葡萄酒是全球历史最悠久且广泛消费的酒精饮料之一,由于酿造工艺和原料种类的差异,衍生出各种类型的葡萄酒。然而,葡萄酒在发酵和贮存过程中易受到酶促或非酶促反应的影响,导致酒体褐变、香气流失等负面现象,进而使得感官品质显著降低[1]。在酒精发酵前向葡萄酒中添加抗氧化剂,是保护葡萄酒品质和延长贮藏时间的方式之一,SO2是目前葡萄酒中最常见且经济的抗氧化剂,可与氧气反应形成硫酸盐和亚硫酸盐,保护葡萄酒中的酚类化合物和其他风味成分不被氧化,保持酒体的新鲜度和颜色稳定[2]。虽然合理剂量下的SO2是安全的,但仍然可能引起部分敏感人群的过敏反应,如头痛、气管痉挛、荨麻疹等症状。目前,食品抗氧化剂正朝着安全性更高、经济效益更佳的方向发展。各国酿酒业也积极寻找新对策,争取减少葡萄酒中SO2的使用量[3],于是寻求替代或减少SO2用量的新物质,已成为酿酒行业的研究热点。
还原型谷胱甘肽(glutathione,GSH)是广泛存在于生物体细胞中的天然巯基物质,具有显著的抗氧化作用。GSH表现出较强的还原性,原因是分子中的半胱氨酸残基含有较易氧化的巯基(—SH)。它能与乙醛发生化学反应,形成乙醛酸的加成物,抑制乙醛酸衍生物生成,阻碍聚合反应,抑制葡萄酒氧化[4]。研究表明,富含GSH的酵母制品能够改善发酵迟缓的现象,提高葡萄酒的抗氧化能力,增强其风味并减少SO2的使用量[5]。此外,富含GSH的酵母制品还能更好地保留葡萄酒中某些关键的酯类、萜烯类和硫醇类化合物,保持陈酿葡萄酒的香气多样性和新鲜度[6]。
葡多酚通常提取自葡萄皮、葡萄籽或葡萄渣等副产品中,来源天然且成分安全。它富含原花青素和白藜芦醇等成分,可以通过螯合金属离子来抑制羟自由基的生成[7],或者与超氧阴离子发生反应,阻止自由基链反应的发生,最终达到清除自由基的效果。高婷[8]的研究结果表明,纯化后的葡萄籽多酚在清除DPPH自由基方面表现出与同浓度维生素C相当的效果,半抑制浓度(half inhibitory concentration, IC50)值为5.86 μg/mL,自由基清除率高达94%。此外,相关研究也表明葡多酚还具有预防心脑血管疾病、消灭癌细胞、促进细胞增殖等作用[9-11]。将其融入葡萄酒酿造工艺中,可改善葡萄酒的保健功效。
羧甲基壳聚糖是通过接枝和交联等方法,对壳聚糖分子中的氨基和羟基进行化学修饰制得,属于壳聚糖的衍生物之一。引入羧甲基的过程有效破坏了壳聚糖原有的晶型结构,同时保留了其卓越的抗氧化性、吸附性以及安全性,并弥补了传统壳聚糖水溶性差等缺点[12]。由于羧甲基壳聚糖安全性、抗菌抗氧化性显著,目前其在食品中的研究大多集中于可食性复合保鲜膜方面[12-13]。CHAIWONG等[14]选用高分子质量(310～375 kDa)的壳聚糖为原料,合成羧甲基壳聚糖,其对ABTS阳离子自由基和DPPH自由基具有良好的清除作用,IC50值分别为1.37、1.70 mg/mL。壳聚糖作用于果酒中时,可捕获及中和酒体中的自由基,并与Fe2+、Fe3+、Cu2+等金属离子形成稳定的络合物实现抗氧化作用,壳聚糖兼具澄清果酒的功效,可增强酒体的稳定性,对果酒风味物质的影响程度较小[15]。
目前果酒行业正向于安全化、保健化方向发展,无硫或低硫果酒通常被视为品质和健康的象征。因此以天然抗氧化剂替代传统SO2具有广阔的发展前景,然而天然抗氧化剂对葡萄酒的抗氧化性能及对风味感官的影响方面鲜有提及。本研究以赤霞珠葡萄作为酿酒原料,选取GSH、葡多酚、羧甲基壳聚糖3种天然抗氧化剂,于葡萄酒酒精发酵前添加,并与传统添加剂SO2进行对比,探究天然抗氧化剂对赤霞珠葡萄酒抗氧化活性及风味的影响,促进其在葡萄酒酿造中的进一步研究与应用。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
赤霞珠葡萄,采摘自河北省昌黎县;RMS2酿酒干酵母,法国Laffort公司;葡萄多酚、GSH(食品级),浙江一诺生物科技有限公司;羧甲基壳聚糖(纯度≥98.0%),广州丰饶生物技术有限公司。
1.2 仪器与设备
UV2600A紫外-可见分光光度计,尤尼珂(上海)仪器有限公司;HH-4数显恒温水浴锅,常州荣华仪器制造有限公司;雷磁PHS-25台式pH计,上海仪电科学仪器股份有限公司;SMY-2000测色色差仪,北京盛名扬科技开发有限责任公司;PEN3电子鼻,德国AIRSENSE公司;1200-6410B高效液相色谱-三重四极杆质谱联用仪、Poroshell 120 EC-C18色谱柱(150 mm×2.1 mm, 2.7 μm),美国安捷伦科技有限公司;Supelco DVB/CAR/PDMS 萃取头(50/30 μm),美国安捷伦科技有限公司。
1.3 实验方法
1.3.1 葡萄酒酿造流程
新鲜赤霞珠葡萄采摘运输后进行人工粒选,后进行除梗破碎,投入发酵罐中,进行抗氧化剂处理。选用GSH(G)、葡多酚(P)和羧甲基壳聚糖(C)3种天然抗氧化剂,设置不同质量浓度梯度分别于酒精发酵前加入葡萄醪中:①添加谷胱甘肽10、20、30 mg/L(分别记为G10、G20、G30组);②添加葡多酚80、90、100 mg/L(分别记为P80、P90、P100组);③添加羧甲基壳聚糖100、200、300 mg/L(分别记为C100、C200、C300组);以不加任何抗氧化剂为空白处理(CK);以添加传统SO2为实验对照(S)70 mg/L。共11个处理,每个处理重复3次。
随后在葡萄醪中加入20 mg/L的果胶酶,静置室温(约16～24 ℃)酶解24 h。添加适量白砂糖,将糖度调至22 °Bx。取RMS2酿酒干酵母33 g、白砂糖15 g,溶解于300 mL 35～40 ℃的温水中,轻轻搅拌,待混合物表层浮现大量气泡时完成活化,每罐葡萄醪添加10 mL酵母接种物并混合均匀。打开发酵罐通气阀,于稳定环境及室温(约16～24 ℃)下进行发酵。每日测定比重,数值降低至0.992～0.996时,过滤灌装保持满瓶储存。
1.3.2 葡萄酒基础理化指标的测定
酒精度参照GB 5009.225—2023《食品安全国家标准 酒和食用酒精中乙醇浓度的测定》进行测定。pH值使用校准后的精密pH计对葡萄酒样品进行直接测定,可溶性固形物含量(以干浸出物表示)采用密度瓶法测定,总酸含量通过指示剂法进行测定,还原糖使用3,5-二硝基水杨酸比色法进行分析,葡萄糖标准溶液曲线为y=0.482 4x-0.001 9,y为吸光度,x为还原糖含量,决定系数 R2=0.995 7。
1.3.3 葡萄酒抗氧化能力的测定
通过测定贮藏过程中酒体 ABTS阳离子自由基清除率和 DPPH自由基的清除率,评估天然抗氧化剂添加对赤霞珠葡萄酒抗氧化能力的影响。
1.3.3.1 ABTS阳离子自由基清除率
参照范金波等[16]的方法,并稍加改进。制备ABTS母液,准备葡萄酒0.2 mL、ABTS稀释液3.0 mL,避光反应30 min,以蒸馏水为对照,测定其在734 nm处的吸光度值。按公式(1)计算:
ABTS阳离子自由基清除率
(1)
式中:At,加样品后的吸光度值;A0,未加样品的吸光度值。
1.3.3.2 DPPH 自由基清除率
参考牛鹏飞等[17]的方法,在517 nm处测定吸光度值Ai,每个样品做3个平行,按公式(2)计算清除率:
DPPH自由基清除率
(2)
式中:Aj,试剂空白组吸光度值;Ac,未加样品的吸光度值。
1.3.4 葡萄酒总酚含量测定
使用福林-肖卡比色法测定总酚含量[18]。没食子酸标准曲线结果为:y=0.001 4x-0.133 5,y为吸光度,x为没食子酸含量,决定系数R2=0.995。
1.3.5 葡萄酒总黄酮含量测定
采用硝酸铝显色法进行测定[19]。测定标准曲线结果为:y=0.004 1x+0.087 1,y为吸光度,x为芦丁含量,决定系数R2=0.985 8。
1.3.6 葡萄酒总花色苷含量测定
采用pH示差法测定[20]。取2.5 mL的葡萄酒,分别加入pH 1.0的HCl-KCl缓冲液和pH 4.5的HCl醋酸钠缓冲液,定容至10 mL,避光阴凉处平衡90 min。以蒸馏水作对照,分别测定pH 1.0和pH 4.5缓冲液中,OD520值和OD700值。结合比耳定律,花色苷含量的计算如公式(3)所示:
Amax=(A520-A700)pH 1.0-(A520-A700)pH 4.5
(3)
(4)
式中:Amax,最大吸收波长处的吸光度值;C,样品中花色苷含量,mg/100 mL;Mw,矢车菊素-3-葡萄糖苷的分子质量,449.2 mg/mol;DF,总稀释倍数;e,矢车菊素-3-葡萄糖苷的摩尔消光系数,26 900 L/mol;I:比色杯光程,cm。同一样品平行测定3次,计算出花色苷含量。
1.3.7 葡萄酒色泽指标的测定
1.3.7.1 葡萄酒CIELab 颜色参数测定
使用测色色差仪进行测定。
1.3.7.2 葡萄酒色度与色调的测定
使用紫外-可见分光光度计,分别测定葡萄酒样在420、520、620 nm波长处的吸光度值。色度为三者测定值之和,色调为420、520 nm下的值之比[21]。
1.3.8 葡萄酒香气物质的测定
挥发性物质含量采用顶空固相微萃取-气质联用技术检测[22]。将5 mL葡萄酒样品、10 μL内标(4-甲基-2-戊醇,0.989 8 g/L)和1.5 g NaCl加于20 mL顶空瓶中,40 ℃条件下平衡30 min后用2 cm DVB/CAR/PDMS萃取头吸附30 min,进行GC-MS分析。
1.3.9 葡萄酒感官评定
参考强文乐等[23]方法并进行改进。
1.4 数据处理
实验所得数据均采用Origin软件作图,显著性分析使用数理统计软件 SPSS 25.0版。
2 结果与分析
2.1 不同天然抗氧化剂对赤霞珠葡萄酒基础理化指标的影响
如表1所示,11个组别在发酵结束后的可溶性固形物、酒精度、总酸、还原糖及pH含量等指标均无显著差异(P>0.05)。表明添加GSH、葡多酚及羧甲基壳聚糖未对赤霞珠葡萄酒的基础理化指标产生显著性影响,与添加SO2发酵的葡萄酒基础理化指标无异,均可正常完成发酵。
表1 不同组别赤霞珠葡萄酒基本理化指标
Table 1 Basic physicochemical parameters of Cabernet Sauvignon wines by treatment group
组别可溶性固形物/°Brix酒精度/%vol总酸/(g/L)还原糖/(g/L)pHCK7.50±0.36a10.87±0.45a4.28±0.15a0.94±0.04a3.79±0.05aS7.50±0.10a10.83±0.74a4.27±0.28a0.93±0.04a3.79±0.09aG107.70±0.20a10.83±0.35a4.23±0.20a0.91±0.02a3.80±0.03aG207.53±0.15a10.83±0.55a4.20±0.15a0.91±0.05a3.80±0.03aG307.43±0.15a10.63±0.71a4.27±0.20a0.94±0.05a3.81±0.06aP807.50±0.10a11.00±0.36a4.15±0.23a0.91±0.09a3.79±0.01aP907.47±0.12a10.80±0.53a4.22±0.18a0.90±0.04a3.80±0.04aP1007.43±0.06a10.90±0.85a4.28±0.21a0.95±0.05a3.81±0.07aC1007.47±0.25a10.53±0.45a4.25±0.31a0.92±0.04a3.80±0.04aC2007.83±0.12a11.03±0.51a4.20±0.40a0.93±0.06a3.81±0.04aC3007.47±0.35a10.93±0.61a4.25±0.20a0.94±0.04a3.80±0.06a
注：不同小写字母表示组间差异性显著(P<0.05)(下同)。
2.2 不同天然抗氧化剂对赤霞珠葡萄酒抗氧化能力的影响
物质的抗氧化能力越强,自由基清除率越高。由图2可知,添加不同质量浓度GSH、葡多酚、羧甲基壳聚糖的赤霞珠葡萄酒ABTS阳离子自由基和DPPH 自由基清除率有所差异,但G组、P组、C组、S组的自由基清除率均显著高于CK组(P<0.05),表明GSH(10～30 mg/L)、葡多酚(80～100 mg/L)、羧甲基壳聚糖(100～300 mg/L)同SO2一样,可提升赤霞珠葡萄酒的抗氧化能力。P100组和C200组的ABTS阳离子自由基清除率与S组无显著差异(P>0.05),P100组和C200组的DPPH自由基清除率无显著差异(P>0.05),且接近于S组。添加葡多酚80～100 mg/L时,赤霞珠葡萄酒抗氧化能力随葡多酚添加量增加而增强,其原因可能在于葡多酚提升了酒体中酚类物质的含量,进而强化了葡萄酒清除自由基的能力。孙少忆等[24]对葡萄酒渣中提取的多酚进行抗氧化实验,结果表明其对ABTS阳离子自由基、羟自由基和·O2-自由基的清除能力高于维生素C。然而并非天然抗氧化剂的添加量越多越好,抗氧化剂组分会生成具有某些氧化效应的过氧化自由基,从而导致连锁的消极副反应[25]。
a-ABTS阳离子自由基清除率;b-DPPH自由基清除率
图2 不同组别葡萄酒抗氧化能力
Fig.2 Antioxidant activity in wine by different treatment
注:不同小写字母表示组间差异性显著(P<0.05)(下同)。
2.3 不同天然抗氧化剂对赤霞珠葡萄酒总酚含量的影响
酚类物质可与葡萄酒中的其他成分共存,同时捕获自由基,吸收溶解氧,保护酒液免于氧化。陈酿过程中,葡萄酒总酚含量呈下降趋势,原因在于多酚发生了酶促与非酶促氧化反应,不断聚合影响总酚含量,另一方面,酵母细胞壁上的甘露聚糖或一些酵母自溶物吸附多酚类物质,从而降低其含量[26]。如图3所示,与CK组相比,各处理组均能够显著提升葡萄酒总酚含量(P<0.05),这得益于抗氧化剂抑制了氧化反应。P组总酚含量随质量浓度增加而提升,其中P100组的总酚含量最高,为843.93 mg/L,效果优于传统的S处理组,说明葡多酚作为植物源多酚可提升葡萄酒总酚含量。G10与G20组无显著性差异,且总酚含量仅次于 P100组,GSH作为一种含硫氨基酸,在酶促氧化过程中易与酒中的醌式咖啡酰酒石酸反应,生成2-S-谷胱甘酰咖啡酰酒石酸。该产物具有惰性,一定程度上抑制了酶促氧化[27],原因在于它既不作为儿茶酚酶的氧化底物,也不促进氧化褐变。梁晓芳等[28]研究证实,添加20 mg/L GSH于龙眼干白葡萄酒中,可有效抑制酚类物质含量下降,同时延长葡萄酒的贮存时间,延缓氧化褐变。
图3 不同组别葡萄酒总酚含量
Fig.3 Total phenolic content in wine by different treatment
2.4 不同天然抗氧化剂对赤霞珠葡萄酒总黄酮含量的影响
总黄酮是衡量葡萄酒抗氧化性的重要指标之一。已有研究证明,选育高产还原型GSH的酿酒酵母或添加食品级还原型GSH,可有效提高葡萄酒抗氧化能力[5]。如图4所示,CK组总黄酮含量显著低于其他天然抗氧化剂处理组(P<0.05),添加10～30 mg/L GSH时,赤霞珠葡萄酒总黄酮含量随着GSH添加量增加呈现下降趋势。各处理组中,以G10组总黄酮含量最高,为458.84 mg/L。其原因可能是在发酵过程中,酿酒酵母自身转运蛋白可以吸收发酵醪中的GSH,进而帮助维持酵母胞内氧化还原态平衡,增强酵母活性的同时促进了黄酮从葡萄皮和籽中的溶出效率。GSH还会转化成葡萄反应产物,可抑制多酚的氧化链式反应,稳定总黄酮含量[27]。C200组仅次于G10组,总黄酮含量为436.15 mg/L,略高于S组419.73 mg/L的含量。G20、P90、C100、C300组间无显著差异(P>0.05),且均能够保持375 mg/L以上的总黄酮含量。
图4 不同组别葡萄酒总黄酮含量
Fig.4 Total flavonoid content in wine by different treatment
2.5 不同天然抗氧化剂对赤霞珠葡萄酒总花色苷含量的影响
红葡萄酒酒精发酵阶段结束后通常需滤去皮渣,此时,酒体失去了花色苷的持续来源,因此花色苷的含量不会超过皮渣分离前的水平。苹果酸-乳酸发酵一般也会在果皮残渣分离后进行,但花青素含量仍然明显降低[29]。由图5可知,CK组由于缺乏抗氧化剂的保护,花色苷氧化降解和自身裂解程度严重,P组和C组对酒体中花色苷的保护程度较好,P100组与S组花色苷含量无显著差异(P>0.05),而C200组显著高于S组花色苷含量(P<0.05),推测原因可能是葡多酚或羧甲基壳聚糖发生辅色作用,使花色苷分子形态发生改变,通过分子间的堆积和氢键作用,形成稳定的复合物,增强葡萄酒中花青素的稳定性[30]。本实验于葡萄酒酒精发酵前添加葡多酚,酚类浓度提升时有利于保持花色苷含量,稳定酒体质量。葡多酚和羧甲基壳聚糖作为抗氧化剂,在发酵初期可抑制氧化酶(如多酚氧化酶)活性,减少花色苷的氧化降解。另外,在葡萄酒体系中,羧甲基壳聚糖在氮原子上有一对未结合电子,可以与H+结合,从而使其形成具有吸附性的阳离子基团,而花色苷的酚羟基可能带负电或极性基团[31]。由于羧甲基壳聚糖具有吸附性,两者易形成稳定复合物进而稳定花色苷含量。
图5 不同组别葡萄酒总花色苷含量
Fig.5 Total anthocyanin content in wine by different treatment
2.6 不同天然抗氧化剂对赤霞珠葡萄酒CIELab颜色参数的影响
花色苷是红葡萄酒主要的呈色物质,颜色决定着红葡萄酒的品质与感官特性。在陈酿过程中,当花色苷与葡萄酒中的其他酚类化合物相互作用时,共色现象产生,进而稳定花色苷,酒体颜色也随之稳定[32]。为实现葡萄酒颜色的可视化比较,特采用CIELab体系绘制葡萄酒彩度和明度分布图(图6)。a*值越大,酒体红色色度越深,色泽饱满,呈现紫红色;b*值越大,则酒体黄化,向黄褐色转变[33];酒体的明暗程度通过亮度(L*)来衡量,L*值越大,意味着酒体颜色越浅且亮度越高。a*值下降的主要原因是葡萄酒中呈红色的乙酰化花色苷、吡喃花色苷及单葡萄糖苷花色苷在陈酿过程中被氧化[34],CK组因无抗氧化剂保护,氧化褐变程度最严重,故L*值和b*值最大,a*值较小,酒体向黄褐色转变。C200组与C300组a*值均在54以上,且L*值较低,酒体呈现紫红色,具有较好的观感。P组总体L*值适中,虽具有最低的b*值,但a*值比C组低,酒体呈深宝石红色。G组L*值较高,a*值较小,酒体呈砖红色。S组具有最低的亮度和较高的a*值,酒体透明度最低。
a-彩度分布图;b-明度分布图
图6 不同抗氧化剂葡萄酒明度和彩度分布图
Fig.6 Lightness and chroma distribution in wine by different treatment
2.7 不同天然抗氧化剂对赤霞珠葡萄酒色度与色调的影响
色度反映了葡萄酒颜色的深浅,色调则体现了葡萄酒的具体颜色特征,通过这2项指标可以较为直观地了解葡萄酒的氧化程度和品质。单体花色苷在葡萄酒与氧气接触过程中,容易与黄烷-3-醇类等多酚发生化学反应,生成稳定性更高的聚合型花色苷[35]。如表2所示,聚合花色苷的存在使得pH变化或添加SO2不会显著影响葡萄酒的色调,因此各组别之间的色调差异不大。添加羧甲基壳聚糖的赤霞珠葡萄酒具有较高的色度和色调值,与其他天然抗氧化剂处理组相比,酒体色彩饱和度较高,色泽更好。200 mg/L羧甲基壳聚糖处理组的葡萄酒色度与70 mg/L SO2处理组相当,表明羧甲基壳聚糖在保护颜色方面发挥了一定作用。葡多酚处理组的色度值随添加量增加而提高,P100组色度值显著高于P80组和P90组(P<0.05)。G组色度虽略低于P组、C组,但与CK组相比,仍然能保持良好的色泽。
表2 不同组别葡萄酒色度和色调
Table 2 Chroma and hue in wine by treatment group
组别色度色调CK1.68±0.04j1.10±0.01fG102.13±0.04g1.14±0.09deG202.05±0.02h1.15±0.02cdG301.99±0.03i1.11±0.01efP802.18±0.03f1.13±0.01efP902.31±0.03e1.12±0.00efP1002.43±0.05d1.11±0.01efC1002.75±0.03c1.17±0.03cC2002.93±0.02a1.21±0.03bC3002.83±0.01b1.25±0.01aS2.93±0.02a1.12±0.01ef
2.8 不同天然抗氧化剂对赤霞珠葡萄酒感官评分的影响
SO2作为传统的葡萄酒添加剂,可有效清除H2O2、将邻位醌还原为花色苷或抑制 Fenton反应等作用,因具有良好的抗氧化效果而被长期使用。然而SO2的刺激性味道可能会使葡萄酒的香气受到影响,在一定程度上会降低葡萄酒的感官品质。如图7所示,添加SO2的赤霞珠葡萄酒在香气浓郁度方面的感官评分略低于添加天然抗氧化剂的赤霞珠葡萄酒。未添加抗氧化剂的CK组酒体褐变,香气逸散,口感较为寡淡,余味较短,感官品质下降严重。而添加羧甲基壳聚糖的赤霞珠葡萄酒,各项感官评分良好且优于SO2组,表明酒体颜色较深,香气浓郁,入口回味悠长。说明羧甲基壳聚糖具有良好的护味效果,在提升赤霞珠葡萄酒口感与色泽的浓郁度、复杂度方面效果显著。该结论类似于周颖等[36]的研究结果:使用壳聚糖处理实验室自酿草莓酒,结果证实壳聚糖处理组对挥发性香气物质的影响较小,感官评价表明,0.2 g/L壳聚糖能更好地降低酒中的苦、涩味,香气更加平衡协调,感官品质高。且经羧甲基壳聚糖处理后的葡萄酒澄清度最好,原因在于其良好的絮凝性能对果酒中的胶粒进行吸附,对某些金属离子(Fe3+、Pb2+)选择性螯合。总体来看,感官评分结果为 C组>P组>S组>G组>CK组。
a-G组感官评价;b- P组感官评价;c-C组感官评价
图7 不同组别葡萄酒感官评价
Fig.7 Sensory evaluation in wine by treatment group
2.9 不同天然抗氧化剂对赤霞珠葡萄酒挥发性物质含量的影响
使用GC-MS对添加不同天然抗氧化剂的赤霞珠葡萄酒进行香气分析,如电子版增强出版附表1(https://doi.org/10.13995/j.cnki.11-1802/ts.42354,下同)所示。在11个样品中共检测到61种挥发性组分,包括28种酯、21种高级醇、7种挥发酸、2种萜烯、2种芳香醛以及1种C13-降异戊二烯物质。关键香气成分的气味活度值(odor activity value,OAV)是衡量葡萄酒香气质量的参数,表示挥发性化合物浓度与其感官阈值的比值[37],OAV>1时,表明该物质可能是影响葡萄酒香气质量的关键挥发性成分。本研究中OAV>1的物质有乙酸乙酯、丁酸乙酯、己酸乙酯、3-甲基丁酸乙酯、丁二酸二乙酯、辛酸乙酯、3-羟基丁酸乙酯、苯乙醛、β-大马士酮、异丁酸、丙醇、异戊醇,以上物质对香气特征有较大的贡献。
葡萄酒中的酯类物质主要贡献果香、甜香等令人愉悦的香气,其含量通常超过感官阈值,酯类含量的变化能显著改变葡萄酒的平衡性。适量的乙酸乙酯(80～100 mg/L)可以增加葡萄酒的果香和复杂度,使其香气层次更加丰富,含量过高(120～150 mg/L)则导致葡萄酒产生刺鼻的化学气味[38],未添加抗氧化剂的CK组乙酸乙酯含量最高,这表明该组酒体的氧化程度最为严重,并导致了过量的乙酸乙酯生成,进而使其感官品质劣化。相比之下,添加了抗氧化剂的G组、P组与C组均有效抑制了氧化进程,从而显著降低了乙酸乙酯含量;然而各抗氧化剂的效果存在差异,其中G组的乙酸乙酯含量高于P组和C组。 当酒体中高级醇总质量浓度在300 mg/L以下时,会凸显酒体的芳香特性,香气层次和感知度增加;而总质量浓度超过400 mg/L时,则会产生刺激性的负面气味。本研究中各处理组高级醇类物质的总量均低于96 mg/L,其中OAV>1的高级醇为丙醇和异戊醇,可为葡萄酒增添酒精气味特征,但当其中1-辛烯-3-醇类含量过高时,可能会使葡萄酒呈现出不合理的蘑菇或泥土味[39],戊醇是赤霞珠品种特有的香气物质,是其独特化学风格的原因[40]。然而,异戊醇含量过高会致使风味失衡。葡萄酒中的主要挥发酸是乙酸,当乙酸含量超过11 mg/L时,酒体可能存在被污染的情况,同时伴随酸臭等负面气味。由电子增强出版附表1可知,本实验各处理组乙酸含量均低于0.002 mg/L,均未出现酒体被污染的情况。类胡萝卜素降解生成降异戊二烯化合物,该化合物为葡萄酒增添花香和果香风味。目前有关葡萄酒中降异戊二烯化合物的研究主要集中在以β-大马士酮为代表的C13-降异戊二烯化合物上。葡萄酒中最具代表性的萜烯类化合物是β-大马士酮,它能为酒体增添浓郁的花香和烘焙水果的香气。尽管其阈值较低,但OAV却很高,因此在葡萄酒的品种香气中发挥着重要作用。本研究中β-大马士酮OAV>1,对葡萄酒的香气贡献显著。萜烯类香气物质是由异戊二烯构成的烃类化合物,主要赋予葡萄酒花果香气,具有生理活性但易于氧化[41]。S组中的萜烯类物质总含量显著高于其他处理组。作为葡萄衍生的挥发性化合物,萜烯类和降异戊二烯类化合物有助于保持葡萄的品种特征,而芳香醛类物质则主要贡献花香和果香,本研究中芳香醛类OAV>1的物质是苯乙醛,可为酒体带来风信子香特征。P组、C组苯乙醛含量较高,为酒体带来愉悦的香气特征。
使用主成分分析进一步揭示不同天然抗氧化剂对葡萄酒香气物质含量的影响,对不同处理酒样中OAV >1的香气物质进行统计分析,结果如图8所示,PC1和PC2分别解释了总体方差的40.3%和18.1%,香气物质主要分布在PC1的正向端。其中,P80组接近丁二酸二乙酯和3-羟基丁酸乙酯区域,酒体呈现出轻微的水果香和依兰香气。C100、C200、C300、P90、P100、S组相距较近,相关度高,均位于PC1正半轴,接近辛酸乙酯、3-甲基丁酸乙酯、苯乙醛、β-大马士酮香气物质区,酒体呈现果香、白兰地香、风信子香、甜香以及焙烤水果香气。说明以上处理组均可通过提升不同香气物质含量来凸显酒体的香气特征。C200组与S组相比,与苯乙醛香气物质的距离更近,说明C200组的风信子香特征更为明显,具有独特的香气辨识度。G组的3个处理接近丁酸乙酯、己酸乙酯和乙酸乙酯的区域,而之前的研究也显示,在葡萄酒陈酿过程中,GSH的添加对酯类香气物质的保护效果较为出色[42]。有研究认为,葡萄果实中含有还原型GSH,与硫醇结合形成结合态硫醇前体物,果香硫醇前体物质在酿酒酵母的作用下能够释放出挥发性香气物质,酿酒酵母胱硫醚β-裂解酶可将胱硫醚类香气前体物的C—S键断裂,从而将果香、硫、醇类香气物质释放到葡萄酒中[43]。添加GSH可以稳定结合态硫、醇前体物的含量,使酒体饱含水果香气,具有赤霞珠葡萄酒的典型性特征。然而G处理组乙酸乙酯含量>100 mg/L,可能会稍有化学气味,整体香气层次略显单薄。CK组位于PC1的负半轴,靠近异戊醇、丙醇、异丁酸香气物质区域,而远离主要香气物质的区域,酒体具有刺激味、苦杏仁味、酒精气味、奶酪味及破败味,说明酒体的负面香气较严重,不再适合饮用。与CK组相比,各处理均提高了花果香气物质的OAV,对酒体香气产生了积极影响;同时降低了负面香气物质的OAV。总体而言,葡萄酒的感官评分结果与挥发性物质的含量测定结果基本一致。
图8 不同组别葡萄酒香气物质组成主成分分析图
Fig.8 Principal component analysis plot of volatile compound composition in wine from different treatment groups
2.10 添加天然抗氧化剂赤霞珠葡萄酒指标相关性分析
通过采用Pearson相关性分析方法,探究了抗氧化能力、多酚含量、CIELab参数与感官指标之间的内在联系,结果如图9所示。分析结果表明,抗氧化能力、多酚含量、CIELab参数与感官指标之间均存在一定的相关性。ABTS阳离子自由基清除率与DPPH自由基清除率、总黄酮、花色苷、色度、感官评分之间均呈极显著正相关(P<0.01),该结论与赵昊等[44]研究结论一致。总酚与ABTS阳离子自由基清除率及DPPH自由基清除率之间呈显著正相关(P<0.05),这进一步验证了葡萄酒的抗氧化性主要由酚类物质赋予。葡萄酒中氧化反应主要以非酶氧化为主,在非酶氧化过程中,O2并不直接参与反应,而是经过逐步变化后形成过氧化物或者自由基参与氧化还原反应,这些物质统称为活性氧物质。酚类物质通过激活抗氧化酶和抑制诸如脂氧酶、NADH氧化酶和黄嘌呤氧化酶等产生活性氧物质的酶,提供抗氧化保护[40]。分析显示,总酚与总黄酮及花色苷之间存在极显著正相关(P<0.01),总黄酮具有多种生物活性,包括抗氧化、抗炎和心血管保护等,其含量与总酚含量密切相关。在总酚含量较高的组别中,葡萄酒中的酚类物质可作为辅色素与花色苷形成辅色复合体,而其中黄酮和黄烷醇类成分由于具有三环核心结构而成为酒中最有效的辅色素,因此提高了酒样的颜色品质[45]。感官评分与花色苷、色度、色调之间也呈现出极显著的正相关(P<0.01),表明花色苷是红酒中主要的酚类成分,花色苷含量越高,红酒中的红色色调越重,视觉观感越偏向于红色,从而带来更好的感官体验。此外,L*值与花色苷、色度、感官评分及a*值之间呈极显著负相关(P<0.01),L*值的增加意味着红葡萄酒的亮度增加,但也可能导致色彩层次感下降,并且黄色色素的增加会导致葡萄酒出现黄化或褐变,从而降低其感官品质。
图9 酒样中各类指标相关性分析热图
Fig.9 Correlation heatmap of parameters in wine
注:*表示P≤0.05,**表示P≤0.01。
3 结论与讨论
本研究通过测定基础理化指标、体外抗氧化能力、总酚含量、总黄酮含量、总花色苷含量、CIELab颜色参数、色度和色调、感官评分以及挥发性物质含量等多项指标,探究了添加不同质量浓度还原型GSH、葡多酚、羧甲基壳聚糖对赤霞珠葡萄酒抗氧化活性、颜色指标及风味物质的影响,并与传统抗氧化剂SO2效果进行对比。结果表明,添加还原型GSH、葡多酚及羧甲基壳聚糖对葡萄酒的基本理化指标无显著影响,均可正常完成发酵。不同质量浓度的天然抗氧化剂显著增强了赤霞珠葡萄酒的抗氧化能力,其中,100 mg/L葡多酚和200 mg/L羧甲基壳聚糖的抗氧化效果与70 mg/L SO2处理组相当。尤其是100 mg/L葡多酚处理组的总酚含量最高,其效果优于传统的SO2处理组。200 mg/L羧甲基壳聚糖组花色苷含量最高,表明羧甲基壳聚糖对赤霞珠葡萄酒花色苷具有良好的保护作用。颜色参数方面,200、300 mg/L羧甲基壳聚糖组的酒体颜色稳定性好,显示出较深的紫红色调。添加羧甲基壳聚糖的葡萄酒在感官品质上优于其他处理组,特别是在色泽和香气复杂度方面获得较高评分。GC-MS测定结果表明,添加天然抗氧化剂后,葡萄酒中的挥发性香气物质含量有所不同,葡多酚组和羧甲基壳聚糖组的香气特征与SO2处理组相似,其中200 mg/L羧甲基壳聚糖组表现出更为显著的风信子香气特征。综合来看,葡多酚及羧甲基壳聚糖处理组在赤霞珠葡萄酒抗氧化及护色护香方面效果不逊于SO2,一定程度上可作为SO2的替代抗氧化剂。GSH处理组护色护香效果虽不及SO2,但10 mg/L GSH处理组依然能够保持最高的总黄酮物质含量,具有广阔的发展前景。
综上所述,天然抗氧化剂能有效提高葡萄酒的抗氧化能力和感官品质,特别是羧甲基壳聚糖在护色、提升香气复杂度方面表现优异,该结论也在前人的研究中被证实[46]。以往的研究认为,还原型GSH对花色苷和聚合色素具有保护作用,本研究虽然证实了GSH在抗氧化方面的良好表现,但在保护葡萄酒色泽及香气方面不够出色,猜测原因与GSH会促进锦葵色素-3-O-葡萄糖苷的降解有关[47],该假设需要进一步的研究证实。本研究还创新性地探索了葡多酚对赤霞珠葡萄酒品质的影响,为其在葡萄酒酿造中的应用提供了科学依据。由于引起葡萄酒腐败的微生物主要有酵母菌、乳酸菌、醋酸菌,因此防止葡萄酒微生物腐败同样是亟待解决的问题,SO2的健康争议推动了对替代技术的探索。CAPECE等[48]筛选出1种混合发酵剂,配合高接种量,可抑制野生微生物的同时实现无SO2发酵,并提升葡萄酒的抗氧化特性和多酚含量;MOHAMMADI等[49]采用4 J/cm2强度的连续脉冲光与添加25 mg/L SO2相结合的方式处理红葡萄酒,该方法有效减少了腐败微生物数量,降低了SO2用量且未对酒体质量产生明显影响。脉冲电场和高压处理已被证明是最有效的葡萄酒巴氏杀菌技术,二者可在短时间内灭活主要的葡萄酒腐败酵母菌,包括Brettanomyces和细菌,同时保留葡萄酒的特征风味和香气。目前使用真菌源壳聚糖灭活酒香酵母菌也已获得国际葡萄与葡萄酒组织和欧盟的授权,兼具抗氧化性的同时可保护葡萄酒不被酒香酵母污染。以上处理方法安全高效,确保了亚硫酸盐敏感消费者的安全和葡萄酒产品的稳定性。与SO2相比,上述3种天然抗氧化剂在保护葡萄酒品质的同时安全性更高。天然抗氧化剂与非热杀菌技术结合为替代SO2提供了新方向,兼具环保与健康效益,是传统防腐剂替代层面的重要突破,有望在果酒行业中推广。在今后的研究中,可着重于抗氧化剂在不同酿造阶段对葡萄酒的影响,或考察其对葡萄酒贮藏的长效作用。另外还可以考虑多种抗氧化剂与非热杀菌技术联用的方式,以达到降低生产成本、保护葡萄酒风味品质,以及尽可能减少SO2用量的目的。
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