馒头作为中国传统主食,其品质优劣与发酵剂性能密切相关[1]。目前常用的发酵剂包括酵子、老面及活性干酵母等。其中,酵子作为一种传统混合型发酵剂,以谷物为主要原料,添加酒曲(主要为小曲或大曲)与水,经连续多次发酵,借助酵母菌、乳酸菌和霉菌等多种微生物协同作用制成[2]。相较于活性干酵母的纯种发酵方式,传统酵子制作的馒头在风味与口感上更具优势,这一特性与酵子中复杂的微生物种类(尤其是乳酸菌)有一定的关系[3]。但酵子因易受环境微生物影响,而存在菌种组成差异大、质量稳定性低等问题。为此,研究者从微生物生态结构[4]、制作工艺[5]及原料品质评价[6]等方面展开研究,通过分析不同地区酵子菌群组成,分离筛选优势种群并进一步对这些菌种的发酵性能与品质特性进行比较分析,以用于酵子制作,从而提高酵子质量的稳定性。
在乳酸菌研究领域,经过数十年的探索,发现乳酸菌的代谢活动可产生有机酸、酶及胞外多糖(exopolysaccharides,EPS)等物质[7],其中EPS因与水结合能力较强,被视为谷物发酵中商业水胶体的潜在替代品[8],其在改善面团流变特性、优化产品质地及延长贮存寿命方面具有积极作用[9-10]。由此可见,产EPS乳酸菌的发酵性能对其在发酵产品中的应用至关重要。高粱是全球第五大谷物作物,其富含淀粉、蛋白质和矿物质等营养成分及多酚、花青素等生物活性成分,对人体健康具有显著益处[11]。截至目前,已有研究将产EPS乳酸菌应用于小麦、藜麦等发酵面制品中,证实其可通过分泌EPS、有机酸等代谢产物改善产品品质与贮藏稳定性[12-13]。然而,关于产胞外多糖乳酸菌对高粱酵子品质影响的研究尚未见报道。基于此,本研究以高粱粉为原料,采用酿酒酵母和产胞外多糖食窦魏斯氏菌为起始菌种,设计2组方案(单独接种酿酒酵母、混合酿酒酵母-产胞外多糖食窦魏斯氏菌)制备高粱酵子。通过系统考察高粱酵子的微生物特性、理化指标及其制作馒头的品质和贮藏特性,旨在揭示产胞外多糖食窦魏斯氏菌对高粱酵子品质特性及应用效果的影响,为酵子制作提供重要菌种资源。
1 材料与方法
1.1 材料
高粱粉(蛋白质8.6%,脂肪1.0%,水分14%,灰分1.78%),周口市翔耀食品有限公司;小麦粉(蛋白质11.5%、水分13.9%、灰分0.39%、脂肪1.41%)(适宜制作馒头的中筋面粉),郑州市金苑面粉有限公司;蛋白胨、葡萄糖、CaCO3、柠檬酸三铵、K2HPO4、乙酸钠、MgSO4、MnSO4、牛肉膏、酵母膏、琼脂、吐温-80、柠檬酸、亚铁氰化钾、ZnSO4,天津市科密欧化学试剂有限公司;蒽酮,国药集团化学试剂有限公司。
实验菌株:酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae),产胞外多糖食窦魏斯氏菌(Weissella cibaria),从传统酵子中分离,现保存于河南工业大学粮油食品学院。
1.2 仪器与设备
X280手提式压力蒸汽灭菌锅,上海三申医疗器械有限公司;SW-CJ-1D超净工作台,上海力辰邦西仪器科技有限公司;DM0412离心机,大龙兴创实验仪器(北京)股份公司;HM740和面机,青岛汉尚电器有限公司;HWS-180智能恒温恒湿箱,郑州比朗仪器有限公司;Sigma 300场发射扫描电镜,德国蔡司公司;CHROMA METER CR-400色彩色差计,柯尼卡美能达控股公司;TA-XT Plus质构仪,英国SMS公司;PHS-25 pH计,722S可见分光光度计,上海仪电分析仪器有限公司。
1.3 实验方法
1.3.1 酵母菌和乳酸菌菌种的活化和菌悬液制备
酿酒酵母与食窦魏斯氏菌活化后,分别按2%接种量转接至YPD和MRS液体培养基中,参照宋克丹等[14]的方法配制培养基,并在适宜条件下培养至对数生长末期,之后将菌液离心后收集菌体,并用无菌水洗涤2次后制备成菌悬液备用。
1.3.2 高粱酵子的制备
参考代福娟等[6]的方法并稍作修改。称取100 g高粱粉,70 mL水置于和面机中,接入酿酒酵母7.0 lg CFU/g和产胞外多糖食窦魏斯氏菌7.0 lg CFU/g(YW-J组)于面团中,待面团充分混匀后,将面团置于恒温恒湿培养箱中,在25 ℃、相对湿度85%下分别培养0、12、24、36、48 h后,于25 ℃条件下吹干,即为酵子。在同样条件下,以单独接种酿酒酵母7.0 lg CFU/g制作的酵子作为对照(Y-J组)。
1.3.3 高粱酵子的微生物数量和理化指标
无菌条件下称取10 g样品,转移至90 mL无菌生理盐水中搅拌30 min后得到待测液。参照张瞳[15]的方法进行可滴定酸(titratable acid,TTA)测定,用0.1 mol/L NaOH标准溶液滴定并记录其消耗体积;采用3,5-二硝基水杨酸比色法测定待测液中还原糖的含量;采用平板稀释涂布法对酵母菌和乳酸菌计数,具体如下:对待测液进行梯度稀释,分别取适量悬浮液涂布于WL琼脂培养基和MRS琼脂培养基,并分别置于30 ℃ 和35 ℃条件下培养2～3 d,培养后分别进行酵母菌和乳酸菌菌落计数。WL和MRS琼脂培养基配制参照杜亚柯[12]的方法。
酵子EPS含量的测定参考Tang等[10]的方法并稍作修改。准确称取10 g样品,加入30 mL水,4 ℃搅拌处理1 h后在8 000×g、4 ℃条件下离心20 min,收集上清液,向上清液加入质量分数为80%三氯乙酸(trichloroacetic acid,TCA)溶液至其终质量分数为4%,4 ℃静置过夜后再次离心(8 000×g,20 min,4 ℃);收集上清液加入3倍体积无水乙醇(4 ℃),4 ℃静置12 h后离心(8 000×g,20 min,4 ℃)收集沉淀物;沉淀物复溶于水,使用截留分子质量8 000～14 000 Da的透析袋4 ℃透析48 h;最终采用蒽酮-硫酸法测定透析后样品的EPS含量。
1.3.4 酵子微观结构
采用扫描电子显微镜(scanning electron microscope,SEM)技术观察高粱酵子的微观结构[16]。样品经喷金处理后,在加速电压为15 kV条件下,用SEM观察高粱酵子颗粒截面微观结构,并在1 000倍条件下获得微观结构图。
1.3.5 馒头的制作
采用二次发酵法[6],首先称取180 g小麦粉、20 g酵子及100 mL水,和成面团后置于35 ℃、相对湿度85%的醒发箱中醒发6 h;然后将发酵过的面团与180 g小麦粉、70 mL水混合,放入和面机中搅拌10 min;将面团反复擀压10次,分割成每份90 g。随后进行手工揉面加工,将其塑造成表面光滑、形状规整的馒头生坯;成型后的馒头生坯在35 ℃、相对湿度85%条件下发酵45 min,最后蒸制25 min。
1.3.6 酵子发酵力的测定
取1.3.5节经6 h醒发后再次添加小麦粉和水混合后的面团150 g放入500 mL量筒内压实,35 ℃下发酵,每隔30 min记录一次面团体积。
1.3.7 馒头品质特性的测定
馒头冷却1 h后,采用油菜籽体积置换法测定其比容[17];使用色差仪测定馒头内瓤白度;使用pH计测定其pH值;使用质构仪对馒头质构特性进行测定,具体参数参照陈梦等[17]的方法;感官评价参照宋克丹等[14]的方法略有修改,感官评价小组由10名成员组成,其中涵盖5名男性与5名女性,年龄区间为21～30周岁。经感官灵敏度测试及感官定量描述分析法专项培训后小组人员开展馒头感官评定。感官评定标准涵盖色泽(10分)、外观(10分)、风味(40分)、口感(40分)4个维度;评价于16点进行,选取大小、形状基本一致的馒头样品,随机三位数编码后置于白色托盘呈送,每组间隔用水漱口。
水分含量参考GB 5009.3—2016《食品安全国家标准 食品中水分的测定》进行测定。称取贮藏不同时间的馒头4 g于铝盒中,放入101～105 ℃的干燥箱中干燥4 h至馒头恒重。
馒头硬度的测定方法如下:将不同贮藏时间的馒头从冰箱取出,室温放置30 min后使用质构仪进行测定[17]。
1.4 数据处理
每个样品进行3次重复测定,实验结果以“平均值±标准差”表示。采用SPSS 27.0软件运用独立样本T检验和Duncan’s单因素方差分析(P<0.05)处理实验数据,使用Origin 2024软件绘图。
2 结果与分析
2.1 不同时间高粱酵子中酸度、还原糖含量和微生物数量的变化
如图1-a所示,在各时间段制备的高粱酵子中,接种产胞外多糖食窦魏斯氏菌高粱酵子(YW-J组)的乳酸菌数量显著高于未接种的Y-J组。在发酵12 h时,乳酸菌数量快速增长到最高值(9.10 lg CFU/g,P<0.05),随着高粱酵子发酵时间延长(24～48 h)乳酸菌数量逐渐降低;在仅接种酿酒酵母的高粱酵子中(Y-J组),酵母菌数量在24 h达到峰值(8.55 lg CFU/g)后趋于稳定;而混合接种酵母菌-产胞外多糖食窦魏斯氏菌高粱酵子中,酵母菌数量36 h后明显减少,这可能与乳酸积累形成的酸性环境产生抑制作用有关[18]。在发酵时间为36 h时,YW-J组的酵母菌数量为8.58 lg CFU/g,乳酸菌数量为8.60 lg CFU/g,两者数量大致相等。
a-微生物数量;b-还原糖、TTA含量
图1 不同时间高粱酵子中TTA、还原糖含量和微生物数量的变化
Fig.1 Changes in TTA, reducing sugar content, and microbial counts in sorghum Jiaozi
注:Y-J-单独接种酿酒酵母高粱酵子;YW-J-混合接种酿酒酵母-产胞外多糖食窦魏斯氏菌高粱酵子,图2～4同。Yest-酵母菌数量;LAB-乳酸菌数量;RS-还原糖含量。不同小写字母表明结果差异显著(P< 0.05)(下同)。
如图1-b所示,与Y-J组高粱酵子相比,YW-J组TTA始终处于较高水平,这可能与乳酸菌代谢产生有机酸有关。另外,还原糖含量(reducing sugar,RS)发酵前12 h快速下降,在36 h至最低值后保持平稳,这主要是由于前期酵母菌快速繁殖消耗碳源所致[18]。
2.2 不同时间高粱酵子中EPS含量的变化
如图2所示,在各时间段制备的高粱酵子中,接种产胞外多糖食窦魏斯氏菌高粱酵子中EPS含量始终显著高于未接种Y-J组,这一结果表明,高粱面团适合食窦魏斯氏菌的生长并促进了EPS合成。在发酵0～36 h阶段,YW-J组高粱酵子EPS产量随发酵时间延长呈上升趋势且在发酵36 h时达到最大值,为9.97 mg/g。但当发酵时间进一步延长(超过36 h后),YW-J组高粱酵子EPS含量开始下降,分析其原因可能涉及两方面:一是乳酸菌发酵过程中积累的有机酸对已合成的EPS产生降解作用;二是菌体为应对发酵后期体系内碳源匮乏的环境而降解已合成的EPS[19]。综上可知,EPS产量在发酵36 h时达到最大值,且该时间段内微生物数量处于相对稳定状态,因此,选取36 h作为高粱酵子的最佳制备时间。
图2 不同发酵时间高粱酵子中EPS含量的变化
Fig.2 Changes in EPS content in sorghum Jiaozi during different fermentation periods
2.3 高粱酵子微观结构
通过SEM观察接种产EPS的食窦魏斯氏菌对酵子微观结构的影响,可明显发现淀粉颗粒表面特性的变化。如图3所示,2组中的淀粉颗粒均为大小不一的不规则体,且在Y-J与YW-J组中均观察到部分淀粉颗粒表面存在孔洞或破碎的现象,这与已有研究发现发酵过程中,淀粉水解会使淀粉颗粒表面侵蚀的结论一致[20]。其中,Y-J组的淀粉颗粒有较多暴露于表面,结构相对完整;而YW-J组淀粉颗粒表面则出现较多包裹物,颗粒多镶嵌于其中。这种差异可能源于在高粱酵子制备过程中乳酸菌与酵母菌的混合发酵促进了微生物生长代谢,刺激了EPS、有机酸等代谢产物的积累[13,21],进而在淀粉表面形成了乳酸菌代谢产生的EPS与蛋白质等生物分子的复合物,从而影响了酵子的微观结构。
a-Y-J组高粱酵子;b-YW-J组高粱酵子
图3 高粱酵子的SEM(×1 000)图
Fig.3 SEM (×1 000) images of sorghum Jiaozi
2.4 高粱酵子发酵力的分析
发酵力不仅是评价酵子品质的关键指标之一,也是反映馒头是否成型的基本条件。2组高粱酵子面团发酵过程体积变化如图4所示,在0～1.5 h时,2组面团体积均急速增加;在1.5～4 h时,面团体积增长速率变缓;当发酵进行至4 h时,面团体积达最大值并维持稳定。YW-J组高粱酵子制备的发酵面团,其发酵体积增幅超过1倍,且与只接种酵母菌高粱酵子Y-J组的发酵力接近。这一结果表明,食窦魏斯氏菌的接种未对酵母菌生长造成明显影响,且在高粱酵子体系中仍维持着较好的发酵能力。
图4 高粱酵子的发酵力
Fig.4 Fermentation power of sorghum Jiaozi
2.5 馒头品质特性
如表1所示,Y-JZ和YW-JZ两组馒头的比容分别为2.04、1.96 mL/g,组间无显著性差异,且均显著高于国家标准(1.7 mL/g)。在添加食窦魏斯氏菌的YW-JZ组中,馒头的弹性显著提高,说明食窦魏斯氏菌发酵后的馒头持气性更好。这可能是酵子发酵过程中食窦魏斯氏菌产生了有机酸、胞外多糖、酶类等多种代谢产物使面筋结构更紧实且富有弹性[22],进而让馒头质地细腻、富有嚼劲,与此同时,YW-JZ组馒头的整体感官评分也高于Y-JZ组,显示出更好的食用接受度。
表1 不同馒头的品质特性
Table 1 Quality characteristics of different types Chinese steamed bread
注:Y-JZ-接种酿酒酵母的高粱酵子馒头;YW-JZ-混合接种酿酒酵母和产胞外多糖食窦魏斯氏菌高粱酵子馒头,图5同。不同小写字母标示表明结果差异显著(P<0.05)。
样品比容/(mL/g)高径比弹性/%pH色泽感官评价Y-JZ2.04±0.04a0.68±0.03a82.10±0.43b5.41±0.13a5.03±0.13a80.37±1.51bYW-JZ1.96±0.06a0.70±0.03a89.33±2.88a4.75±0.12b5.17±0.08a83.48±1.18a
2.6 馒头贮藏期间的品质变化
馒头中水分含量变化与馒头贮藏过程中硬化速率密切相关[23]。由图5-a可知,随着贮藏时间延长,馒头芯水分含量逐渐下降;贮藏至第6天时,YW-JZ组水分含量均显著高于Y-JZ组(P<0.05)。这一结果表明,在酵子中接种食窦魏斯氏菌可有效抑制馒头水分流失。这可能是由于乳酸菌发酵使淀粉颗粒表面变得粗糙,从而可以吸收更多水分,持水性上升[24],此外乳酸菌分泌的胞外多糖也有助于增强馒头持水性[25]。
a-水分含量;b-硬度
图5 高粱酵子馒头在贮藏过程中水分含量和硬度的变化
Fig.5 Changes in moisture content and hardness of sorghum Jiaozi steamed bread during storage
馒头硬度变化可以直观反映馒头老化情况。由图5-b可知:贮藏过程中2组馒头硬度均呈现显著上升趋势(P<0.05),且在贮藏初期(0～1 d)表现出较快的硬化速度。贮藏至第6天时,YW-JZ组馒头硬度显著低于Y-JZ组,这与水分含量结果一致。这一现象可能源于乳酸菌双重作用机制:高粱酵子中接种的乳酸菌一方面增强了面团体系中水分亲和力,从而有效延缓淀粉回生过程[25],另一方面使面团呈现出酸性环境,有机酸的存在可以延缓淀粉老化速度[26],这两方面共同作用下影响了馒头在贮藏期间的硬度变化。
3 总结
混合接种产胞外多糖的食窦魏斯氏菌与酿酒酵母高粱酵子乳酸菌数量和酵母菌数量分别为8.60、8.58 lg CFU/g,可滴定酸度为17.79 mL,EPS含量为9.97 mg/g;与单独接种酿酒酵母高粱酵子制作的馒头相比,混合酿酒酵母-产胞外多糖食窦魏斯氏菌高粱酵子制作的馒头弹性明显提高,同时有效降低馒头贮藏过程中的硬度与水分损失。本研究探究了产胞外多糖食窦魏斯氏菌对高粱酵子品质特性及其应用效果的影响,为酵子制作过程中优质菌种的选用提供重要资源。
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