益生菌在增强肠道屏障、解决人体代谢紊乱、提升免疫等方面的生理功能已得到广泛共识。然而益生菌往往在加工、贮藏和通过胃肠道的运输过程中,由于温度、渗透压、包装材料及胃肠道中的酶、胃酸等的存在,活菌数量会急剧下降,难以在人体内发挥其健康作用[1]。为突破此瓶颈,微胶囊化技术被视为保护益生菌的核心策略。它可通过构建物理屏障来有效隔离外界不良环境,从而显著提升益生菌的活性与肠道靶向释放能力[2]。物理屏障通常被称为外壳或壁材,包埋壁材的选择对益生菌微胶囊包埋效率和稳定性起决定性影响。
目前,在食品领域最常用的天然微胶囊壁材中,多糖与蛋白质因其良好的生物相容和可降解性而备受青睐。乳清蛋白由α-乳清蛋白、β-乳球蛋白、免疫球蛋白等组成[3]。在代谢过程中,这些蛋白质可以释放具有免疫调节和增强肠道屏障性的生物活性肽,可与鼠李糖乳酪杆菌GG产生协同作用,显著缓解葡聚糖硫酸钠盐诱导的小鼠结肠炎症状[4]。研究表明,通过添加乳清蛋白可以提升海藻酸钠包埋嗜酸乳杆菌La-14的热耐受性和储存稳定性;乳清蛋白水解物作为益生菌包埋载体,因其致密、稳定的结构基质使益生菌在胃酸、胆盐存活率高达90%以上;在乳清蛋白浓缩物与黄原胶复合物所构建的乳化凝胶递送体系中,益生菌在4 ℃储存6周后,仍能保持较高水平存活率[5-7]。乳清蛋白与多糖的结合,可改善乳液pH的稳定性,并显著提高益生菌的包埋率。
膳食纤维(dietary fiber,DF)与益生菌间存在着天然的共生关系,作为潜在益生元,能选择性促进肠道有益菌增值。Liu等[8]采用双层核壳海藻酸盐微胶囊将益生元(抗性淀粉纳米粒)和益生菌精准空间分区封装,有效地将植物乳植杆菌递送至结肠,实现了胃酸保护与结肠靶向释放,而且此微胶囊还促进了短链脂肪酸的产生并提升了肠道微生物的多样性。Thinkohkaew等[9]实现了益生菌和低聚果糖的共包埋,并将益生菌冻干存活率提升至83.36%。同时,DF作为多糖大分子与蛋白质相互作用,也能提升乳化包埋体系结构的稳定性。乳液包埋由于其条件温和、易于放大、益生菌存活率较高等优点,已成为益生菌常用的微胶囊化包埋技术[10]。但由于乳液是热力学不稳定体系,在加工储存过程中,常常发生聚结、沉降、絮凝、熟化等现象,导致渗透压失衡和界面膜破裂,最终甚至出现破乳现象[11]。研究表明,在利用乳清分离蛋白-魔芋葡甘露聚糖复合物作为双乳液(W/O/W)的外水相,复合物乳液28 d仅分层1.42%,远低于单一乳清分离蛋白乳液的40%[12]。通过多糖-蛋白质复合物的空间位阻和静电排斥作用,以及多糖链在油滴表面形成的“绒毛状”厚层,阻碍油滴的靠近,可改善乳液的聚结、絮凝等现象。
藜麦麸皮作为粮食加工过程中产生的副产物,将其中的DF提取并用作益生菌的包埋壁材,不仅实现了对副产物的高值化利用,也体现了对农业废弃资源的有效升级。基于前期对超声波改性藜麦麸皮可溶性膳食纤维(ultrasonic-modified quinoa bran soluble dietary fiber,U-QSDF)提取工艺、分子组成、结构及理化特性的系统阐明,为进一步拓展其应用,本研究将进一步重点探究U-QSDF与乳清蛋白在益生菌递送领域的相互作用机制。为此,本研究构建U-QSDF/乳清蛋白复合壁材,并将其应用于W/O/W双乳液的外水相中,以期实现从单一包埋体系到双乳液外水相增效的策略升级。首先对复合壁材表观形貌、结构及理化性质进行表征,明确其是否能有效包埋植物乳植杆菌L4-11并稳定乳液体系;其次探究双乳液中三相添加比例对粒径及其分散跨度的影响,最后,通过U-QSDF/乳清蛋白的复合凝聚和乳化2种方式负载植物乳植杆菌L4-11,表征其表观形貌,并测定其体外模拟胃肠道消化活性和贮藏稳定性。探讨2种方式对植物乳植杆菌L4-11活性的影响,以期为U-QSDF/乳清蛋白作为益生菌包埋壁材提供理论依据和技术支持。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
植物乳植杆菌(Lactiplantibacillus plantarum)L4-11由本课题组筛选与鉴定,已保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心,保藏编号CGMCC 32205;藜麦麸皮,谷麦郎河北农业发展有限公司;玉米油,益海嘉里金龙鱼粮油食品股份有限公司;乳清蛋白,上海源叶生物科技有限公司;聚甘油蓖麻醇酸酯(polyglycerol polyricinoleate,PGPR),华兴食品添加剂技术有限公司;H2O2(30%),鸿泰化工有限公司;其他试剂均为国产分析纯。
1.2 仪器与设备
1000A多功能粉碎机,东菀市华太电器有限公司;ALPHA Ⅱ红外光谱仪,布鲁克科技有限公司;SmartLab9KW X射线衍射仪,日本理学(Rigaku)公司;S-4800扫描电子显微镜,日本日立(HITACHI)公司;JXDG-12B真空冷冻干燥机,拓赫机电(上海)有限公司;SZ-100纳米激光粒度仪,日本HORIBA公司;UV-6000PC紫外分光光度计,上海元析仪器有限公司。
1.3 实验方法
1.3.1 U-QSDF/乳清蛋白复合凝聚物的制备
参考韦世鹏[13]的方法,并稍作修改。藜麦麸皮粉末以料液比1∶30(g∶mL)与H2O2混合,经超声波辅助提取、离心、上清液醇沉后,采用Sevage法脱蛋白,冷冻干燥后获得纯化U-QSDF。将纯化U-QSDF与乳清蛋白分别制备成10 g/L的均匀溶液,两者制备完成后,U-QSDF与乳清蛋白两者以体积比1∶1、1∶2、1∶3、1∶4进行复配,并调节溶液pH值至2～5.5,之后使其置于冰水浴中搅拌15 min后,溶液静置于4 ℃下12 h使复合凝聚物聚合下沉,下层物质离心15 min收集沉淀,冷冻干燥最终得到U-QSDF-乳清蛋白复合凝聚物。复合凝聚微胶囊是由菌体先与U-QSDF混合,再与乳清蛋白进行复配,最后冷冻干燥得到复合凝聚微胶囊粉末。复合凝聚物产率的计算如公式(1)所示:
复合凝聚物产率
(1)
式中:m0,U-QSDF和乳清蛋白的总质量,g;m1,空玻璃皿质量,g;m2,冷冻干燥后复合物的质量,g。
1.3.2 U-QSDF/乳清蛋白复合凝聚物的表征
1.3.2.1 Zeta电位的测定
取1 g的U-QSDF-乳清蛋白复合凝聚物,将其制备成10 g/L的悬浊液,磁力搅拌15 min,使溶质均匀分散后,使用纳米粒度仪测定U-QSDF-乳清蛋白的zeta电位。
1.3.2.2 浊度的测定
取1 g的U-QSDF-乳清蛋白复合凝聚物,加入100 mL无菌水制备为悬浊液,磁力搅拌15 min,使溶质均匀分散后,使用分光光度计在600 nm处测定吸光度。吸光度越高表明溶液整体浊度越大,即形成的复合凝聚物数量越多。
1.3.2.3 相行为分析
依据1.3.1节方法制备不同复配比的复合凝聚物后,将其自然静置12 h,通过拍摄记录样品相行为,观察并判断样品溶液的相行为性质。
1.3.2.4 红外光谱分析
分别称取适量的U-QSDF、乳清蛋白、复合物,样品与KBr晶体以1∶100的质量比充分混匀研磨,并制成厚度约为0.5 mm的薄片后,使用红外光谱仪在4 000～400 cm-1波数范围内进行全波段透射扫描并分析,以此表征两者间的分子间相互作用。
1.3.2.5 X射线衍射分析
分别称取适量的样品,充分混匀研磨后移至样品台进行测试。测试条件:采用Photo Max型旋转阳极X射线发生器,功率为9 kW,工作电压设定为45 kV、管电流调整为200 mA。
1.3.2.6 乳化稳定性测定
参考周中玉[14]的方法,并稍作修改。将U-QSDF、乳清蛋白、复合凝聚物均配制为1 g/L的溶液,取30 mL上述配制的3种溶液与10 mL的玉米油混合,在10 000 r/min下高速均质2 min得到浊液,取40 μL浊液加入10 mL质量分数为0.1%的十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate,SDS)溶液中稀释,以质量分数为0.1%的空白SDS溶液为对照,分别测定0、30 min乳液在500 nm处的吸光度。乳化稳定性按公式(2)计算:
乳化稳定性
(2)
式中:A0,0 min时对应的吸光度;A30,30 min时对应的吸光度。
1.3.3 负载植物乳植杆菌L4-11的双乳液构建
双乳液制备参考Zhou等[15]的方法,并稍作修改。采用两步乳化法制备植物乳植杆菌L4-11菌悬液的包埋。将活化完成的L4-11进行离心并收集沉淀后,用无菌PBS洗涤沉淀2次,之后将沉淀重悬于等体积无菌PBS中,调整细胞数量为1×108 CFU/mL,作为内部水相。称取一定量玉米油,向其加入不同质量比例(2%、4%、6%、8%、10%)的PGPR后,65 ℃下磁力搅拌2 h,完成油相制备。将内部水相与油相以不同质量比例(1∶8、1∶4、3∶7、1∶2、2∶3)进行混合后,使用高速剪切均质机在10 000 r/min速度下均质3 min,得到W1/O初级乳液。
将得到的初级乳液与U-QSDF/乳清蛋白复合物以不同质量比(1∶12、1∶10、1∶8、1∶6、1∶4)进行混合后,使用高速剪切均质机在10 000 r/min速度下均质2 min,得到含有植物乳植杆菌的双乳液。
1.3.3.1 双乳液粒径分析
采用激光粒度分布仪测定双乳液的粒径大小,记录粒度的D10、D50和D90并计算粒径分散跨度值。
1.3.3.2 双乳液显微镜观察
吸取一滴稀释50倍的乳液置于载玻片上,放置于光学显微镜下观察乳液形态。为使其形态更易于分辨和观察,采用质量浓度为0.5～10 μg/mL的Hoechst染料(λex=352 nm)对植物乳植杆菌L4-11进行染色,4 ℃下染色20 min至染色完全;将1 g/L的尼罗红染液(λex=549 nm)加入玉米油中,涡旋振荡使染色完全。分别制备染色W1/O、W1/O/W2后,通过荧光染色显微镜分别来观察W1/O及W1/O/W2的形态和分布。
1.3.4 基于U-QSDF/乳清蛋白复合壁材的2种包埋方式对植物乳植杆菌L4-11保护性能的影响
1.3.4.1 包埋率
分别称取1 g湿样品加入9 mL的PBS中振荡混匀,之后将其放置于37 ℃气浴恒温培养箱中,180 r/min振荡1 h,保证微胶囊全部解离。取解离液进行梯度稀释并取200 μL均匀涂布于MRS平板中,在37 ℃下倒置培养48 h,选取30～300的菌落平板计数。包埋率按公式(3)计算:
包埋率
(3)
式中:N,微胶囊中活菌数;N0,初始制备活菌数。
1.3.4.2 扫描电镜观察
分别取适量样品置于双面胶表面进行喷金处理后,使用扫描电子显微镜在5 kV下观察二者表面结构。
1.3.4.3 体外模拟胃肠道消化过程中L4-11活性变化
依据Kamalian等[16]的方法来模拟体外胃肠道消化,评估复合凝聚和双乳液微胶囊中植物乳植杆菌L4-11的活性。模拟胃液配制:取3 g胃蛋白酶、2 g NaCl加入900 mL无菌超纯水中,用12.0 mol/L盐酸调节溶液pH值至1.2后,溶液定容至1 L并使用0.22 μm滤膜过滤去除细菌。模拟肠液配制:取2 g胰蛋白酶、1.36 g KH2PO4加入100 mL无菌超纯水中,使用1.0 mol/L NaOH调节溶液pH值为6.8,并使用0.22 μm滤膜过滤去除细菌。称取1 g样品及1 mL游离L4-11菌悬液加入9 mL胃液中,放置于37 ℃恒温培养箱孵育,分别于0、1、2 h取出微胶囊进行解离,通过平板计数法测定游离L4-11菌悬液、复合凝聚微胶囊及双乳液中活菌数。取1 g样品加入9 mL肠液中,混合液放置于37 ℃培养箱中孵育,每间隔30 min取样并通过平板计数法测定微胶囊及双乳液中释放的活菌数。
1.3.4.4 贮藏稳定性
分别称取一定量的微胶囊样品,将其放置于4、25、37 ℃贮藏28 d,每隔7 d取样并解离样品,通过平板计数法测定微胶囊中活菌数。
1.4 数据统计与分析
所有实验数据均进行3次重复。使用SPSS Statistics 25软件进行数据分析处理,采用Origin Pro 2021软件绘图。实验结果均以“平均值±标准差”表示,P<0.05表示具有显著性差异。
2 结果与分析
2.1 U-QSDF/乳清蛋白复合凝聚物表征
2.1.1 pH对U-QSDF/乳清蛋白复合凝聚过程中zeta电位的影响
复合凝聚是指蛋白质与多糖携带相反电荷,产生静电吸引从而形成复合物的过程。由图1-a可知,U-QSDF 在pH 2～7范围内始终带负电,乳清蛋白包含氨基和羧基,带电性取决于环境pH值,在pH<4.21时,乳清蛋白由于溶液中含有过量的H+,致使其精氨酸和赖氨酸的残基发生质子化,从而携带正电荷[17]。因此,pH<4.21是两者发生复合凝聚反应的前提。图1-b中,U-QSDF/乳清蛋白复配比为1∶1、1∶2、1∶3、1∶4时,其对应等电点的pH值约为2.5、2.6、2.75、3。多糖和蛋白质在等电点的pH值条件下混合形成复合凝聚物时,它们之间的静电相互作用会导致电荷中和,此时形成的复合凝聚物数量最多,Chen等[18]的研究结果也证明了这一观点。
a-U-QSDF和乳清蛋白;b-U-QSDF和乳清蛋白不同复配比
图1 pH对U-QSDF、乳清蛋白及两者不同复配比zeta电位的影响
Fig.1 Effect of pH on zeta potential of U-QSDF, whey protein and their different composite ratios
2.1.2 pH对U-QSDF/乳清蛋白复合凝聚过程中的浊度影响
分析zeta电位初步确定了不同复配比例下复合凝聚物电荷被中和的pH值。为了进一步确定复合凝聚物的最佳复配比例,测定了不同复配比例下U-QSDF与乳清蛋白复合物浊度随pH的变化趋势。由图2可知,U-QSDF/乳清蛋白复配比为1∶1、1∶2时,在其等电点pH值附近趋势平缓。此时在复合凝聚反应过程中乳清蛋白分子不够,过量U-QSDF产生的多余负电荷和空间排斥阻碍复合凝聚反应发生过程,导致浊度值较低[19];U-QSDF/乳清蛋白在1∶3复配比下,溶液pH值为其等电点值2.75时,浊度最高。结合图3结果,在各自等电点pH值下,U-QSDF/乳清蛋白复配比为1∶3时复合凝聚物产率最大。由此确定了U-QSDF/乳清蛋白复合凝聚的最佳复配比及pH值。
图2 不同pH下U-QSDF与乳清蛋白不同复配比的浊度变化
Fig.2 Turbidity changes of U-QSDF and whey protein at different pH values and mixing ratios
图3 U-QSDF与乳清蛋白不同复配比在其等电点的复合凝聚物产率
Fig.3 Yield of complex coacervates formed by U-QSDF and whey protein at their respective isoelectric points under different composite ratios
2.1.3 U-QSDF/乳清蛋白复合凝聚物的相态行为分析
相行为分析可从表观层面直接反应多糖与蛋白质在不同条件下复合凝聚时的相态变化。由图4所示,不同复配比的U-QSDF与乳清蛋白溶液,在pH<4.0时基本均处于相分离状态。但观察图4-d可知,U-QSDF与乳清蛋白在1∶4复配比下,部分相分离在pH>4.0时即出现,这是由于U-QSDF的负电性是有限的,过量的乳清蛋白超过U-QSDF的电荷负载能力,导致多余的蛋白以游离态悬浮于溶液中,促进了部分相分离现象出现。当pH值接近至4.5时,溶液上清液处于部分相分离状态,此时乳清蛋白基本带净中性电荷,有聚集和自凝聚趋势。当带负电荷的U-QSDF加入溶液后,蛋白质与多糖颗粒之间的排斥力来自多余负电荷,多糖的聚电解质特性增加了复合凝聚物稳定性,降低了复合凝聚物的自凝聚现象并延缓了沉淀的发生,致使复合凝聚程度降低[20]。
a-1∶1;b-1∶2;c-1∶3;d-1∶4
图4 不同复配比的U-QSDF与乳清蛋白复合凝聚物外观图
Fig.4 Appearance of complex coacervates formed by U-QSDF and whey protein at different composite ratios
2.1.4 U-QSDF、乳清蛋白及复合凝聚物的红外光谱分析
红外光谱分析可以了解U-QSDF、乳清蛋白及其复合凝聚物之间官能团、化学结构和分子间作用力,从而更清楚了解两者在复合凝聚过程中的化学变化。如图5所示,在U-QSDF图谱中,1 018 cm-1处为C—O—C的伸缩振动,为多糖的骨架特征吸收峰;1 411、1 654 cm-1处的特征吸收峰对应U-QSDF中酯化和非酯化羧基(C
O)的伸缩振动[21]。乳清蛋白中1 238 cm-1特征峰主要由C—N的伸缩振动引起,1 543 cm-1(C—N和N—H的拉伸振动)处特征吸收峰位于酰胺Ⅱ带。酰胺Ⅰ带特征峰集中在1 647 cm-1附近,对应于CO伸缩振动。在2 919、3 417 cm-1处特征吸收峰为C—H、O—H键的伸缩振动。U-QSDF/乳清蛋白在3 399 cm-1特征吸收峰发生了一定的偏移,主要是在复合凝聚过程中,乳清蛋白的CO与O—H间形成了氢键,使对应的O—H键振动频率发生改变[22]。乳清蛋白的氨基与U-QSDF的羧基发生静电相互作用,两者之间形成静电键,致使1 543 cm-1(C—N、N—H)和1 654、1 411 cm-1(CO)特征峰消失[23]。通过这一现象,可清晰观察到U-QSDF/乳清蛋白间的相互作用,所得结果与2.1.3节分析一致。
图5 U-QSDF、乳清蛋白和复合凝聚物的红外光谱图
Fig.5 Infrared spectroscopy patterns of U-QSDF, whey protein, and their complex coacervates
2.1.5 U-QSDF、乳清蛋白及复合凝聚物的X射线衍射分析
X射线衍射可用来评估生物化合物及其复合凝聚物的结晶度。由图6可知,U-QSDF、乳清蛋白和复合凝聚物在图谱中均存在宽峰,这表明其基本呈无定形结构,但其中也包含一些具有非共价键的结晶区域。乳清蛋白在9.04°与19.72°出现2个强衍射峰,这表明其存在非共价键的结晶区域,并且这主要与蛋白质的α-螺旋结构有关[24]。U-QSDF在21.48°出现的衍射峰对应纤维素Ⅰ晶格的002晶面,但其结晶度极弱,可能是超声波和H2O2处理降低了藜麦SDF的聚合度,使其结构发生松动[25]。U-QSDF/乳清蛋白复合物中出现了8.84°和19.96°两个衍射峰,这表明在复合凝聚物中保留了乳清蛋白的无定形结构特征。综上,U-QSDF/乳清蛋白的复合凝聚物稳定性良好且复合凝聚对其结构无显著影响。
图6 U-QSDF、乳清蛋白和复合凝聚物的X射线衍射图谱
Fig.6 X ray diffraction patterns of U-QSDF, whey protein, and their complex coacervates
2.1.6 U-QSDF、乳清蛋白及复合凝聚物的乳化稳定性分析
由图7可知,单一乳清蛋白和U-QSDF与其复合凝聚物的乳化稳定性,从大到小依次为,复合凝聚物、U-QSDF、乳清蛋白。在乳化过程中,U-QSDF作为酸性多糖,其阴离子有助于乳液稳定性的增加,同时经超声波/H2O2改性处理后,其疏水基团增加,致使其从亲水性物质转变为两亲物质[26]。因此,后续以U-QSDF/乳清蛋白复合凝聚物作为双乳液外水相材料,可同时利用乳清蛋白的双亲性和U-QSDF负电荷的静电吸引作用进一步提高乳液的稳定性。
图7 U-QSDF、乳清蛋白、复合凝聚物的乳化稳定性
Fig.7 Emulsification stability of U-QSDF, whey protein, and their complex coacervates
2.2 U-QSDF/乳清蛋白的双乳液包埋植物乳植杆菌L4-11的构建与表征
2.2.1 双乳液粒径与粒径分散跨度分析
粒径与粒径分散跨度是评估乳液稳定性的重要指标。图8-a中,乳液随PGPR添加量增加,粒径越来越小,但当PGPR添加量>6%时,粒径分散跨度却持续增长。这一原因主要是过高浓度的PGPR导致反胶束现象出现,乳液破裂使粒径降低,液滴呈现不规则形态使粒径分散跨度增大。图8-b中油相所占比例增加,粒径先增大后减小,粒径分散跨度先呈现下降趋势后又轻缓增大。这种趋势可能是由于后续油相充足时完全包裹分散相,流动性增强使剪切效率提高,大液滴破碎后使粒径减小,但不均匀液滴的存在使粒径分散跨度增大。图8-c中随着W1/O乳液占比增加,双乳液粒径呈现下降趋势但粒径分散跨度持续上升。Li等[27]也得出了与本文一致的研究结果,这一现象可解释为:外水相体积减少致使单位体积剪切能密度增加,液滴破碎剧烈下粒径减小;高W1/O乳液占比会使剪切力分布不均,碰撞概率增加,致使粒径分布变宽。乳液稳定受多种因素影响,是一个动态平衡过程。结合乳液粒径和分散跨度,选择6%的PGPR添加量(质量分数)、W1∶O为1∶2、W1/O∶W2为1∶8作为后续乳液制备条件。
a-PGPR添加量;b-菌悬液与油相(W1/O);c-W1/O与外水相(W2)
图8 乳化剂(PGPR)及三相不同添加比例对双乳液粒径和粒径分散跨度的影响
Fig.8 Effect of emulsifier (PGPR) and three-phase addition ratios on the particle size and size distribution range of double emulsion
2.2.2 双乳液显微镜观察分析
如图9所示,W1均匀分布在油相中,W1/O也分散在W2中,符合双乳液的结构特征。图10-a为W1/O在荧光显微镜下的图像,植物乳植杆菌L4-11呈蓝色,玉米油相为红色。内水相紧紧包埋于红色油相中形成W1/O,为后续的双乳液制备奠定基础。图10-b中红色液滴(W1/O)与外水相(W2)紧紧相互环绕,红色的球滴内部可以看到浅浅的蓝色,这是由于油相的红色与菌体的蓝色相互重叠,表明在乳液中形成W1/O/W2型乳液,L4-11被成功包埋。
图9 双乳液的生物显微镜图
Fig.9 Biological microscope image of double emulsion
a-W1/O;b-W1/O/W2
图10 双乳液的荧光染色显微镜图
图10 Fluorescent stained microscope image of double emulsion
2.3 U-QSDF/乳清蛋白的复合凝聚和双乳液2种方式包埋L4-11特性分析
2.3.1 包封效率
包封效率是评估植物乳植杆菌L4-11包埋效果的重要指标。由图11所示,复合凝聚和双乳液体系的包埋率分别为66.26%、84.33%;平均粒径分别为(155.63±1.46)、(245.93±1.56) μm。植物乳植杆菌属于亲水性物质,但U-QSDF-乳清蛋白复合凝聚物更适用于疏水性物质的包埋;由于复合物仍存在部分无机盐类,离子强度会削弱复合物的静电作用,且形成的复合物会因盐离子存在发生解离行为,致使其包埋率相对于同类型微胶囊包埋率较低[28]。益生菌细胞本身大小、复配比、干燥过程等都会影响微胶囊粒径的大小。本研究双乳液体系的粒径与Xu等[2]双乳液体系粒径(299 μm)相近,符合双乳液包埋粒径预期范围。
a-W1/O;b-W1/O/W2
图11 复合凝聚和乳化2种方式对微胶囊粒径和包埋率的影响
Fig.11 Effects of complex coacervation and emulsification on particle size and encapsulation efficiency of microcapsules
2.3.2 扫描电镜分析
扫描电镜可观察微胶囊的表面形态。从图12可以看到,复合凝聚包埋和双乳液包埋形态均为球形,尺寸均一,表面凹凸不平,这是由于冷冻干燥过程中水分的不均匀蒸发,导致结构发生收缩和坍塌[29]。复合凝聚微胶囊(图12-a,图12-b)表面有粗糙裂纹,可能是菌悬液添加影响了其复配结构,离子交联程度变低使复合物延展性降低,从而难以适应体积和应力变化,但也再次证实植物乳植杆菌L4-11被成功包埋。从图12-c、图12-d中可看到双乳液体系表面光滑,这是由于油相的存在填充了空间组织结构,使其内部结构更稳定,这会有效提升益生菌的存活能力。
a-复合凝聚包埋(1 100×);b-复合凝聚包埋(130×);c-双乳液包埋(1 000×);d-双乳液包埋(150×)
图12 复合凝聚和双乳液微胶囊的扫描电镜图
Fig.12 Scanning electric microscopic images of complex coacervation and double emulsion microcapsules
2.3.3 体外模拟胃肠道消化
植物乳植杆菌L4-11若要发挥益生菌的作用,必须在到达胃肠道后仍保持活力。由图13可知,在模拟胃液环境孵育2 h,复合凝聚微胶囊的L4-11活菌数较未包埋提高了1.78 个对数级,表明U-QSDF/乳清蛋白复合凝聚物在植物乳植杆菌L4-11表面形成保护屏障,对胃酸及其蛋白酶等具有较强的抵抗力,延缓了菌体与外界环境的接触[30]。双乳液在模拟胃液中孵育2 h,活菌数从7.06 lg CFU/g下降为6.49 lg CFU/g,整体下降较少(<1 lg CFU/g),满足人体对于益生菌数量的最低需求。复合凝聚物壁材以及油相界面为益生菌提供了双重物理屏障,从而显著提高益生菌在胃消化过程中的存活率。
图13 模拟胃液中未包埋L4-11及复合凝聚、乳化方式包埋L4-11活菌数的变化
Fig.13 Changes in viable counts of unencapsulated and encapsulated (complex coacervation/emulsification) L.plantarum L4-11 in simulated gastric fluid
益生菌想要在人体内发挥益生功效,不仅需要抵抗住胃消化液等不良环境的破坏,还需能在肠道内定植释放。由图14所示,两者在加入模拟肠液0 h时,均含有部分活菌数,这可能是包埋体系外的部分黏附益生菌。在人工模拟肠液中处理60 min后,复合凝聚微胶囊释放的活菌数为5.27 lg CFU/g;双乳液体系释放活菌数为7.11 lg CFU/g。在后续90 min和120 min肠液消化中,两者均与其60 min时释放的活菌数量相当,表明在60 min时植物乳植杆菌L4-11已实现在肠道中的释放,并且U-QSDF的复合凝聚物及双乳液体系均能维持植物乳植杆菌L4-11的持续释放,可以使L4-11在肠道中定植发挥作用。
图14 模拟肠液中复合凝聚、乳化方式包埋L4-11的肠溶性
Fig.14 Dissolution of encapsulated (complex coacervation/emulsification) L.plantarum L4-11 in simulated intestinal fluid for enteric release
2.3.4 贮藏稳定性
益生菌在贮藏过程中的活性对于其在工业中的应用至关重要。如图15所示,在4、25、37 ℃下贮存28 d后,游离L4-11菌体活性由99.54%分别降至18.31%、12.80%、3.18%;复合凝聚微胶囊由98.92%降至74.62%、60.93%、12.25%;双乳液体系由99.05%降至81.09%、63.96%、37.38%。表明U-QSDF/乳清蛋白复合凝聚物及双乳液体系能够有效维持L4-11菌体在贮藏过程中的活性。双乳液体系中U-QSDF/乳清蛋白的复合凝聚物作为外水相,为菌体提供第一道物理屏障,并借助油相中的乳化剂分子将益生菌包埋在内部,隔绝外界环境,进一步提高L4-11在贮藏环境下的稳定性。
a-4 ℃;b-25 ℃;c-37 ℃
图15 复合凝聚、双乳液微胶囊的贮藏稳定性
Fig.15 Storage stability of complex coacervation and double emulsion microcapsules
3 结论
本研究制备藜麦麸皮可溶性膳食纤维-乳清蛋白的复合凝聚物作为益生菌包埋壁材,在此基础上构建了复合凝聚微胶囊和双乳液体系来包埋植物乳植杆菌,从而提升L4-11在胃肠道中的耐受性和贮藏稳定性。研究结果表明,在pH 2.75时,U-QSDF∶乳清蛋白为1∶3是复合物最佳制备条件,以此为壁材,通过复合凝聚制备的益生菌微胶囊包埋率为66.26%,采用复合凝聚物作为双乳液体系外水相,进一步提高乳液的稳定性,为菌体提供“三重保护”,包埋率提升为84.33%。在胃液消化2 h后,复合凝聚活菌数为4.26 lg CFU/g、双乳液活菌数为6.49 lg CFU/g,相比游离L4-11的活菌数均有显著提升,贮藏稳定性结果表明,微胶囊可以显著提高L4-11对于不良环境的抵抗力。这些研究为藜麦麸皮的回收利用提供了新思路,也证明由藜麦可溶性膳食纤维-蛋白质复合凝聚物为壁材,通过不同包埋方式可以增强益生菌抵御不利环境因素的能力,可为食品工业中高活性、高稳定性益生菌制品及活性物质的开发利用提供理论支持。
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