茶叶在中国历史悠久,其品质和营养价值受到广泛关注。茶叶的品质是由其复杂的化学成分共同塑造的,挥发性成分贡献了其独特的香气,而非挥发性成分则主要决定了滋味与汤色,两者共同构成了茶叶的整体品质特征。其中儿茶素、生物碱和氨基酸是三类关键的非挥发性成分[1-3],这些成分的种类与含量对茶叶的滋味、色泽等品质有重要影响,并且还具有抗癌、抗氧化、抗炎、抗菌、保护心血管、降血糖和抗肥胖等功效[4-10]。
目前,茶叶中功能成分检测主要采用HPLC法[11-14]、LC-MS法[15-18]等。传统HPLC法前处理繁琐、分析时间长,且因灵敏度与分离度有限,难以实现多类组分的同时检测,特别是性质差异较大的物质。刘昕等[11]使用高效液相色谱仪联用二极管阵列检测器法,在25 min内实现了茶提取物中的9种儿茶素类和3种生物碱类化合物的同时定量分析,但该方法只能检测儿茶素和生物碱,无法同时检测氨基酸,并且分析时间较长。LC-MS技术凭借其高灵敏度与高选择性已成为复杂基质中多组分分析的有力工具[19],但现有研究大多仍局限于单一或少数类别的成分分析。尽管已有LC-MS能定量多达130种成分,但根据待测成分亲水和疏水等特性,需用不同色谱柱进行洗脱分离,过程复杂[15]。因儿茶素、生物碱及氨基酸三类化合物在极性范围、酸碱性、紫外吸收特征、质谱离子化效率等方面存在显著差异,现有方法多用于检测单一或少数几种成分。因此,亟需开发一种能够同时检测茶叶中儿茶素、生物碱和氨基酸的高效、高通量检测方法。
本研究通过超高效液相色谱-高分辨质谱(ultra-high performance liquid chromatography-high resolution mass spectrometry,UPLC-HRMS)建立一种同时测定茶叶中多种儿茶素、生物碱和氨基酸的检测方法。将所建立的方法应用于实际样品的检测中,并对相关成分进行分析,以期为茶叶的品质评价提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
茶叶样品(S1～S7),均为市售茶叶。
17种氨基酸混合标准品:其中L-胱氨酸浓度为1.25 mmol/L,其余(L-丙氨酸、L-精氨酸、L-天冬氨酸、L-谷氨酸、甘氨酸、L-组氨酸、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-赖氨酸、L-甲硫氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-酪氨酸、L-缬氨酸)浓度均为2.5 mmol/L,德国Sigma-Aldrich公司;γ-氨基丁酸、L-色氨酸、没食子酸、儿茶素、表儿茶素、表没食子儿茶素(epigallocatechin, EGC)、表没食子儿茶素没食子酸酯(epigallocatechin gallate, EGCG)、表儿茶素没食子酸酯(epicatechin gallate, ECG)、茶碱、可可碱标准品(纯度≥98%),上海源叶生物科技有限公司;咖啡碱标准品(纯度≥98%),ChemFaces;L-茶氨酸标准品(纯度≥98%),北京索莱宝科技有限公司;甲醇、甲酸(色谱纯),美国Fisher公司。
1.2 主要仪器设备
Q Exactive Focus高效液相色谱-高分辨质谱联用仪、Hypersil GOLD色谱柱(150 mm×2.1 mm,1.9 μm),美国Thermo Fisher Scientific公司;SB5200DT超声波清洗装置,宁波新芝生物科技股份有限公司;5810R高速冷冻离心机,德国Eppendorf公司;Master touch-S30UVFH纯水机,上海和泰仪器有限公司;Tube Mill 100控制型试管研磨机,德国IKA公司。
1.3 实验方法
1.3.1 标准溶液的配制
储备液:准确称取咖啡碱、茶碱、可可碱、没食子酸、儿茶素、表儿茶素、EGC、EGCG、ECG,用0.1%甲酸-50%甲醇(体积分数,下同)溶液配制成质量浓度为100 mg/L的储备液,准确称取L-色氨酸、L-茶氨酸和γ-氨基丁酸标准品,配制成浓度为2.5 mmol/L的储备液,4 ℃冰箱中储存备用。
待测组分混合标准系列溶液:以0.1%甲酸-50%甲醇溶液为溶剂,配制成29种待测组分混合标准工作系列溶液,没食子酸、儿茶素、表儿茶素、EGC和3种生物碱标准系列质量浓度为10、25、50、100、250、500、750、1 000 μg/L溶液,EGCG和ECG标准系列质量浓度为50、100、200、500、1 000、1 500、2 000 μg/L,19种氨基酸标准系列浓度为0.1、0.25、0.5、1.0、2.5、5.0、7.5、10.0 μmol/L,L-胱氨酸浓度为0.05、0.125、0.25、0.5、1.25、2.5、3.75、5.0 μmol/L,置于4 ℃冰箱中储存备用,经0.22 μm有机滤膜过滤后上机检测。
1.3.2 样品前处理
将茶叶通过研磨机在10 000 r/min下处理1 min,得待测样品;取0.2 g待测样品于50 mL的离心管中,加入0.1%甲酸-50%甲醇溶液20 mL,超声波30 min、10 000 r/min离心10 min后,取上清液用0.1%甲酸-50%甲醇溶液稀释合适倍数,过滤上机待测。
1.3.3 色谱与质谱条件
色谱条件:通过流动相、色谱柱和洗脱程序等对比分析优化确定最佳色谱条件,即采用0.1%甲酸水溶液(水相)与甲醇溶液(有机相)为流动相,流速0.2 mL/min,柱温40 ℃,进样体积2 μL,色谱柱为Hypersil GOLD色谱柱(150 mm×2.1 mm,1.9 μm),梯度洗脱程序:0～3 min,100%水相;3～11 min,100%～5%水相;11～13min,5%水相;13～13.1 min,5%～100%水相;13.1～16min,100%水相。
质谱条件:通过扫描模式及相关参数优化确定最佳质谱条件,即正负离子切换扫描,喷雾电压3 200 V,鞘气35 Arb,辅助气流速10 Arb,吹扫气0 Arb,离子传输管温度320 ℃,辅助气加热温度350 ℃,扫描模式:Full MS/dd-MS2,扫描范围50～600 m/z。
1.3.4 样品品质评价
以29种特征成分为因子进行主成分分析,结合得分矩阵得到各主成分的回归方程,以各主成分对应的方差贡献率为权重进行加权综合,构建茶叶品质综合评价模型,据此可计算样品的综合得分。
1.4 数据处理
实验数据的采集与处理采用Q Exactive Focus UPLC-HRMS结合Xcalibur软件进行定性和定量分析。原始数据经Excel初步整理后,应用相关专业软件进行图形绘制及主成分分析(principal components analysis,PCA)。
2 结果与分析
2.1 前处理优化
本研究对比了水、20%甲醇溶液(体积分数)、50%甲醇溶液(体积分数)、70%甲醇溶液(体积分数)、0.1%甲酸-50%甲醇溶液4种提取溶剂对茶叶功能成分提取效果的影响,结果如图1所示。水对氨基酸、儿茶素和生物碱3类物质的总提取量最低,随着甲醇比例升高逐渐增加,但在甲醇溶液浓度超过50%后变化不显著,故选择50%甲醇溶液作为基础溶剂。0.1%甲酸(体积分数)在液相色谱-质谱分析中常用于调节pH、提高目标物离子化效率,且被广泛报道为一种能有效提取多种植物酚酸和生物碱而不引起显著降解的常见添加剂浓度[20-21]。在本研究考察的溶剂体系中,添加0.1%甲酸(体积分数)相较于纯50%甲醇溶液(体积分数),可显著提高目标成分的提取量。因此,在本次实验所评估的范围内,0.1%甲酸-50%甲醇溶液表现出最佳的提取效果,被确定为本实验的提取溶剂。该溶剂体系可兼顾极性与非极性组分的溶解性,实现多种功能成分的跨极性同步提取,并有效抑制多糖、蛋白质等干扰物质的溶出[15,22]。
图1 不同提取溶剂对茶叶功能成分的影响
Fig.1 Effect of different extraction solvents on the functional components of tea
注:不同小写字母表示处理间在P<0.05水平上差异显著。
2.2 质谱条件优化
本研究对比了正离子与负离子扫描模式下各目标物的响应强度。结果显示,儿茶素类化合物在负离子模式下的响应较高,生物碱和氨基酸在正离子模式下响应强度更大。因此,鉴于待测物在不同电离模式下的响应差异,最终采用正负离子切换扫描模式对29种组分进行同步检测,各待测组分的化合物信息及质谱参数如表1所示。
表1 29种待测组分质谱参数
Table 1 Mass spectrometry parameters of 29 components to be tested
序号化合物分子式加和离子形式母离子/(m/z)保留时间/min1儿茶素C15H14O6[M-H]-289.071 89.472表儿茶素C15H14O6[M-H]-289.071 810.033EGCC15H14O7[M-H]-305.066 89.284EGCGC22H18O11[M-H]-457.078 99.795ECGC22H18O10[M-H]-441.082 310.426没食子酸C7H6O5[M-H]-169.013 45.697茶碱C7H8N4O2[M+H]+181.071 89.678可可碱C7H8N4O2[M+H]+181.071 88.999咖啡碱C8H10N4O2[M+H]+195.087 710.1710L-天冬氨酸C4H7NO4[M+H]+134.044 71.8711L-苏氨酸C4H9NO3[M+H]+120.080 71.9112L-丝氨酸C3H7NO3[M+H]+106.049 81.8513L-谷氨酸C5H9NO4[M+H]+148.060 31.9314L-脯氨酸C5H9NO2[M+H]+116.070 52.1215甘氨酸C2H5NO2[M+H]+76.039 31.8316L-丙氨酸C3H7NO2[M+H]+90.054 91.89
续表1
序号化合物分子式加和离子形式母离子/(m/z)保留时间/min17L-胱氨酸C6H12N2O4S2[M+H]+241.030 91.8018L-缬氨酸C5H11NO2[M+H]+118.086 22.7519L-甲硫氨酸C5H11O2NS[M+H]+150.058 23.3220L-异亮氨酸C6H13NO2[M+H]+132.101 86.0021L-亮氨酸C6H13NO2[M+H]+132.101 86.5522L-酪氨酸C9H11NO3[M+H]+182.081 14.6023L-苯丙氨酸C9H11NO2[M+H]+166.086 18.7024L-组氨酸C6H9N3O2[M+H]+156.076 61.7825L-赖氨酸C6H14N2O2[M+H]+147.112 71.7426L-精氨酸C6H14N4O2[M+H]+175.118 81.8027L-茶氨酸C7H14N2O3[M+H]+175.106 73.1728γ-氨基丁酸C4H9NO2[M+H]+104.052 71.9729L-色氨酸C11H12N2O2[M+H]+205.096 59.78
2.3 色谱条件优化
2.3.1 流动相优化
本研究比较了1 mmol/L甲酸铵-0.1%甲酸水和甲醇、0.1%甲酸水(体积分数)和甲醇、0.1%甲酸水(体积分数)和乙腈3组流动相对待测组分分离效果的影响。结果表明,当流动相0.1%甲酸水和乙腈时,同分异构体可可碱和茶碱的分离度较差,见图2;而使用1 mmol/L甲酸铵-0.1%甲酸水和甲醇会使EGCG的响应值偏低,见图3。综合比较,最终选择0.1%甲酸水(体积分数)和甲醇为本方法的流动相,实现对茶叶中29种待测组分的有效分离。
a-1 mmol/L甲酸铵-0.1%甲酸水和甲醇;b-0.1%甲酸水和甲醇;c-0.1%甲酸水和乙腈
图2 不同流动相下可可碱与茶碱提取离子色谱图
Fig.2 Ion chromatograms of theobromine and theophylline under different mobile phase
a-1 mmol/L甲酸铵-0.1%甲酸水和甲醇;b-0.1%甲酸水和甲醇;c-0.1%甲酸水和乙腈
图3 EGCG提取离子色谱图
Fig.3 Ion chromatograms of EGCG under different mobile phase
2.3.2 洗脱程序优化
本研究考察了不同梯度洗脱程序对目标物的分离效果,洗脱程序1:0～2 min,100%水相;2～9 min,100%～5%水相;9～13 min,5%水相;13～13.1 min,5%～100%水相;13.1～16 min,100%水相。洗脱程序2:0～2 min,100%水相;2～11 min,100%～5%水相;11～13 min,5%水相;13～13.1 min,5%～100%水相;13.1～16 min,100%水相。洗脱程序3:0～3 min,100%水相;3～11 min,100%～5%水相;11～13 min,5%水相;13～13.1 min,5%～100%水相;13.1～16 min,100%水相。如图4所示,同分异构体L-异亮氨酸和L-亮氨酸在洗脱程序1和2条件下,两者分离度都较差。综合比较,洗脱程序3可实现对异构体有效分离,故选择作为最终洗脱条件。
a-洗脱程序1;b-洗脱程序2;c-洗脱程序3
图4 不同洗脱程序下L-异亮氨酸与L-亮氨酸提取离子色谱图
Fig.4 Ion chromatograms of L-isoleucine and L-leucine extraction under different elution procedures
a-Syncronis HILIC;b-Accucore aQ;c-Hypersil GOLD;d-Hypersil GOLD aQ
图5 不同色谱柱下L-亮氨酸与L-异亮氨酸提取离子色谱图
Fig.5 Ion chromatograms of L-leucine and L-isoleucine under different chromatographic columns
2.3.3 色谱柱优化
本研究对比了不同色谱柱Accucore aQ (150 mm×2.1 mm, 2.6 μm)、Hypersil GOLD aQ (150 mm×2.1 mm, 1.9 μm)、Syncronis HILIC (100 mm×2.1 mm, 1.7 μm)和Hypersil GOLD (150 mm×2.1 mm, 1.9 μm)对待测组分的分离效果。如图5和图6所示,Syncronis HILIC对同分异构体L-亮氨酸和L-异亮氨酸、茶碱和可可碱的分离效果均较差;Accucore aQ未能实现对L-亮氨酸和L-异亮氨酸的有效分离;Hypersil GOLD aQ对2对同分异构体的分离效果不及Hypersil GOLD。因此,本方法最终选用分离性能最优的Hypersil GOLD色谱柱。
a-Syncronis HILIC;b-Accucore aQ;c-Hypersil GOLD;d-Hypersil GOLD aQ
图6 不同色谱柱下茶碱和可可碱提取离子色谱图
Fig.6 Extracted ion chromatograms of theophylline and theobromine under different chromatographic columns
2.4 方法验证
2.4.1 方法的线性范围、检出限及定量限
采用外标法对29种待测组分进行定量分析,以各组分定量离子峰面积(Y)对标准溶液浓度(X)进行线性回归,绘制标准曲线。以定量离子信噪比S/N=3对应的浓度为检出限(detection limits,LOD),S/N=10为定量限(quantification limits,LOQ),具体结果见表2。结果表明,各组分在测定范围内线性关系良好,决定系数(R2)均大于0.988 7,除ECG外,其余组分的决定系数(R2)均大于0.990 0。
表2 各待测组分的线性关系、检出限和定量限结果
Table 2 Linear relationships, detection limits, and quantification limits for target compounds
序号化合物标准曲线方程线性范围决定系数(R2)LODLOQ1儿茶素Y=1.21×105X-8.01×10511.0～1 100.0 μg/L0.999 85.5 μg/L11.0 μg/L2表儿茶素Y=1.45×105X-7.37×10510.6～1 060.0 μg/L0.999 45.3 μg/L10.6 μg/L3EGCY=5.03×105X-1.60×10629.5～1 180.0 μg/L0.998 711.8 μg/L29.5 μg/L4EGCGY=4.66×104X-1.60×10655.0～2 200.0 μg/L0.997 122.0 μg/L55.0 μg/L5ECGY=7.56×104X112.0～560.0 μg/L0.988 722.4 μg/L56 μg/L6没食子酸Y=1.08×105X-6.33×10511.8～472.0 μg/L0.993 45.6 μg/L11.8 μg/L7茶碱Y=4.83×105X55.0～1 100.0 μg/L0.998 327.5 μg/L55.0 μg/L8可可碱Y=3.28×105X+7.51×10625～1 000.0 μg/L0.998 610.0 μg/L25.0 μg/L9咖啡碱Y=4.79×105X11.0～1 100.0 μg/L0.992 15.5 μg/L11.0 μg/L10L-天冬氨酸Y=5.42×106X0.1～10.0 μmol/L0.990 40.05 μmol/L0.1 μmol/L11L-苏氨酸Y=3.28×105+9.83×106X0.25～10.0 μmol/L0.999 20.1 μmol/L0.25 μmol/L12L-丝氨酸Y=4.30×106X0.25～10.0 μmol/L0.996 50.1 μmol/L0.25 μmol/L13L-谷氨酸Y=1.40×107X0.1～10.0 μmol/L0.999 10.05 μmol/L1.0 μmol/L14L-脯氨酸Y=1.66×107X0.1～10.0 μmol/L0.997 50.05 μmol/L0.1 μmol/L15甘氨酸Y=1.33×106X0.25～10 μmol/L0.993 80.1 μmol/L0.25 μmol/L16L-丙氨酸Y=3.93×106X0.25～12.50 μmol/L0.998 50.05 μmol/L0.1 μmol/L17L-胱氨酸Y=2.23×107X0.025～5.0 μmol/L0.998 20.025 μmol/L0.05 μmol/L18L-缬氨酸Y=5.47×106+1.52×107X0.25～10.0 μmol/L0.998 20.1 μmol/L0.25 μmol/L19L-甲硫氨酸Y=1.88×107X0.25～12.50 μmol/L0.996 10.05 μmol/L0.1 μmol/L20L-异亮氨酸Y=2.26×107X-3 232.350.25～10.0 μmol/L0.999 70.1 μmol/L0.25 μmol/L21L-亮氨酸Y=3.09×107X0.1～10.0 μmol/L0.994 20.05 μmol/L0.1 μmol/L22L-酪氨酸Y=2.99×107X0.25～10.0 μmol/L0.999 40.1 μmol/L0.25 μmol/L23L-苯丙氨酸Y=6.62×105+5.13×107X0.1～10.0 μmol/L0.996 00.05 μmol/L0.1 μmol/L24L-组氨酸Y=3.48×107X0.1～10.0 μmol/L0.999 00.05 μmol/L0.1 μmol/L25L-赖氨酸Y=1.65×107X0.1～10.0 μmol/L0.999 40.05 μmol/L0.1 μmol/L26L-精氨酸Y=4.99×107X0.1～10.00 μmol/L0.997 20.05 μmol/L0.1 μmol/L27L-茶氨酸Y=4.61×107X-1.64×1060.1～10.00 μmol/L0.999 70.05 μmol/L0.1 μmol/L28γ-氨基丁酸Y=1.31×105+1.16×107X0.1～10.0 μmol/L0.999 90.05 μmol/L0.1 μmol/L29L-色氨酸Y=4.15×107X-7.32×1050.25～12.50 μmol/L0.999 50.05 μmol/L0.1 μmol/L
2.4.2 方法的精密度和回收率
为验证该方法的可靠性,向样品中添加3个不同浓度的标准溶液制备加标样,每个浓度平行测定3次,计算平均回收率与精密度,结果见表3。各组分在不同加标浓度下的平均回收率为80.77%～117.23%,相对标准偏差(relative standard deviation,RSD)为0.59%～9.81%。该方法在测定茶叶中29种氨基酸、儿茶素和生物碱时表现出良好的准确性、精密度与稳定性,满足检测需求。
表3 各待测组分的加标精密度及回收率结果
Table 3 Precision and recovery results for target compounds
序号化合物加标浓度平均回收率/%RSD/%序号化合物加标浓度平均回收率/%RSD/%1儿茶素55 μg/L90.484.36110 μg/L100.401.16275 μg/L101.833.552表儿茶素53 μg/L88.746.86106 μg/L98.192.10265 μg/L97.803.953EGC59 μg/L82.914.71118 μg/L87.762.84295 μg/L89.870.644EGCG110 μg/L82.893.58220 μg/L86.589.45550 μg/L101.790.065ECG112 μg/L115.697.81224 μg/L90.106.67560 μg/L111.863.936没食子酸59 μg/L100.523.39118 μg/L97.022.22295 μg/L89.831.847茶碱55 μg/L108.412.01110 μg/L103.261.79275 μg/L101.181.988可可碱50 μg/L97.956.41100 μg/L103.912.67250 μg/L98.743.479咖啡碱55 μg/L83.255.10110 μg/L88.370.81275 μg/L123.574.1610L-天冬氨酸0.5 μmol/L101.182.551.0 μmol/L117.233.162.5 μmol/L107.762.9011L-苏氨酸0.5 μmol/L96.374.821.0 μmol/L90.661.962.5 μmol/L91.933.2712L-丝氨酸0.5 μmol/L93.196.181.0 μmol/L92.224.652.5 μmol/L95.846.2913L-谷氨酸0.5 μmol/L96.577.631.0 μmol/L88.373.482.5 μmol/L93.042.5414L-脯氨酸0.5 μmol/L106.734.401.0 μmol/L111.781.892.5 μmol/L111.062.2915甘氨酸0.5 μmol/L89.921.581.0 μmol/L92.619.582.5 μmol/L93.616.7516L-丙氨酸0.5 μmol/L103.063.671.0 μmol/L92.164.002.5 μmol/L94.398.1117L-胱氨酸0.25 μmol/L96.596.570.5 μmol/L102.705.951.25 μmol/L94.692.9718L-缬氨酸0.5 μmol/L97.275.801.0 μmol/L104.662.342.5 μmol/L91.779.8119L-甲硫氨酸0.5 μmol/L109.591.231.0 μmol/L104.511.962.5 μmol/L106.031.8220L-异亮氨酸0.5 μmol/L88.644.661.0 μmol/L89.802.272.5 μmol/L93.093.7421L-亮氨酸0.5 μmol/L92.075.751.0 μmol/L97.261.282.5 μmol/L91.862.6722L-酪氨酸0.5 μmol/L84.943.541.0 μmol/L84.410.872.5 μmol/L88.086.4123L-苯丙氨酸0.5 μmol/L105.393.331.0 μmol/L103.322.922.5 μmol/L95.362.3724L-组氨酸0.5 μmol/L91.590.641.0 μmol/L97.063.742.5 μmol/L106.090.6325L-赖氨酸0.5 μmol/L80.773.801.0 μmol/L87.892.412.5 μmol/L81.102.7926L-精氨酸0.5 μmol/L96.188.221.0 μmol/L101.485.012.5 μmol/L93.712.5027L-茶氨酸0.5 μmol/L95.183.051.0 μmol/L106.80.592.5 μmol/L89.042.6428γ-氨基丁酸0.5 μmol/L88.345.931.0 μmol/L100.562.592.5 μmol/L100.401.2429L-色氨酸0.5 μmol/L96.454.591.0 μmol/L96.481.622.5 μmol/L91.911.86
2.5 样品检测及品质评价
对市售的4个红茶(S1～S4)和3个绿茶(S5～S7)中的29种儿茶素、氨基酸和生物碱运用该方法进行检测,含量测定结果如表4所示。
表4 样品检测结果 单位:mg/g
Table 4 Analytical results of samples
序号化合物S1S2S3S4S5S6S71儿茶素0.280.250.400.453.822.341.842表儿茶素0.470.460.721.327.076.729.903EGC1.040.791.661.7510.838.4133.054EGCG23.3215.4535.8822.66211.28199.23173.215ECG13.6811.3718.2320.8288.8878.0746.66
续表5
注:“—”表示为检测出该物质含量。
序号化合物S1S2S3S4S5S6S76没食子酸3.243.263.593.001.221.220.757茶碱0.020.040.020.020.020.020.028可可碱1.271.301.451.004.594.221.219咖啡碱68.0868.8575.8262.0462.6064.9251.2610L-天冬氨酸1.221.201.221.723.182.863.3411L-苏氨酸0.760.700.910.430.900.800.6912L-丝氨酸1.541.451.831.130.820.831.3213L-谷氨酸1.801.592.781.561.403.822.3214L-脯氨酸0.680.810.940.700.550.430.4915甘氨酸0.290.480.070.180.100.160.2516L-丙氨酸1.801.592.781.561.403.822.3217L-胱氨酸———————18L-缬氨酸0.820.851.100.740.560.710.5919L-甲硫氨酸———————20L-异亮氨酸0.610.610.790.410.460.380.4121L-亮氨酸0.660.670.910.530.500.500.4822L-酪氨酸0.390.470.490.590.330.340.3723L-苯丙氨酸0.810.931.101.041.320.870.9124L-组氨酸0.150.100.240.120.240.220.1625L-赖氨酸0.640.570.890.530.560.520.5126L-精氨酸1.031.012.180.691.001.091.4327L-茶氨酸3.905.984.288.069.2510.7113.8028γ-氨基丁酸0.650.540.840.440.120.260.2229L-色氨酸0.370.440.430.590.470.450.50综合得分4.934.5811.34-0.33-7.69-6.98-5.85
以29种特征成分为因子进行主成分分析,结果见表5和表6。结果显示,共提取到5个主成分(PC1～PC5),其方差贡献率分别为51.36%、22.23%、9.75%、7.81%、6.24%,累计方差贡献率达97.39%,表明这5个主成分包含了原始数据的主要信息。
表5 总方差解释表
Table 5 Total variance explained
主成分特征值方差贡献率/%累计方差贡献率/%113.8751.3651.3626.0022.2373.5832.119.7583.3441.697.8191.1550.716.2497.39
表6 特征成分得分矩阵
Table 6 Component score coefficient matrix
序号化合物成分123451儿茶素-0.880 0.329-0.288-0.141 0.0952表儿茶素-0.9270.1360.2100.1570.2253EGC-0.693-0.0360.3900.3470.4954EGCG-0.9330.3420.038-0.0490.0515ECG-0.890.369-0.182-0.141-0.1096没食子酸0.972-0.084-0.166-0.04-0.1287茶碱0.408-0.5740.226-0.3830.1178可可碱-0.6730.479-0.288-0.389-0.2589咖啡碱0.7650.465-0.183-0.28-0.2710L-天冬氨酸-0.9730.1130.0440.1330.13411L-苏氨酸-0.0610.8820.008-0.3730.27712L-丝氨酸0.8460.1360.2830.1940.37613L-谷氨酸-0.180.5570.6220.118-0.49214L-脯氨酸0.9330.097-0.2180.1250.1415甘氨酸0.263-0.6580.369-0.5110.22516L-丙氨酸-0.180.5570.6220.118-0.49217L-缬氨酸0.9030.3540.1290.100-0.1418L-异亮氨酸0.8460.444-0.027-0.0780.27919L-亮氨酸0.870.4640.030.0720.10420L-酪氨酸0.655-0.417-0.2310.502-0.25621L-苯丙氨酸-0.2070.330-0.8410.1810.21722L-组氨酸-0.3140.923-0.1970.078-0.06323L-赖氨酸0.7050.66-0.0620.2160.12424L-精氨酸0.3340.7390.2810.3740.31625L-茶氨酸-0.884-0.1580.260.2980.07826γ-氨基丁酸0.9650.1920.120.072-0.04427L-色氨酸-0.295-0.499-0.3220.671-0.237
结合特征成分得分矩阵可得5个主成分的回归方程,其中PC1～PC5分别用Y1～Y5表示,如下所示:
Y1=-0.880X1-0.927X2-0.693X3-0.933X4-0.890X5-0.972X6+0.408X7-0.673X8+0.765X9-0.973X10-0.061X11+0.846X12-0.18X13+0.933X14+0.263X15-0.18X16+0.903X17+0.846X18+0.87X19+0.655X20-0.207X21-0.314X22+0.705X23+0.334X24-0.884X25+0.965X26-0.295X27
Y2=0.329X1+0.136X2-0.036X3+0.342X4+0.369X5-0.084X6-0.574X7+0.479X8+0.465X9+0.113X10+0.882X11+0.136X12+0.557X13+0.097X14-0.658X15+0.557X16+0.354X17+0.444X18+0.464X19-0.417X20+0.33X21+0.923X22+0.66X23+0.739X24-0.158X25+0.192X26-0.499X27
Y3=-0.288X1+0.210X2+0.390X3+0.038X4-0.182X5-0.166X6+0.226X7-0.288X8-0.183X9+0.044X10+0.008X11+0.283X12+0.622X13-0.218X14+0.369X15+0.622X16+0.129X17-0.027X18+0.03X19-0.231X20-0.841X21-0.197X22-0.062X23+0.281X24+0.26X25+0.12X26-0.322X27
Y4=-0.141X1+0.157X2+0.347X3-0.049X4-0.141X5-0.04X6-0.383X7-0.389X8-0.28X9+0.133X10-0.373X11+0.194X12+0.118X13+0.125X14-0.511X15+0.118X16+0.100X17-0.078X18+0.072X19+0.5021X20+0.181X21+0.078X22+0.216X23+0.374X24+0.298X25+0.072X26+0.671X27
Y5=0.095X1+0.225X2+0.495X3+0.051X4-0.109X5-0.128X6+0.117X7-0.258X8-0.27X9+0.134X10+0.277X11+0.376X12-0.492X13+0.14X14+0.225X15-0.492X16-0.14X17+0.279X18+104X19-0.256X20+0.217X21-0.063X22+0.124X23+0.316X24+0.078X25-0.044X26-0.237X27
以各主成分对应的方差贡献率为权重,得到茶叶品质模型表达式:
Y=0.541Y1+0.222Y2+0.098Y3+0.078Y4+0.062Y5
根据该模型计算出茶叶样品综合评价得分排序,红茶样品S1～S4为:S3>S1>S2>S4,绿茶样品S5～S7为:S7>S6>S5。
3 结论与讨论
本研究建立了一种前处理简单、能够同时高效提取茶叶中多种化学成分的方法,通过50%甲醇-0.1%甲酸作为提取溶剂,同时满足儿茶素、氨基酸和生物碱3类物质的提取。同时,针对3类物质极性跨度大,氨基酸亲水性强、儿茶素中等极性、生物碱疏水性强的问题,选用Hypersil GOLD色谱柱(150 mm×2.1 mm,1.9 μm),峰形优异、分离效率高,仅需16 min即可完成6种儿茶素、3种生物碱和20种氨基酸的同时测定;并且标准曲线在相应线性范围内相关性良好(R2>0.990 0),检出限和定量限较低。对实际样品进行主成分分析,提取的5个主成分累计方差贡献率达97.39%,能够充分代表原始29种成分的信息。基于特征向量构建的茶叶品质综合评价模型,为茶叶品质的客观评价提供了可靠依据。
[1] 曾鸿哲, 文帅, 方雯雯, 等. 茶叶活性成分健康功能研究新进展[J]. 中国茶叶, 2025, 47(2):1-13.Zeng H Z, Wen S, Fang W W, et al. Research progress on the health functions of tea active ingredients[J]. China Tea, 2025, 47(2):1-13.
[2] 刘静, 李丽, 孙玉香, 等. 茶叶中主要化学成分的质谱分析[J]. 福建茶叶, 2020, 42(6):8-9.Liu J, Li L, Sun Y X, et al. Mass spectrometry analysis of main chemical components in tea[J]. Tea in Fujian, 2020, 42(6):8-9.
[3] 彭凯雄, 郑钰涵, 徐天泽, 等. 茶叶活性成分的功能及其健康食品研究进展[J]. 粮食与油脂, 2023, 36(3):17-20.Peng K X, Zheng Y H, Xu T Z, et al. Research progress on the function and healthy food of tea active components[J]. Cereals &Oils, 2023, 36(3):17-20.
[4] Luo Q X, Luo L B, Zhao J M, et al. Biological potential and mechanisms of tea’s bioactive compounds: An Updated review[J]. Journal of Advanced Research, 2024, 65:345-363.
[5] Winiarska-Mieczan A, Tomaszewska E, Jachimowicz K. Antioxidant, anti-inflammatory, and immunomodulatory properties of tea-the positive impact of tea consumption on patients with autoimmune diabetes[J]. Nutrients, 2021, 13(11):3972.
[6] Wu Z Y, Sun L L, Chen R H, et al. Chinese tea alleviates CCl4-induced liver injury through the NF-κB or Nrf2 signaling pathway in C57BL-6J mice[J]. Nutrients, 2022, 14(5):972.
[7] 孙雨宁, 刘倩芬, 刘丹, 等. 茶叶缓解结肠炎及其机制研究进展[J]. 食品科学, 2025, 46(18):425-439.Sun Y N, Liu Q F, Liu D, et al. Progress in understanding the role and mechanism of action of tea in alleviating colitis[J]. Food Science, 2025, 46(18):425-439.
[8] Xu X Y, Zhao C N, Cao S Y, et al. Effects and mechanisms of tea for the prevention and management of cancers: An updated review[J]. Critical Reviews in Food Science and Nutrition, 2020, 60(10):1693-1705.
[9] 赵东贤. 黄山毛峰茶多酚提取工艺优化及体外抗菌活性研究[J]. 吉林农业科技学院学报, 2024, 33(6):1-4; 9.Zhao D X. Optimization of extraction process and in vitro antimicrobial activity of Huangshan Maofeng tea polyphenols[J]. Journal of Jilin Agricultural Science and Technology College, 2024, 33(6):1-4; 9.
[10] 黄逢阳, 李浩, 冯玮, 等. 黑茶的抗肥胖功效及其作用机制研究进展[J]. 食品安全质量检测学报, 2024, 15(4):242-249.Huang F Y, Li H, Feng W, et al. Research progress on the anti-obesity efficacy of dark tea and its mechanism of action[J]. Journal of Food Safety and Quality, 2024, 15(4):242-249.
[11] 刘昕, 吴建铭. 高效液相色谱法同时检测茶叶提取物中9种儿茶素类和3种生物碱类化合物[J]. 香料香精化妆品, 2024(1):114-118.Liu X, Wu J M. Simultaneous determination of nine catechins and three alkaloids in tea extracts by HPLC[J]. Flavour Fragrance Cosmetics, 2024(1):114-118.
[12] 李倩, 邵金良, 尹本林, 等. 不同加工方式的云南大叶种茶生物活性成分差异分析[J]. 食品工业科技, 2025, 46(18):37-46.Li Q, Shao J L, Yin B L, et al. Difference analysis of bioactive components of Yunnan large-leaf tea by different processing technologies[J]. Science and Technology of Food Industry, 2025, 46(18):37-46.
[13] 李胜楠, 赵轩, 陈婷婷. HPLC法测湖北产地多种茶叶的茶水中咖啡因的含量[J]. 广州化工, 2024, 52(3):83-85.Li S N, Zhao X, Chen T T. Detemination of caffeine cconcentration in tea from Hubei Province by HPLC[J]. Guangzhou Chemical Industry, 2024, 52(3):83-85.
[14] 张媛婷, 罗静, 闫鹏, 等. 基于指纹图谱和化学计量学的茶叶种类鉴别和质量评价[J]. 扬州大学学报(农业与生命科学版), 2024, 45(1):106-113; 146.Zhang Y T, Luo J, Yan P, et al. Species identification and quality evaluation of tea based on HPLC fingerprint and stoichiometry[J]. Journal of Yangzhou University (Agricultural and Life Science Edition), 2024, 45(1):106-113; 146.
[15] 管梦迪, 郑亚茹, 杨柱林, 等. 甘油提取结合液相色谱-串联质谱法检测茶叶及副产物中7类化学成分[J]. 食品科学, 2024, 45(6):153-163.Guan M D, Zheng Y R, Yang Z L, et al. Glycerin extraction combined with high performance liquid chromatography-tandem mass spectromet[J]. Food Science, 2024, 45(6):153-163.
[16] 刘培琴, 胡超琼, 邹燕, 等. HPLC-MS/MS法测定茶叶中儿茶素类、茶黄素类物质[J]. 中国测试, 2024, 50(7):63-69.Liu P Q, Hu C Q, Zou Y, et al. Determination of catechins and theaflavins in tea by HPLC-MS/MS[J]. China Measurement &Testing Technology, 2024, 50(7):63-69.
[17] 杜颖颖, 刘相真, 叶美君, 等. 超高效液相色谱-串联质谱法测定茶叶中游离氨基酸成分[J]. 色谱, 2019, 37(6):597-604.Du Y Y, Liu X Z, Ye M J, et al. Detection of free amino acids in tea using ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry[J]. Chinese Journal of Chromatography, 2019, 37(6):597-604.
[18] 卢叶, 张季, 陈艳, 等. 一种使用UPLC-MS/MS同时分析茶叶中多类非挥发性化合物的分析方法及其应用: CN119438469A [P]. 2025-02-14.Lu Y, Zhang J, Chen Y, et al. An analytical method for simultaneous analysis of multiple non-volatile compounds in tea using UPLC-MS/MS and its application: CN119438469A [P]. 2025-02-14.
[19] Xiao Y, He C, Chen Y L, et al. UPLC-QQQ-MS/MS-based widely targeted metabolomic analysis reveals the effect of solid-state fermentation with Eurotium cristatum on the dynamic changes in the metabolite profile of dark tea[J]. Food Chemistry, 2022, 378:131999.
[20] 刘先军, 冯家力, 曾栋, 等. 超高效液相色谱-串联质谱法测定蜂蜜中18种生物碱及风险评估[J]. 分析测试学报, 2023, 42(11):1517-1523.Liu X J, Feng J L, Zeng D, et al. Risk assessment and determination of 18 alkaloids in honey by ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry[J]. Journal of Instrumental Analysis, 2023, 42(11):1517-1523.
[21] 王强, 汪晨霞, 江蓝蓝, 等. 固相萃取-超高效液相色谱串联质谱法同时测定保健品中5种生物碱[J]. 中国酿造, 2019, 38(6):185-190.Wang Q, Wang C X, Jiang L L, et al. Simultaneous determination of five alkaloids in health products by SPME-UPLC-MS/MS[J]. China Brewing, 2019, 38(6):185-190.
[22] 张楠, 王雪, 王珂雯, 等. 基于不同提取溶剂和色谱分离模式的芒果浆代谢组学研究[J]. 食品工业科技, 2025, 46(12):10-19.Zhang N, Wang X, Wang K W, et al. Comparative study of different extraction solvents and liquid chromatography separation modes on metabolomics analysis of mango pulp[J]. Science and Technology of Food Industry, 2025, 46(12):10-19.