较大且种类较多,特别是酯类和烃类物质增加明显。其中M1样品所含的挥发性物质中酯类物质占比最高,为58.23%,其次是M3和M5样品,占比分别为54.76%、54.29%。M8样品烃类物质占比最大,为39.54%,其次是M4和M7,分别为33.04%、35.97%。
a-占比图;b-含量图
图3 不同剁辣椒样品挥发性物质组成
Fig.3 Volatile compounds composition in different chopped chili pepper samples
从含量上来看(图3-b),M3和M8样品中酯类物质含量最高,分别为69.57、75.65 mg/kg,M2酯类物质含量最低为6.18 mg/kg,比对照组少6.47 mg/kg。烃类物质也是剁辣椒中主要的挥发性成分之一,M8样品中烃类物质含量高达80.23 mg/kg,而M2样品烃类物质含量最低,只有5.15 mg/kg。除此之外,接种M1、M3和M8样品中酚类物质含量显著高于对照组,分别为7.91、12.88、15.88 mg/kg。酚类物质主要来源于辣椒原料以及木质素或阿魏酸的降解[10]。
2.3.2 8株酵母菌接种发酵剁辣椒的挥发性物质组成
剁辣椒发酵后酯类物质是其中含量最丰富的物质,通常赋予剁辣椒花香和果香[17]。本试验共检出40种酯类化合物(图4),接种发酵剁辣椒样品中酯类物质含量均高于自然对照组,特别是棕榈酸乙酯、亚油酸乙酯、反油酸乙酯,其含量最高可达 (20.46±12.15)、(9.79±5.21)、(8.27±4.64) mg/kg,为剁辣椒提供花果香、油脂香以及“青”和“刺激”气味[13,18]。9-十六碳烯酸乙酯、十五酸乙酯、水杨酸甲酯,使得剁辣椒具有花香、果味和冬青叶气味[13]。经过发酵所有挥发性物质中酯类化合物含量最高,说明接种产酯酵母菌促进酯类物质的生成[3]。
图4 不同剁辣椒挥发性物质相关热图
Fig.4 Heatmap of volatile compounds across different fermented chopped chili peppers
由于烷烃类物质香气较弱或者无香气[19],不看作发酵剁辣椒中的主要香气物质。发酵剁辣椒中烯烃类物质种类较多且含量较高,因其阈值较低[20],对发酵剁辣椒的风味形成具有重要作用。本试验共检出18种烯烃类化合物,仅次于酯类物质。由图4得,M8样品烯烃类物质种类和含量最高,其中雪松烯和(E)-β-金合欢烯,含量分别达到(3.99±1.43)、(1.84±1.51) mg/kg。
醇类物质可以赋予发酵剁辣椒令人愉悦的花香和水果香味的柔和香气[20]。部分感官阈值较低的醇类,对剁辣椒的整体风味有着较大贡献[21]。本试验共检出11种醇类物质(图4),M8样品中醇类物质含量高于15 mg/kg,其中苯乙醇和反式-橙花叔醇含量最高,分别为 (5.41±1.85)、(4.31±1.47) mg/kg,为剁辣椒提供花香和青果味。
酸、酮、醛、酚类等物质,由于其感官阈值不同,也是发酵剁辣椒风味成分中不可或缺的物质。酸类物质来源于产酸微生物的代谢产物及醛醇类氧化合成[22],可以提供给剁辣椒酸味和特殊香气,接种M3和M8酵母菌发酵剁辣椒中乙酸含量分别为(1.02±0.80)、(0.32±0.01) mg/kg,显著高于对照组,为发酵剁辣椒提供酸味。而酮类物质比较稳定,且香气持久,为剁辣椒香气起着辅助作用。接种酵母菌发酵剁辣椒中酮类物质含量均高于自然发酵剁辣椒(对照组),其中紫罗兰酮赋予剁辣椒紫罗兰香气[23]。通常,醛类物质阈值较低,给予剁辣椒较强的香气[24]。其中正十五碳醛在所有发酵剁辣椒中均有检测到且含量较高 (>1 mg/kg),苯乙醛未在自然发酵剁辣椒(对照组)中检测到,在其他接种酵母菌的发酵剁辣椒被检出,且含量最高可达 (0.49±0.16) mg/kg,赋予发酵剁辣椒蜜香和甜香,表明接种酵母菌具有显著增香的效果。
2.3.3 基于挥发性物质的多元数据分析
聚类分析是利用多元统计分析原理对大量性状研究分类问题,减少主观因素,分类结果更加客观和科学[25]。PLS-DA是一种监督模式识别的分析方法,结合偏最小二乘分析的降维能力和判别分析进行分类[26],可以更好地区分接种不同菌株发酵剁辣椒挥发性物质的差异。由图5-a可知,C、M1、M2、M4、M5、M6和M7发酵剁辣椒为一组;M3和M8发酵剁辣椒归为一组。基于聚类分析结果,利用PLS-DA对2组剁辣椒进一步分析(图2-b)。结果显示M1、M2、M4、M5、M6、M7与对照组分布区域较为集中,而M3和M8样品与其他样品分布在不同区域,表明2组样品的挥发性物质组成具有明显差异。
a-聚类分析;b-PLS-DA
图5 剁辣椒样品多元数据分析
Fig.5 Multiple data analysis chart of chopped chili pepper samples
2.3.4 发酵剁辣椒中关键风味成分分析
发酵剁辣椒中挥发性物质含量并不能全面说明其对整体香气贡献的大小,仍需要结合该种挥发性物质的嗅觉阈值进行评价[27]。因此,采用多维分析和单维分析相结合的方法,可以进一步筛选组间关键差异风味物质[28]。根据PLS-DA模型分析结果,筛选出VIP>1、P<0.05 的物质62种,其中18种物质相对气味活度值(relative odor activity value,ROAV)>1,被认为是关键差异风味物质,包括酯类物质8种,醇类和醛类物质各3种,其次为酸类、酚类、酮类等挥发性物质(表1)。
表1 不同发酵剁辣椒中关键差异物质ROAV
Table 1 ROAV of key differential compounds in fermented chopped chili peppers
注:“—”为未检出。
中文名CAS号关键差异物质ROAVCM1M2M3M4M5M6M7M8香气描述[13,29]硬脂酸乙酯111-61-5—1.27—2.24—————/水杨酸乙酯118-61-6————————8.69冬青油香气水杨酸甲酯119-36-827.1647.9229.8857.0840.8759.9942.03—143.24冬青叶香味壬酸乙酯123-29-5————————1.86玫瑰香和酒香亚油酸乙酯544-35-42.825.49—15.201.996.966.363.18—果香和花香十一酸乙酯627-90-7——————301.80—2 454.99植物本味棕榈酸乙酯628-97-71.944.75—6.851.233.343.49—9.04青和刺激2-甲基丁酸乙酯7452-79-1————————3 554.21果香(E)-橙花树醇40716-66-3——2.41————4.4521.69花香和青果味苯乙醇60-12-8———3.74——7.10—11.98玫瑰花香芳樟醇78-70-6676.201 661.22954.821 362.001 052.451 181.961 145.451 020.045 001.53花香苯乙醛122-78-1—50.6139.5543.7847.6450.3538.1979.1496.11蜜香和甜香肉豆蔻醛124-25-41.59—1.632.862.632.581.892.8813.32脂肪香和杏仁香十五醛2765-11-92.647.093.016.525.215.454.037.2715.70蜡质气味α-紫罗兰酮127-41-3———49.3637.4738.2434.5445.74227.61木香和紫罗兰香气对乙基苯酚123-07-9———58.95————199.21海狸香对乙基愈创木酚2785-89-9—89.91—96.02———2.28185.63烟熏味和丁香味十四烷629-59-4————————2.25蜡味
与自然发酵对照组相比,M3和M8接种发酵组增加了水杨酸乙酯等12种新的香气物质,其中对乙基愈创木酚含量最高,达 (13.34±5.12) mg/kg。宋新燕[8]也发现接种酵母菌发酵的剁辣椒香气物质高于自然发酵。M8接种发酵后的剁辣椒中水杨酸甲酯、棕榈酸乙酯、芳樟醇、肉豆蔻醛、十五醛的ROAV,较对照组分别提高了5.27、4.66、7.40、8.38、5.95倍,M3样品分别增加了2.10、5.39、3.53、2.01、1.80、2.47倍;其余6株酵母菌的关键差异风味物质有少量增加,但部分物质有所减少甚至消失。另外,M3、M8接种组含有的挥发性物质苯乙醛、α-紫罗兰酮、对乙基苯酚和对乙基愈创木酚等物质的ROAV均大于49,其中M8样品中的芳樟醇最高可达5 001.53,这些挥发性物质可为剁辣椒提供紫罗兰香气、烟熏味、丁香味、花香和甜香。除此之外,M8样品中十一酸乙酯和2-甲基丁酸乙酯的ROAV高达2 454.99、3 554.21,被认为是M8样品的主要香气成分,赋予剁辣椒植物本味和果香。这表明,M3、M8 接种组对风味物质的强化具有显著效果。
2.4 M3和M8产酯酵母的分子生物学鉴定
基于ITS基因序列构建2株酵母菌菌株的系统发育树,结果见图6。菌株M3与Zygosaccharomyces rouxii聚于同一分支,亲缘关系最近。菌株M8与Wickerhamiella versatilis聚于同一分支,亲缘关系最近。因此,菌株M3和M8分别为Z.rouxii、W.versatilis。Feng等[30]将Z.rouxii应用到酱油发酵中发现产生了较高含量的酯类物质。同时,Wang等[31]将W.versatilis应用在大豆酱发酵中发现其产生较高含量的酯类物质。
a-M3系统发育树;b-M8系统发育树
图6 基于ITS基因序列系统发育树
Fig.6 Phylogenetic tree based on the ITS gene sequence
3 结论
综上,本研究通过系统比较自然发酵与酵母菌接种发酵剁辣椒的理化特性及挥发性成分组成,证实接种发酵工艺能显著提升剁辣椒的风味品质。结果表明,尽管接种发酵组样品总酸、氨基酸态氮、还原糖和总糖含量较自然发酵低,但接种发酵显著提升了剁辣椒中的酯类及烃类物质含量,特别是M8样品的酯类物质含量高达75.65 mg/kg,烃类物质达80.23 mg/kg。进一步利用PLS-DA和ROAV分析筛选出18种关键差异香气物质,M3和M8接种组比自然发酵对照组增加了12种新的香气物质。特别是M8组高ROAV的十一酸乙酯(2 454.99)和2-甲基丁酸乙酯(3 554.21)赋予剁辣椒独特的香气,M3、M8经鉴定为Z.rouxii、W.versatilis。此研究为优化剁辣椒发酵工艺、提升产品风味品质提供了科学依据,对推动工业化生产具有重要指导意义。后续将重点研究M3与M8菌株的耐受性及共培养工艺,以期通过菌种协同进一步优化风味并提升工艺稳定性。
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