冻融联合酶解制备多孔淀粉结构、吸附性能及包埋阿魏酸稳定性研究

淀粉作为植物界中最主要的储藏类碳水化合物,广泛存在于植物的种子、块茎和谷物中。因其具备丰富的可用性、可再生性和低成本等优点,通常可以作为胶凝剂、增稠剂、稳定剂和吸附剂等广泛应用于食品行业[1]。然而,淀粉作为吸附剂却受到较低的比表面积和孔隙体积的限制,为了克服这些缺点,获得高比表面积和孔体积,开发了多孔淀粉。多孔淀粉作为一种新型的改性淀粉,其特点在于淀粉颗粒存在许多由表面延伸至内部的孔洞或凹陷。与天然淀粉相比,由于其独特的孔洞结构,使其具备更大的比表面积和优异的吸附能力[2-3]。目前,多孔淀粉的制备方法包括物理法、化学法和生物酶法。在这些方法中,生物酶法因其高效、易控制、副产物少等优点而被广泛应用。为进一步缩短酶解时间及提高酶与淀粉的反应效率,增加吸附容量,通常将生物酶法与其他预处理方法相结合制备多孔淀粉[4]。因物理方法不会导致淀粉产生化学物质或衍生产物,是一种安全、可靠的淀粉改性方法,因此研究者们常将物理改性与酶解相结合制备多孔淀粉。常用的物理改性方法包括超声波处理、湿热处理、脉冲电场处理、冻融(freeze thawing,FT)处理等[5-8]。其中FT处理因其操作简单,工业化生产易实现等特点备受关注,FT处理主要是指在冷冻过程中,水分子向冰晶的相变过程中所产生的冰晶机械力作用于淀粉颗粒,进而实现对淀粉的改性。贾会杰[9]研究发现,经FT处理后油莎豆淀粉表面变得粗糙,出现少量微孔,粗糙程度与微孔数量随FT循环次数而增加。Zhao等[10]对淀粉进行FT处理,随后通过α-淀粉酶酶解发现,FT-酶解制备的多孔淀粉可有效提高淀粉的吸附性能。上述研究证明,FT处理协同酶解可作为制备多孔淀粉的有效方法。同时,多孔淀粉常作为壁材吸附多酚类化合物、维生素和油类等,减弱空气、光照或加热等条件下对芯材的影响。

多酚是一类重要的植物次生代谢产物,因其独特生物活性,常被应用于医药、食品、化妆品等领域。其中,阿魏酸(ferulic acid,FA)是一种广泛分布于植物界的多酚化合物,其具有抗氧化、抗炎、抗纤维化等多种生物活性[11-12]。但由于其易受到光照和温度等外界因素的影响,导致其生物活性降低。因此,采用多孔淀粉对FA进行包埋保护,以提升其稳定性,具有重要的研究意义与应用价值。涂安[13]通过低温等离子体联合酶解制备多孔淀粉用于包埋FA发现,其在光照条件下,FA的稳定性得以改善。廖钟娟[14]制备多孔淀粉包埋玉米黄质发现,酶解前对淀粉进行脉冲电场处理,使多孔淀粉获得更多更深的孔洞,对玉米黄质起到了保护作用,使其储藏稳定性得以提升。目前,针对FT处理协同酶解制备多孔淀粉用于包埋FA的报道较少,对此方法包埋FA的效果不够明确。

因此本研究以玉米淀粉作为原料,对其进行冻融处理和酶解制备多孔淀粉,通过显微形态观察和吸附能力确定其包埋潜力。通过测定包埋物的扫描电镜、包埋量、稳定性和抗氧化能力等指标进行分析。该研究结果为冻融协同酶解处理制备多孔淀粉及活性物质的包埋提供了理论基础,为多孔淀粉的工业化及应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

玉米淀粉(直链淀粉为26%),黑龙江龙凤玉米开发有限公司;醋酸-醋酸钠缓冲溶液(0.1 mol/L,pH=5.0)、猪胰腺α-淀粉酶(活力=10 000 U/g)、淀粉葡萄糖苷酶(活力=100 000 U/g)、FA,上海源叶生物科技有限公司;大豆油,市售;DPPH自由基、ABTS阳离子自由基清除能力检测试剂盒,北京索莱宝科技有限公司。

振荡培养箱,上海旻泉仪器有限公司;TDZ5-WS低速多管架自动平衡离心机,湖南湘仪实验室仪器开发有限公司;Sigma 360扫描电子显微镜、LSM 880 NLO激光共聚焦显微镜,德国Zeiss公司;Autosorb-iQ 吸附分析仪,美国Quantachrome仪器公司;DF-101S集热式恒温加热磁力搅拌器,上海力辰邦西仪器科技有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 淀粉样品制备

1.2.1.1 冻融淀粉的制备

参考Liu等[15]的方法并稍作修改。将玉米淀粉配制成40%(质量分数)的淀粉悬浮液,充分搅拌后将其放置于-18 ℃冰箱中冷冻22 h,然后转移至25 ℃水浴锅中至完全融化,最后将处理样品置于45 ℃烘箱中进行干燥,完全干燥后,研末至细粉,使其通过100目筛,密封保存备用,分别命名为天然玉米淀粉(corn starch,CS)和冻融淀粉(freeze-thaw starch,FTS)。

1.2.1.2 多孔淀粉的制备

参考Zhang等[16]的方法并稍作修改。分别将10 g CS和FTS分散在40 mL醋酸-醋酸钠缓冲溶液(0.1 mol/L,pH=5.0)中,配制成淀粉悬浮液。将淀粉悬浮液放置于55 ℃振荡摇床中(150 r/min)上预热10 min,基于前期实验结果,分别加入α-淀粉酶(基于淀粉质量的0.6%)和淀粉葡萄糖苷酶(基于淀粉质量的2.4%)水解8 h。将水解后的悬浮液与2倍体积无水乙醇混合,使酶失活,将混合物以4 000 r/min离心20 min,用蒸馏水洗涤3次,将沉淀物放置于45 ℃烘箱中干燥24 h,研磨至细粉,使其通过100目筛,密封保存备用,分别命名为CS-EN和FTS-EN。

1.2.2 显微形貌观测

1.2.2.1 扫描电子显微镜观察

将导电胶黏在载物盘上,放置适量淀粉,在真空条件下喷金,用3.0 kV加速电压下观察淀粉样品,并在放大倍数为3 000的条件下拍摄图像。

1.2.2.2 激光共聚焦扫描显微镜观察

参考Monroy等[17]的方法并稍作修改。用去离子水配制1%的淀粉悬浮液,加入40 μL异硫氰酸荧光素溶液(0.01 g/10 mL),充分混合均匀,室温下避光染色一段时间。仪器参数设置为:用He-Ne激光线激发样品荧光,选择488 nm激光发射器,接收光为510 nm,分辨率1 024×1 024条件下拍摄,观测淀粉颗粒内外染色分布情况。

选取50 mL已知质量的离心管(m),称1.0 g左右淀粉样品(m1)和5 mL水/豆油置于离心管中,持续振荡20 min,然后4 000 r/min离心20 min。倒掉上层水/豆油,用滤纸将离心管内壁残留纯水/豆油擦拭后,称量沉淀物及离心管质量(m2)。吸附能力按公式(1)计算:

1.2.4 低温氮吸附实验测定

将多孔淀粉样品在120 ℃下真空脱气5 h。冷却后,在-196 ℃下使用吸附分析仪对淀粉样品进行氮气吸附测量。通过BET和BJH方法对所得数据进行分析,以确定比表面积、总孔容和平均孔径。

1.2.5 FA标准曲线的制作

配制1 mg/mL的FA标准溶液(现配现用),将FA标准溶液分别进行稀释,配制成质量浓度为0、20、40、60、80、100 μg/mL的溶液。分别取1 mL不同浓度的FA溶液加入1 mL福林酚试剂和 4 mL 150 g/L的Na2CO3溶液置于容量瓶中,混匀后定容至10 mL,摇匀,在室温下避光反应1 h后测定765 nm处吸光度值,并以质量浓度为横坐标,吸光度为纵坐标建立标准曲线(y=3.925 7x+0.028 5,R2=0.999)。

1.2.6 包埋物的制备

用乙醇配制1 mg/mL的FA溶液20 mL,分别加入0.5 g淀粉(CS、CS-EN、FTS-EN),在冰浴条件下超声波处理30 min,随后置于恒温磁力搅拌器中,25 ℃,300 r/min搅拌60 min。然后4 000 r/min 离心20 min。收集沉淀,将沉淀冻干备用,分别命名为CS-FA、CS-EN-FA、FTS-EN-FA。

1.2.7 多孔淀粉包埋率、包埋量的测定

测定1.2.6节上清液中FA的含量,计算多孔淀粉对FA的包埋率及包埋量,计算如公式(2)、公式(3)所示:

式中:C0,初始溶液中FA质量浓度,mg/mL;Ce,吸附后溶液中FA质量浓度,mg/mL;V,悬浮液体积,mL;m,淀粉质量,g。

1.2.8 包埋物稳定性测定

1.2.8.1 包埋物光照稳定性测定

将CS-FA、CS-EN-FA和FTS-EN-FA放置于无色透明具塞的瓶中,分别放置于光照下3、6、9、12、15 d(夜间用灯光替代),每3 d称取100 mg的包埋物粉末加入10 mL无水乙醇中,将混合物旋转并分散2 min,然后避光超声波处理20 min,并在4 000 r/min下离心20 min后,取上清液稀释测定其保留率,计算如公式(4)所示:

式中:Cd,光照不同时间(d)后FA的含量,mg/g;C0,光照0 d时FA的含量,mg/g。

1.2.8.2 包埋物温度稳定性测定

将CS-FA、CS-EN-FA和FTS-EN-FA放置于烘箱中进行1 d储藏温度测试,温度分别设为40、60、80、100、120 ℃,然后称取100 mg的包合物粉末加入10 mL无水乙醇中,将混合物旋转并分散2 min,然后避光超声波处理20 min,并在4 000 r/min下离心20 min后,取上清液稀释测定其保留率,计算如公式(5)所示:

式中:Ct,不同储藏温度后FA的含量,mg/g;C0,初始时FA的含量,mg/g。

1.2.8.3 包埋物储藏稳定性测定

将CS-FA、CS-EN-FA和FTS-EN-FA避光储藏不同时间,分别为3、6、9、12、15 d,每3 d称取100 mg的包合物粉末加入10 mL无水乙醇中,将混合物旋转并分散2 min,然后避光超声波处理20 min,并在4 000 r/min下离心20 min后,取上清液稀释测定其保留率,计算如公式(6)所示:

式中:CD,不同储藏时间后FA的含量,mg/g;C0,初始时FA的含量,mg/g。

1.2.9 包埋物抗氧化特性测定

1.2.9.1 DPPH自由基清除能力

按DPPH自由基清除能力检测试剂盒操作,乙醇为空白,515 nm测吸光度,计算如公式(7)所示:

式中:A0,空白组吸光度;Ad1,待测样吸光度;Ad2,对照组吸光度。

1.2.9.2 ABTS阳离子自由基清除能力

按ABTS阳离子自由基清除能力检测试剂盒操作,避光6 min,405 nm测吸光度,计算如公式(8)所示:

式中:A0,空白组吸光度;Ad3,待测样吸光度。

1.2.10 包埋物体外模拟缓释特性测定

参考纪桂英[18]的方法并稍作修改。分别准确称取CS-FA、CS-EN-FA和FTS-EN-FA样品100 mg,分别加入20 mL模拟胃液、模拟肠液,并将其放入37 ℃振荡摇床中以150 r/min摇动。分别在0、30、60、90、120 min时取样,并在3 000 r/min下离心20 min,取上清液稀释测定其释放率,计算如公式(9)所示:

式中:Ct,样品t时刻释放的FA含量,mg;C0,初始样品的FA含量,mg。

1.3 数据处理

所有实验重复3次,数据以“平均值±标准差”表示,利用SPSS 27分析,Origin 2021绘图。

2 结果与分析

2.1 淀粉颗粒形貌及内部特征分析

通过扫描电镜观察淀粉颗粒形貌(图1-a),CS为不规则多边形,且表面光滑,无明显裂纹和孔隙。与CS相比,FT处理使部分淀粉颗粒表面粗糙,且伴有轻微压痕或凹坑现象,这是由在冷冻过程中,水分形成冰晶所产生的机械力和局部高压对淀粉颗粒进行机械挤压所导致的[19-20]。经酶解后,CS-EN和FTS-EN颗粒表面均出现孔洞,与CS-EN相比,FTS-EN的孔洞数有所增加,均匀性更好,造成此现象的原因是FT处理所产生的冰晶机械力会破坏淀粉的结晶结构,无定形比例增加,为酶提供了更多的作用位点,促进酶的水解,因此使酶解作用更广泛。

由图1-b可以看出CS颗粒无孔洞结构,内部没有空腔结构,与扫描电镜所展示CS光滑的形貌特征相一致。FT及酶解处理均改变玉米淀粉颗粒的内部结构,FTS颗粒内部伴有裂缝现象,这是由FT处理过程中两相转变(冻结-解冻过程:液态水转变为固态冰晶转变为液态水)产生的机械力导致的。与CS-EN相比,FTS-EN的孔洞、空腔结构更多,且孔洞分布更均匀,这与扫描电镜结果相一致。由此可以证明FT协同酶解可以有效制备多孔淀粉,由于多孔淀粉其孔洞和空腔的存在,使其具备包埋潜力,这与Zhang等[21]研究结果相一致。

2.2 淀粉吸附性能及多孔淀粉比表面积、孔容和平均孔径分析

淀粉的吸水率和吸油率可证明其吸附性能。由表1可知,CS的吸水率和吸油率分别为73.95%、69.94%,与CS相比,FT处理导致淀粉吸水率显著上升(P<0.05),这是因为FT处理使淀粉颗粒出现压痕或凹坑现象,可能使淀粉样品暴露出更多的羟基(—OH),使得吸水能力得以提高,FTS吸油率显著下降(P<0.05),此现象可能是FT处理引起淀粉颗粒表面化学基团数目的变化导致的,这与Zhao等[10]研究结果一致。CS-EN和FTS-EN的吸水率和吸油率均显著上升(P<0.05),这是由多孔淀粉独特的孔洞结构和空腔结构所导致的,且FTS-EN的吸附性能均显著高于CS-EN(P<0.05),证明FT协同酶解制备多孔淀粉可以提高其吸附性能。

如图2所示,CS-EN的比表面积、孔容和平均孔径分别为7.71 m2/g、10.73 cc/g×10-3、7.77 nm,与CS-EN相比,FTS-EN的比表面积、孔容和平均孔径均显著上升(P<0.05),这可能是由于FT处理所产生的冰晶机械力和局部高压使淀粉颗粒表面产生轻微压痕或凹坑,进而为酶分子提供更多的接触面积,使水解过程的发生更为广泛。同时,FTS-EN的吸水率和吸油率显著高于CS-EN(P<0.05),可能是由于FTS-EN的高比表面积和高孔容可以更大程度保留水/油。

2.3 包埋物颗粒形貌分析

如图3所示,分别与CS、CS-EN、FTS-EN的颗粒形貌相比,包埋FA后的颗粒形貌无明显变化,这可能是由于FA先溶于乙醇溶液,均匀分散在溶液中,在吸附过程中通过孔洞进入多孔淀粉的内部空腔中,不易被察觉。张妍[22]、赵雪[23]分别通过有机溶剂法溶解原花青素和青蒿素,随后通过多孔淀粉进行包埋,得到的包埋物形貌结果与本实验研究结果一致。

2.4 包埋率和包埋量分析

如表2所示,CS-FA的包埋率和包埋量分别为4.85%、1.94 mg/g,与CS-FA相比,CS-EN-FA和FTS-EN-FA的包埋率和包埋量均显著提高(P<0.05),包埋量分别提高1.73、2.27倍,包埋量的提高主要依靠多孔淀粉独特的孔洞结构和空腔结构实现对FA的装载。其中FTS-EN-FA的包埋率和包埋量最高,由此可以进一步证明FT协同酶解制备多孔淀粉包埋多酚类化合物的有效性。

2.5 包埋物稳定性分析

如图4-a所示,当光照时间分别为3、15 d时,CS-FA中FA的保留率分别为82.33%、59.00%;当温度分别为40、120 ℃时,CS-FA中FA的保留率分别为91.67%、65.67%(图4-b);当储藏时间分别为3、15 d时,CS-FA中FA的保留率分别为88.28%、66.90%(图4-c)。与CS-FA相比,CS-EN-FA和FTS-EN-FA的保留率均显著提高(P<0.05)。造成此现象的原因可能是CS-FA所包埋的FA多为表面物理吸附,易直接受到光照、温度和储藏时间的影响,加速了FA的降解。CS-EN-FA和FTS-EN-FA的保留率较高的原因可能是因为在包埋过程中FA吸附在孔洞和内部空腔中,使内部的FA减少因光照、温度和储藏时间造成的影响。其中FTS-EN-FA的保留率最高,这是因为FTS-EN-FA孔洞数量多且分布相对均匀。这与王诗怡[24]、涂安[13]的研究结果趋势相一致。

综上,随着光照时间、温度、储藏时间的增加,CS-FA、CS-EN-FA、FTS-EN-FA中FA的保留率总体呈下降趋势,这是因为FA对外界环境具有高度敏感性。在不同条件处理下,多孔淀粉中FA的保留率均显著高于CS,由此证明多孔淀粉作为壁材对FA进行包埋可以提高其稳定性。

2.6 包埋物抗氧化特性分析

如图5所示,与CS-FA相比,CS-EN-FA、FTS-EN-FA的DPPH自由基清除率和ABTS阳离子自由基清除率均显著提高(P<0.05),说明多孔淀粉包埋FA具有良好的抗氧化活性。FTS-EN-FA的DPPH自由基、ABTS阳离子自由基清除率分别为41.64%、34.46%,均显著高于CS-FA和CS-EN-FA(P<0.05),较CS-FA的DPPH自由基清除率、ABTS阳离子自由基清除率分别提升1.73、1.77倍,较CS-EN-FA分别提升29.07%、35.29%,此现象可能是FTS-EN-FA的高吸附性能导致的。由此进一步说明经FT协同酶解制备的多孔淀粉不仅能够提高FA的包埋率,还能保留其绝大部分的抗氧化特性。这与Han等[25]通过改性多孔淀粉包埋姜黄素的抗氧化活性测定结果趋势相一致。

2.7 包埋物的体外消化模拟分析

如图6-a、图6-b所示,CS-FA、CS-EN-FA、FTS-EN-FA在模拟胃/肠液中处理30 min时,均呈现较高的释放率,造成此现象的原因是淀粉对于FA的包埋依靠吸附作用,在前期吸附在淀粉颗粒表面及部分孔洞中的FA,优先释放到胃/肠液中,导致释放率较高。同一时刻CS-FA、CS-EN-FA、FTS-EN-FA在模拟肠液中的释放率均高于模拟胃液中,说明包埋物主要在肠道中发生降解,释放FA,同时模拟肠液中含有胰酶,淀粉发生水解,使吸附在淀粉内部的FA得以释放,提高释放率。

在模拟胃部环境时,CS-FA、CS-EN-FA、FTS-EN-FA的FA总释放率分别为52.16%、45.39%、42.86%,在模拟肠部环境时,CS-FA、CS-EN-FA、FTS-EN-FA的FA总释放率分别为58.88%、55.78%、53.24%,其中CS-FA在模拟胃/肠条件下总释放率最高,可能是由于CS对FA多为表面吸附,吸附作用较弱。由此可以说明多孔淀粉作为壁材包埋FA可以有效减缓在胃肠中的释放。这与廖钟娟[14]的体外消化模拟研究结果趋势相一致。

综上,CS-FA无法在模拟胃/肠液中缓慢释放,通过多孔淀粉包埋FA可以起到一定的缓释作用,其中FTS-EN-FA的缓释效果最好,可以使FA在肠消化过程中得以大量释放,从而被人体吸收利用。

3 结论

本研究通过FT协同酶解制备多孔淀粉,FTS-EN孔洞数量多且分布较为均匀,在吸附性能方面,其吸水率和吸油率分别达到124.65%、102.87%,展现出较好的吸附能力,同时,其比表面积、孔容和平均孔径均得到提高,使其具备包埋潜力。包埋FA后,FTS-EN-FA包埋量为6.35 mg/g,较CS-FA和CS-EN-FA分别提高1.73、2.27倍,证明了FT协同酶解制备多孔淀粉用于包埋生物活性物质的可行性。在不同光照时间、温度、储藏时间条件下,FTS-EN-FA中的FA保留量最高,说明多孔淀粉可减少外界环境因素对FA的影响。FTS-EN-FA的DPPH自由基和ABTS阳离子自由基清除率分别为41.64%、34.46%,较CS-FA分别提升1.73、1.77倍。此外,体外消化模拟实验证实多孔淀粉包埋FA可以减缓FA在模拟胃/肠中的突释现象,起到一定的缓释作用,其中FTS-EN-FA缓释效果最好。综上,通过FT协同酶解制备多孔淀粉包埋生物活性物质是一种高效可行的方法,有助于构建性能良好的淀粉基载体材料。

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