白酒是我国独有的蒸馏酒,具有悠久的酿造历史和独特的风味特征。根据发酵方式的不同,白酒酿造可分为固态、液态和半固态发酵3种模式[1]。其中,半固态发酵是指在同一发酵体系中既存在固态物质又存在液态物质,其工艺形式主要包括“先固态培菌糖化后加水液态发酵”和“加水边糖化边发酵”2种方式[2-3]。半固态发酵工艺流程简洁,发酵体系相对封闭,通常为一轮次发酵,不仅有助于缩短周期、提高过程可控性,也为深入开展发酵机理解析与工艺参数研究创造了有利条件。
料水比(原料干重与加水量之比)是影响白酒品质的关键工艺参数,其变化直接决定发酵体系的传质与传热效率[4],通过调节体系中营养物质的溶解扩散、氧气供应及散热过程,料水比可显著影响微生物代谢活性及发酵环境的理化特性[5-6]。当水量过低时,体系黏度升高、传质效率受限,微生物的生长和代谢受到抑制,易出现发酵不充分、出酒率偏低的问题;相反,水量过多会降低可发酵糖的有效水平,不利于产酒精过程,并且会稀释酒精及风味前体物质的浓度。已有研究表明,不同料水比条件对发酵食品等的产量与品质均具有显著影响。Wang等[7]研究不同初始含水率(50%～70%)对小曲酒发酵的影响,结果表明,当含水率提升至70%时,总挥发性风味物质含量显著增加,乙酸乙酯/乳酸乙酯比例升高,且与含水量呈显著正相关(R2=0.94)。在苦荞小曲酒、黄酒及地方特色酒的工艺优化研究中,适宜的料水比被普遍认为是提升发酵效率和产品品质的关键因素。曹新志等[8]在优化苦荞小曲酒工艺时发现,料水比为1.0∶1.5(g∶mL)时,能够显著提升出酒率和整体感官表现;黄河等[9]同样发现,将黄酒料水比控制在1∶1.4(g∶mL)时,能显著改善酒体特性,使产品色泽清亮、口感协调;Wu等[10]通过响应面优化山兰米酒发酵条件,确定最优含水量为原料干重的119%,此时所得酒体光泽度和风味表现最佳。此外,侯亚丽等[11]在混菌固态发酵玉米皮体系中发现,50%的料水比最为适宜,发酵产物质地均匀松散、香气更浓郁。综上所述,合理调控料水比对发酵体系的高效代谢、乙醇生成及风味品质形成具有重要意义,但现有研究多集中于料水比对白酒终点宏观评价指标(出酒率、总酸、总酯等)的影响,尚缺乏料水比对发酵过程关键发酵参数动力学的影响机制研究;同时对于料水比如何通过影响物质传递、热量扩散和微生物活性等调控发酵进程的机制认识仍不充分;此外,在半固态条件下,“料水比-发酵动力学-风味形成”之间的内在关联尚未被系统阐明。
针对上述问题,本研究以大米为原料,采用“先固态培菌糖化后加水液态发酵”的半固态发酵工艺,设置4个料水比水平(2∶1、2∶2、2∶3、2∶4,g∶mL),监测发酵过程参数(温度、pH)、底物[还原糖、总可溶性固形物(total soluble solids, TSS)]和主要代谢产物(乙醇以及其他醇类、酯类等风味成分)的变化规律并结合统计学分析,系统探索料水比对白酒半固态发酵动力学规律及品质形成的影响,以期为该类白酒生产的工艺优化与质量控制提供理论依据与技术支撑。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
崇明大米,新农垦上海农业发展有限公司;安琪小曲、高活性酿酒干酵母,安琪酵母股份有限公司产品;糖化酶,上海源叶生物科技有限公司。
DNS显色剂,Codow氪道广州和为医药科技有限公司;正丁醇(≥99.6%,色谱纯)、无水乙醇(≥99.6%,色谱纯),北京迈瑞达科技有限公司;3-辛醇标准品(≥99.6%,色谱纯),美国Sigma Aldrich公司;葡萄糖标准溶液,北方伟业计量集团有限公司;NaCl(分析纯),福晨天津化学试剂有限公司。
1.2 仪器与设备
500 mL玻璃发酵罐,Scybe喜碧济南台有玻璃制品有限公司;FA-E/EN电子天平,幸运电子设备有限公司;手持折光仪,杭州陆恒生物科技有限公司;雷磁PHS-3E型pH计,上海仪电科学仪器股份有限公司;电热恒温培养箱,上海一恒科学仪器有限公司;High-Speed Centrifuge CR22 N-高速离心机,德国Eppendorf公司;AR212高精度插入式测温仪,希玛仪表有限公司;GC 7890-5975 MSD气相色谱-质谱联用仪,美国安捷伦公司;DB-FFAP毛细管柱(60 m×250 μm×0.25 μm)、50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取针,美国Supelco公司;SpectraMax多功能酶标仪M2,美谷分子仪器上海有限公司。
1.3 实验方法
1.3.1 半固态法白酒发酵工艺流程
首先,准确称取颗粒饱满、均匀的大米150 g,去除杂质后进行粉碎,粉碎度控制为通过20目筛的细粉占原料质量的50%,按原料与热水1∶1.5(g∶mL)的比例润粮2 h,使其充分吸水;其次,将吸水后的原料置于蒸锅中蒸煮糊化0.5 h,取出后摊晾至约60 ℃时加入0.1%(以原料干重计,下同)的糖化酶并混匀,继续摊晾至30 ℃。然后,按原料干重分别加入1.2%的商品小曲和0.1%的酿酒高活性干酵母(糖化酶与干酵母均需提前活化),充分拌匀后于30 ℃恒温条件下静置培菌糖化24 h;最后,将糖化后的原料,转移至500 mL发酵罐中,同时取少量置于50 mL离心管中,并按设定料水比(2∶1、2∶2、2∶3、2∶4,g∶mL)加入无菌水混合均匀,密封后置于30 ℃条件下进行发酵,发酵时间为8 d,发酵结束后采用蒸馏方式取酒,掐头去尾,收集纯净酒液至50 mL时停止接酒。各组实验均设置3次平行,发酵流程及分析方法见图1。
图1 半固态发酵工艺流程及分析方法
Fig.1 Semi-solid fermentation process and analysis
1.3.2 样品采集
取糖化开始前的样品于离心管中,记为第0天样品;取开始发酵前的离心管样品,记为第1天样品,然后分别在发酵第2、3、5、7、9天终止离心管样品发酵,分别记为第2、3、5、7、9天样品。d0、d1、d2、d3、d5、d7、d9分别代表第0、1、2、3、5、7、9天。为了消除不同料水比的稀释因子对实验结果造成影响,在终止发酵的每管样品中加入无菌水统一定量至20 mL,涡旋均质10 min,然后4 ℃、10 000 r/min离心10 min后取上清液,立即贮存于4 ℃冰箱,用于乙醇含量、还原糖含量、pH及TSS等指标测定。发酵罐中样品发酵结束后过滤蒸馏取酒,掐头去尾,收集纯净酒液至50 mL时停止接酒,立即转移至4 ℃条件下贮存,用于后续分析。
1.3.3 理化指标测定
1.3.3.1 温度
采用高精度插入式测温仪在发酵过程中测定温度,示数恒定时记录其数值,记为该时间点的发酵温度,单位为℃。
1.3.3.2 pH的测定
取5 mL 1.3.2节中制备的上清液,置于10 mL试管中,采用pH计插入液体中测定pH值,待示数稳定后读取数值,记为该发酵时间点的pH值。
1.3.3.3 TSS、还原糖含量、乙醇含量的测定
TSS的测定采用手持折光计直接读数,记为该发酵时间点的TSS,单位为°Bx。
还原糖含量的测定:取上清液1 mL于试管中,用超纯水稀释10倍,采用DNS法测吸光度,通过标准曲线计算还原糖含量。
乙醇含量的测定:参考陈金明等[12]的方法并进行改良,使用气相色谱-火焰离子检测器(gas chromatograph with flame ionization detector,GC-FID)测量乙醇含量,使用正丁醇将无水乙醇稀释成不同浓度梯度标准溶液。色谱条件:色谱柱AgilentDB-wax(30 m×0.25 mm×25 μm)FID检测器220 ℃;H2流速40 mL/min;空气流速400 mL/min;尾吹N2流速30 mL/min;分流进样:分流比20∶1,进样量1 μL;升温程序:50 ℃保持4 min,以10 ℃/min上升至90 ℃,保持1 min。
1.3.4 白酒挥发性风味成分的检测方法
采用顶空固相微萃取联合气质联用技术(headspace solid-phase microextraction coupled with gas chromatography-mass spectrometry,HS-SPME-GC-MS)对不同料水比组白酒样品进行挥发性风味物质检测,每个白酒样品均平行检测3次。
1.3.4.1 SPME条件
取1 mL蒸馏酒样,加入超纯水4 mL,加入2 g NaCl,置于20 mL样品瓶中,采用萃取针(50/30um DVB/CAR/PDMS)于50 ℃萃取30 min后置于气相色谱进样口,250 ℃解析2 min。
1.3.4.2 GC-MS条件
色谱柱:DB-FFAP毛细管柱(60 m×250 μm×0.25 μm);不分流模式,He流速1.88 mL/min,升温程序:起始温度40 ℃,以2 ℃/min升到100 ℃,再以4 ℃/min升到200 ℃保持3 min;采集模式:全扫描,扫描范围:35～450 m/z;离子源230 ℃,MS四极杆150 ℃。
1.3.4.3 定性定量分析
化合物通过NIST2020库检索对比鉴定,正反匹配度>80%的鉴定结果予以确认;通过相同条件下检测出来的正构烷烃C7～C40的保留时间计算相应物质的保留指数,对文献报道中差值<50的化合物予以定性。
半定量分析:选择3-辛醇为内标(1 mg/L),采用面积归一化法对各挥发性风味成分进行半定量分析[13]。
1.4 数据统计与分析
实验数据均以平行3次试验结果的平均值表示。使用Excel 2021和SPSS 21进行数据处理,采用 Origin 2022 软件进行可视化绘图。
2 结果与分析
2.1 料水比对半固态法白酒发酵过程参数的影响
2.1.1 温度
温度是影响食品发酵体系品质形成的关键因素[14]。本研究发现不同料水比组的发酵温度及其变化速率均存在显著差异(P<0.05),整个发酵周期内各组的温度变化趋势大体一致(图2-a),但变化速率存在明显差异(图2-b)。例如,在有氧糖化阶段与发酵前期(d0～d3),各组体系温度迅速上升并达到峰值,表明此阶段微生物代谢旺盛并伴随强烈产热作用;随着可利用底物减少和部分微生物受乙醇抑制,产热速率减弱,各组体系温度下降并在均d5达到最低点。在发酵后期(d7～d9),温度出现小幅回升后温度趋于稳定。
a-温度变化;b-温度变化速率
图2 不同料水比体系发酵过程中温度的动态变化
Fig.2 Dynamic changes of temperature during fermentation under different material-to-water ratios (MWRs)
纵向比较同一时间点的不同料水比组温度(图2-a),可见料水比越低,体系温度整体越低、波动幅度越小的趋势。变异系数分析进一步验证了该趋势:高料水比(2∶1)组的温度波动最大,而低料水比(2∶4)组最稳定,呈现出料水比降低—温度稳定性增强的规律。进一步比较不同阶段的温度变化速率发现,在发酵前期(d1～d3),2∶1组的升温速率较2∶4组提高约1.35倍,说明高料水比体系热量积聚更快、放热效应更明显。这是由于较高料水比下物料堆积密度较高、散热受限,使代谢产热更易积聚;而低料水比体系含水量大、比热容高,可吸收和缓冲部分热量,因而温度上升较缓。Altwasser等[15]的研究也得出类似结论,其研究发现固态发酵体系由于含水量较低,热容量与热导率均低于液态体系,在相同代谢热条件下更易产生热量积聚和温度升高。同时,低料水比条件下基质浓度相对稀释,微生物代谢速率和产热强度受到一定限制,进一步抑制了温度的上升。由此说明,料水比不仅通过改变物理特性影响体系的热平衡,同时也间接调节了微生物的产热活性。
2.1.2 pH
pH值是反映发酵体系酸性环境变化的重要指标,通常可指示有机酸的积累程度与发酵进程。本研究发现,各发酵组在整个发酵周期内pH值均呈现出先下降后回升的变化规律,于d3下降至最低点(图3)。这主要源于酵母及乳酸菌等微生物快速代谢糖类并积累乳酸、乙酸等有机酸,从而显著降低了pH值[16]。进入发酵中后期(d5～d9),各组pH值出现小幅度回升。已有研究表明,发酵中后期随着乙醇含量升高,部分酸性物质会与乙醇发生酯化反应,同时蛋白质降解释放的氨类物质亦可中和部分酸性物质[17];此外,当乙醇含量达到峰值阶段时,产酸菌可能因自溶或营养限制,产酸活性降低,使得体系pH值出现轻微回升[18]。
a-pH变化;b-pH变化速率;c-d3时pH与水占比线性回归分析
图3 不同料水比体系发酵过程中pH的动态变化
Fig.3 Dynamic changes of pH during fermentation under different MWRs
进一步分析发现:料水比显著影响了发酵体系的酸化程度。例如,随着料水比变低,体系pH值呈持续下降趋势。在发酵第3天,pH值与体系含水量的占比呈极显著负相关(y=-1.09x+3.76,R2=0.999 9)。结果表明,在本实验设定的料水比范围内(2∶1～2∶4,g∶mL),水分每增加10%,pH值平均下降约0.11,即料水比越低,体系酸化程度越高。造成这一现象的原因可能包括以下几个方面:首先,较高的含水量为乳酸菌、醋酸菌等产酸菌的生长和代谢提供了有利环境[19-20],促进有机酸(如乳酸、乙酸)的累积,从而增强了体系酸化效应。此外,较低料水比条件下,体系含水量增加、物料浓度相对较低而体系缓冲能力减弱,氨基化合物对酸度的中和作用不足,使得pH更易受到产酸过程的影响而降低。类似地,Peng等[18]在米酒发酵研究中也指出,体系水分含量的增加会削弱物料的缓冲效应,从而加快酸化进程。综上所述,料水比通过调节微生物代谢活性与体系的缓冲性能来调控发酵过程中pH的动态变化。
2.2 料水比对半固态法白酒发酵过程中底物与代谢物代谢的影响
2.2.1 TSS、还原糖含量、乙醇含量
在发酵动力学研究中,TSS、还原糖和乙醇含量及其变化速率是反映发酵进程的关键指标。TSS主要反映了体系中可溶性底物(主要为可溶性糖)的总体水平,还原糖则更具体地代表可被酵母直接代谢的糖类,其消耗过程直接揭示了发酵底物转化的速率与程度;乙醇是发酵的主要产物,其累积动态不仅反映底物转化效率,也能作为划分发酵阶段和评价发酵充分性的依据。因此,这3项指标的协同变化能够从底物消耗、产物生成和体系整体物质变化3个维度全面揭示发酵动力学特征。本研究发现各发酵组内TSS整体呈持续下降趋势,说明体系中可溶性底物不断被微生物消耗(图4-a);还原糖含量在糖化阶段(d0～d1)迅速升高至峰值371.81 mg/g,进入发酵阶段后开始快速下降,于d5后趋于稳定,表明底物基本消耗完全(图4-c);乙醇含量持续累积,各组均在d5进入平台期,与还原糖消耗呈明显负相关(图4-e)。
a-TSS变化;b-TSS变化速率;c-还原糖含量变化;d-还原糖含量变化速率;e-乙醇含量变化;f-乙醇含量变化速率
图4 不同料水比体系发酵过程中底物与代谢物代谢的动态变化
Fig.4 Dynamic changes of substrate and metabolite during fermentation under different MWRs
与此同时,本研究发现料水比显著影响体系发酵进程,根据底物消耗速率(图4-b、图4-d)和产物生成速率(图4-f)可以发现,料水比越低,发酵进程越快。根据TSS和还原糖的下降速率来反映底物的消耗情况,可以看出各组在发酵初期(d1～d2)速率有明显差异,2∶2、2∶3与2∶4组的还原糖消耗速率分别为290.53、284.07、320.77 mg/(g·d),均远高于2∶1组的94.97 mg/(g·d),表明在高含水条件下,底物利用更为迅速,糖化与发酵过程启动更早;在发酵中期(d2～d5),2∶2、2∶3与2∶4组的消耗速率明显放缓,平均每天消耗速率仅为 25.53、27.34、14.61 mg/(g·d),而2∶1组仍保持较高速率89.87 mg/(g·d)。这一趋势说明低料水比组的底物在早期已被充分转化,随后进入相对稳定阶段,而高料水比组的还原糖消耗滞后,主发酵阶段延迟。d1～d5是乙醇的快速积累阶段,2∶2、2∶3、2∶4组均于d5接近发酵终点,并达到本实验体系乙醇含量的最大生成水平(约150 mg/g);而2∶1组的乙醇含量仅为119.98 mg/g,且在d7达到最大值137.44 mg/g后持平。由此可发现低料水比组进入乙醇累积阶段的时间较早,乙醇含量上升迅速,且发酵终点乙醇含量产率较2∶1组提升13.19%。整体上,低料水比在底物消耗和产物生成方面均表现出更高的速率和效率。料水比越低,发酵速率越快,主要是由于水分充足改善了发酵体系的多方面条件:首先,较低的料水比会显著增加发酵体系的含水量,从而促进淀粉颗粒的吸水和膨胀,当淀粉处于膨胀状态时,其内部的分子链结构部分暴露,使淀粉酶更容易与底物结合并发挥催化作用,进而加速淀粉的水解过程[21]。Gabelle等[22]指出,当固形物含量高而含水量低时,体系黏度上升导致传质系数下降,传质和扩散会受限,从而降低了微生物对底物的利用率;其次,水分较多提高了体系的比热容和散热能力,避免局部温度过高造成微生物或酶失活[15]。此外,充足水分对代谢产物如有机酸和乙醇含量具有稀释作用,减弱了对微生物的抑制效应。
2.3 料水比对半固态法白酒风味物质代谢的影响
本研究采用HS-SPME-GC-MS技术对不同料水比半固态发酵白酒样品进行挥发性风味物质检测(图5-a),每个白酒样品均平行检测3次,共鉴定了22种挥发性风味物质,主要涵盖7种醇类、13种酯类与2种醛类。比较发现,不同料水比发酵组的风味代谢物质呈现显著差异。随料水比降低,挥发性成分总量呈上升趋势,2∶4组(734.14 mg/L)是2∶1组(367.66 mg/L)的约2倍。其中酯类和醇类物质的积累最为显著,表明适量水分有助于发酵体系内香气物质的生成。
a-挥发性化合物相对含量热图;b-PCA得分图;c-PCA载荷图;d-各类挥发性风味物质含量与水占比线性回归关系
图5 不同料水比发酵白酒中挥发性风味物质分析
Fig.5 Analysis of volatile flavor compounds in Baijiu under different MWRs
注:*P≤0.05; **P≤0.01; ***P≤0.001。
大部分醇类物质的相对含量随料水比降低呈显著上升趋势。其中,异戊醇为主要的高级醇,随着料水比的降低,其含量由203.79 mg/L上升至466.67 mg/L(P<0.01),增长约1.29倍;异丁醇由35.02 mg/L增至90.95 mg/L(P<0.01),增长约1.6倍。苯乙醇在2∶1组含量最高(61.77 mg/L),随着加水量的增多后略有下降,推测其来源于酵母代谢的氨基酸脱羧反应过程,在高含水体系中可能被进一步酯化为乙酸苯乙酯,从而导致游离态醇含量下降。酯类化合物是白酒香气的重要贡献组分,其含量的变化能够显著影响发酵体系的整体风味特征。其中,乙酸乙酯、乙酸异戊酯、乙酸苯乙酯、辛酸乙酯和癸酸乙酯等为相对含量较高的代表性成分,赋予白酒果香与甜香特征[23]。乙酸乙酯和乙酸异戊酯的变化最为显著(P<0.001),前者从2∶1组的27.20 mg/L上升至2∶4组的58.29 mg/L,增幅约1.14倍;后者由2.95 mg/L增加至9.95 mg/L,增幅约2.4倍。乙酸苯乙酯亦显著上升(P<0.001),相对含量由6.20 mg/L增至13.42 mg/L,说明较高水分条件下乙酰转移反应和产酯菌代谢活性增强,有利于短链与芳香酯类的生成。部分中链酯(如己酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯)总体呈先升后降趋势,在料水比2∶3时达到峰值,随后略有下降。
为探究不同料水比对白酒发酵体系挥发性风味物质整体组成的影响,对各组样品的相对含量数据进行了主成分分析(principal component analysis,PCA)。结果显示,第一主成分(PC1)和第二主成分(PC2)的方差贡献率分别为45.5%、25.4%,累计解释率达70.9%(图5-b、图5-c),能够较好地反映样品间主要差异特征。各料水比发酵组样本在主成分空间中分布较为集中,组内聚类良好,但不同组之间的置信椭圆区域存在明显重叠,未表现出清晰的分离趋势。这表明料水比的变化对白酒发酵体系中挥发性香气物质的整体谱系结构影响有限,体系间总体风味特征相对接近。然而,从单体化合物分析结果来看,部分醇类及酯类物质在不同料水比间仍呈现出显著差异,说明料水比主要通过影响特定风味物质的代谢水平而非整体香气谱分布,从而导致发酵香气特征的细微差别。
为评估料水比对不同类别挥发性风味物质生成的影响程度,采用水分在总发酵体系中的占比为自变量(x),风味物质相对含量为因变量(y)进行线性回归分析,结果见图5-d。总体上,总挥发性风味物质的含量与水占比之间呈极显著正相关(y=1 134.98x1-1.31,R2=0.979 6),说明料水比是影响体系风味形成的关键因子。其中,各类挥发性组分的含量均随水占比升高而呈线性增加趋势,拟合度(R2)均超过0.90,表明料水比对风味代谢具有显著的线性调控作用。醇类物质相关性最高(R2=0.985 9),表明低料水比环境下酵母的生长与代谢更为旺盛,促进了高级醇的合成积累[24]。醛类物质表现出较强的线性关系(R2=0.969 6),推测其在发酵后期持续生成或转化较为稳定。酯类物质的线性拟合度略低(R2=0.907 4),但仍呈显著正相关,可能与酯化反应受前体醇类含量及酸酯化反应活性的共同调控有关,导致其积累过程存在一定波动。综上,料水比的降低在整体上促进了风味物质的生成,尤其对醇类与酯类的积累具有显著促进作用,这与发酵体系含水量变化引起的底物浓度、氧扩散及酵母代谢状态的综合调控密切相关。说明料水比是影响白酒发酵体系香气物质生成效率的重要调控参数。适量的酯类赋予酒体清雅的果香和平衡的复合香气,适当比例的高级醇有助于增强酒体的丰满度与后味持久性,但当白酒中的醛类物质和高级醇含量过高时,可能会影响饮用的舒适度[25]。
3 结论与讨论
本研究采用“先固态培菌糖化后加水液态发酵”的半固态法白酒发酵工艺,系统考察了不同料水比对白酒发酵动力学特征及挥发性风味物质的影响。动力学分析结果显示,料水比显著调控了发酵体系的温度、pH、底物消耗、主要产物及风味物质生成。高料水比体系因物料堆积密集、散热受限,温度易聚集且波动幅度大;低料水比体系含水充足、比热容大,温度更稳定。随料水比降低,体系酸化加快,pH下降更明显,这主要由于高含水环境促进产酸菌代谢,同时物料浓度较低,削弱了缓冲作用。在底物与产物方面,低料水比组底物消耗和乙醇生成速率更快,发酵进程提前,发酵效率显著提高,这归因于高含水体系能够降低物料黏度、改善传质和散热,有利于淀粉酶解与糖化,并减轻代谢产物对微生物的抑制作用。此外,挥发性风味物质分析显示,低料水比有利于醇类与酯类积累。在本研究的半固态发酵体系中,低料水比组(2∶4)的乙醇产量达到155.89 mg/g,总挥发性风味物质含量达到734.14 mg/L,均显著高于高料水比组(2∶1),形成了发酵充分、香气释放度高、果香与甜香相对突出的风格,在当前体系中可视为发酵强度表现最佳的条件。本研究明确了料水比在半固态发酵体系中对发酵环境、底物与产物转化的速率和程度、代谢路径及风味形成的协同调控作用,揭示了适度调节料水比有助于在缩短发酵时间的同时提高产物得率,与香气物质生成,为优化半固态白酒发酵工艺提供了系统性的理论支持与实践依据。
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