风味是决定消费者对发酵乳制品接受度和偏好性的关键因素[1]。由于消费者对于天然和健康产品的追求,添加香精香料的发酵乳已不再符合人们对“零添加”的需求[2-3]。因此,发掘具有特色风味的发酵剂菌种,充分利用发酵乳中自然产生的风味物质成为满足消费者需求的重要手段。发酵乳可以分为多种香型,包括奶酪香型、奶香型、发酵香型和兼香型[4]。其中,奶酪香气作为一种独特的风味在中国越来越受欢迎,以奶酪作为食品配料的创新品类也在市面上不断涌现,具有奶酪特征风味的发酵乳颇受消费者青睐[5]。然而,目前发酵乳奶酪风味的关键化合物尚未完全明确[6],对于关键风味物质的形成机制和变化规律仍缺乏系统性的研究,导致发酵过程中奶酪香气难以调控[7],制约了特色风味菌株的开发和应用。
目前对奶酪型香气的研究主要集中在干酪乳酪杆菌、副干酪乳酪杆菌和鼠李糖乳酪杆菌等[8-10]。然而,对于发酵乳生产中广泛使用的典型菌种德氏乳杆菌保加利亚亚种(Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus,L.bulgaricus)的特色风味的研究相对较少[11],对其风味调控潜力挖掘不足。L.bulgaricus在挥发性酸类化合物(甲酸、乙酸、丁酸、己酸、癸酸等)的产生中发挥着重要作用[12],这些游离脂肪酸显著影响奶酪风味评价[13-14]。LIU等[4]对28株L.bulgaricus发酵乳的香气进行分类,发现其中13个样本表现出明显的奶酪香型,其中挥发性脂肪酸的存在对奶酪香气的形成有重要贡献。虽然挥发性脂肪酸已被证明对多种奶酪的风味有显著影响[15],但奶酪风味中关键脂肪酸的组成及其最佳含量仍不清楚。
为进一步解析挥发性脂肪酸对L.bulgaricus发酵乳中奶酪风味的关键作用及其对风味的影响规律,本研究通过采用GC-MS定量测定、感官评价、三点检验和香气添加实验,从发酵乳产生的挥发性脂肪酸中鉴定出对奶酪香气有显著贡献的关键风味化合物并进一步阐明其含量变化对奶酪风味的影响,为奶酪风味菌株的靶向筛选提供科学依据,同时为优化发酵工艺、提升产品奶酪风味特性奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
选取实验室菌库中12株具有不同奶酪香气强度的德氏乳杆菌保加利亚亚种[4],将其接种于MRS肉汤培养基,在37 ℃下活化培养24 h,并在牛奶培养基中传代培养3次,培养温度为37 ℃,培养时间为18 h。
原料乳(灭菌全脂牛乳),内蒙古蒙牛乳业(集团)股份有限公司;丁酸、己酸、辛酸,上海麦克林生化科技有限公司;2-辛醇,德国Dr.Ehrenstorfer公司;C7～C40饱和正构烷烃,西格玛奥德里奇贸易有限公司(中国上海)。
1.2 仪器与设备
8890/7000D三重四极杆气质联用仪,美国安捷伦科技有限公司。
1.3 实验方法
1.3.1 发酵乳的制备
在100 mL原料乳(蛋白质含量3.2 g/100 mL,脂肪含量3.6 g/100 mL)中加入6.0 g蔗糖,95 ℃灭菌5 min后,冷却至室温,将用牛奶培养基传代培养后的菌株以2%的接种量接种至灭菌后的原料乳中,42 ℃发酵。待pH值降至4.5时立刻冰浴结束发酵。随后,将发酵结束的发酵乳置于4 ℃冰箱进行后熟,后熟24 h后分析。发酵乳样品以相应菌株命名,例如,由L.bulgaricus L9-1发酵得到的发酵乳样品命名为L9-1。
1.3.2 发酵乳感官分析
参考LIU等[4]的方法对发酵乳样品的奶酪香气特征进行定量描述性分析(quantitative descriptive analysis,QDA)。将20 g发酵乳置于不透明一次性塑料品评杯中,用3位数字随机编码,并在25 ℃下给予感官评价小组成员。小组成员在感官分析之前,进行了相关训练。评分使用连续的9分制,范围从0分(没有感觉到奶酪香气属性)到9分(奶酪香气属性的强度非常高)来测量奶酪香气强度。以切达奶酪作为奶酪香气属性的参考物,其香气强度等级设置为7分。为保证发酵乳感官评价结果的准确性和可靠性,每个发酵乳样品均至少测定3次。
1.3.3 发酵乳中风味成分的检测
采用顶空-固相微萃取技术(headspace solid phase microextraction,HS-SPME)提取风味物质,使用配备Agilent HP-INNOWax色谱柱的GC-MS对发酵乳样品中挥发性风味化合物进行定性与定量分析。检测方法参考TIAN等[16]和DAN等[17]的方法并稍作修改。将8 g发酵乳样品和1 μL 2-辛醇(0.769 mg/mL)内标加入到20 mL带有硅隔膜的顶空瓶中。将顶空瓶立即在55 ℃下,热平衡20 min,随后将250 ℃下老化15 min的SPME萃取头插入样品的顶空(液体表面以上约2 cm),并在55 ℃下萃取40 min,然后立即插入GC进样口(250 ℃),热解吸6 min。其中,柱箱升温程序为:35 ℃保持3 min,其次以4 ℃/min的升温速率升至120 ℃,再以5 ℃/min的升温速率升至190 ℃,最后以10 ℃/min的升温速率升至230 ℃并保持6 min。对于挥发性化合物的定性,首先通过GC-MS NIST 17谱库进行初步定性,其次根据标准品的保留时间、C7～C40饱和正构烷烃算出挥发性化合物在HP-INNOWax色谱柱上的保留指数并与文献资料比对。
1.3.4 风味成分的外标法定量及气味活度值分析
在上述GC-MS检测条件下,对L.bulgaricus发酵乳中的重要风味成分进行绝对定量[16-17]。首先参考文献[18],配制模拟发酵乳的无香基质,称取3.0 g的浓缩蛋白粉,3.6 g的葵花籽油,1.0 g的变性淀粉和0.1 g的果胶,用100 mL超纯水溶解,55 ℃下2 000 r/min搅拌30 min,均质机20 MPa均质2次,95 ℃灭菌5 min后,冷却至室温,用稀释的乳酸溶液将其pH值调至4.5,最后得到具有适当质地的模拟发酵乳的无香基质。取8.0 g无香基质于20 mL顶空瓶中,加入1 μL 2-辛醇(0.769 mg/mL)内标,并加入不同含量的风味成分标准品(至少6个梯度),使用HS-SPME-GC-MS进行检测,制作标准曲线,并计算发酵乳样品中风味成分的含量,及其对应气味活度值(odor activity value,OAV)[19]。
1.3.5 关键风味成分对发酵乳奶酪味的贡献研究
三点检验是一种统计方法,用于确定2个产品样本之间是否存在可感知的感官差异或相似性[20]。为了探究丁酸和己酸对发酵乳奶酪香气属性的影响,根据GB/T 12311—2012《感官分析方法 三点检验》,分别进行了差别检验和相似性检验。其中差别检验样本为:发酵乳感官分析中QDA得分最高和最低的发酵乳样品;相似性检验所采用样本为:将QDA得分最低的发酵乳中的丁酸和己酸的含量补足至QDA得分最高的样品中2种酸的水平后的发酵乳样品与QDA得分最高的发酵乳样品。每次检验向感官评价人员提供3个随机编码的样本,其中2个是相同的,评价员必须识别出不同的一个。同时,进行了QDA来量化样本之间的奶酪香气强度的差异。
1.3.6 关键风味成分含量影响奶酪味强度的规律研究
为了确定关键风味成分含量高低对奶酪香气强弱的影响,向奶酪香气强度最弱的发酵乳中补充不同含量的关键风味成分,同时进行QDA,对奶酪香气强度进行评估。
1.4 数据分析
采用SPSS 22软件对QDA、定量分析、香气添加实验的数据结果进行显著性分析。使用Origin 2024作图。使用三点检验统计表分析辨别测试数据,用于估计三点检验中的正确临界响应数。
2 结果与分析
2.1 发酵乳的感官评价
通过QDA,本研究对由12株L.bulgaricus分别制得的发酵乳的奶酪香气强度进行量化,如图1所示,12个发酵乳样品的奶酪味香气强度存在显著差异,其中L9-1的奶酪香气最浓,而L8-8的奶酪香气最弱。发酵制品中风味化合物的组成影响产品整体的香气水平,其中关键风味成分的存在对感官属性的偏向更是起决定作用[21],不同发酵乳的感官属性之间存在显著性差异的原因可能是影响奶酪香气强度的关键风味成分之间存在差异。
图1 12株L.bulgaricus分别制得的发酵乳的奶酪香气强度感官评价
Fig.1 Sensory evaluation of cheesy aroma intensity in fermented milk prepared with 12 strains of L.bulgaricus
注:不同字母标识代表各组间具有显著性差异(P<0.05)。
2.2 发酵乳中挥发性脂肪酸的检测
在发酵乳制品的风味研究中,已检测到大量风味成分且不同种类发酵乳制品的风味组成也存在差异[22],其中,在有关奶酪制品的风味研究中,挥发性脂肪酸被认为是显著影响其风味评价的重要因素[13]。而且,课题组前期的研究中,基于气相色谱-嗅觉-质谱分析,发现保加利亚乳杆菌发酵乳中乙酸、丁酸、己酸、辛酸为气味活性物质,能够被嗅觉感知[4]。为进一步解析决定发酵乳奶酪风味强度的关键脂肪酸及其对奶酪风味的影响规律,本研究对12株L.bulgaricus分别制备的发酵乳进行了GC-MS检测,与之前的研究结果一致,共检测到乙酸、丁酸、己酸、辛酸4种挥发性脂肪酸,这些化合物的定性与相对定量结果如表1所示。结果显示,具有较强奶酪香气的L9-1和L4-2-3中丁酸、己酸和辛酸的相对含量显著性高于其他发酵乳,感官得分在3.0～4.0的大多数发酵乳中,丁酸、己酸和辛酸的含量与感官评分呈一定程度正相关,并且感官得分最低的L8-8中这3种脂肪酸的含量也处于相对较低水平,与其他发酵乳之间存在显著性差异。如图2所示,通过Spearman相关性分析进一步发现,丁酸、己酸和辛酸的含量与发酵乳的奶酪香气强度呈显著正相关,这表明它们的含量与菌株的奶酪香气强度密切相关,为定向筛选高产香菌株提供了明确靶点。相反,乙酸与奶酪香气强度没有相关性,因此后续研究仅关注丁酸、己酸和辛酸的贡献。值得注意的是,由于感官评价本身存在一定的波动性,可能会出现某些发酵乳的感官评分较高而这3种酸的含量较低的情况,这种现象可能与发酵过程中其他风味化合物的协同作用有关[23],这些化合物可能在一定程度上补偿了丁酸、己酸和辛酸的不足,从而影响了整体的感官评价。
表1 发酵乳中挥发性脂肪酸的定性和半定量结果 单位:μg/kg Table 1 Qualitative and semi-quantitative determination of volatile fatty acids in fermented milk
化合物保留指数计算值1参考值2L4-1-1L4-1-2L4-2-3L4-2-8L5-1L6-10L6-15L8-6L8-8L9-1L9-11L9-6乙酸1 4701 4492.148±0.308bcd2.540±0.406abc2.049±0.229cd1.428±0.196e0.444±0.060f1.602±0.118de1.094±0.129e2.140±0.221bcd2.748±0.282a2.700±0.783ab0.189±0.062f2.120±0.086cd丁酸1 6311 6522.566±0.238cd2.382±0.463cd4.970±0.168a3.342±0.344b2.439±0.150cd2.792±0.063c2.535±0.065cd2.153±0.388de1.755±0.107e5.063±0.307a2.319±0.061cd2.445±0.227cd己酸1 8641 84613.752±0.192c8.884±0.820fg17.642±1.276b14.146±1.535c10.909±0.480de11.775±0.199d10.499±0.198def8.597±0.323g9.635±1.294efg22.903±1.856a10.982±0.207de9.460±0.484efg辛酸2 0792 0606.516±0.333f9.043±1.383def22.025±2.998b12.296±0.855c9.572±1.052de11.207±0.810cd8.413±0.329ef7.922±1.314ef7.503±1.349ef37.625±1.822a9.718±1.370de9.096±0.230def
注：通过HP-INNOWax柱分离得到的保留指数,保留指数是通过正构烷烃(C7～C40)计算得出的;可以参考NIST化学网页(NIST Chemistry WebBook)获取保留指数的参考值;同一行中不同的上标字母表示存在显著差异(P<0.05)。
图2 发酵乳的奶酪香气强度与挥发性脂肪酸相关性分析
Fig.2 Correlation analysis between cheesy aroma intensity and volatile fatty acids in fermented milk
注:*表示P<0.05。
2.3 关键香气化合物的定量测定与验证
通过外标法对奶酪香气最强的发酵乳样本L9-1和奶酪香气最弱的发酵乳样本L8-8中的丁酸、己酸和辛酸的含量进行了外标法定量分析。结果表明(表2),在L9-1中,丁酸的含量为9 459 μg/kg,己酸的含量为2 335 μg/kg,辛酸的含量为866 μg/kg。相比之下,在L8-8中,丁酸的含量为5 564 μg/kg,己酸的含量为1 733 μg/kg,辛酸的含量为234 μg/kg。这些结果表明,与奶酪香气较弱的发酵乳相比,奶酪香气较强的发酵乳中挥发性脂肪酸类化合物的含量更高。
表2 发酵乳中3种挥发性脂肪酸定量分析及OAV计算
Table 2 Quantitative analysis and OAV calculation of three volatile fatty acids in fermented milk
化合物标准曲线r2阈值/(mg/kg)含量/(μg/kg)OAVL9-1L8-8L9-1L8-8丁酸y=0.004 9x+0.046 40.999 53.099 459±1 701a5 564±202b32己酸y=0.068 8x+0.253 30.994 50.0652 335±378a1 733±554b3630辛酸y=0.340 8x+0.503 90.991 410.98 866±610a 234±114b< 1< 1
注：同行小写字母不同表示不同含量之间差异显著(P<0.05)。
为了进一步探讨丁酸、己酸和辛酸对奶酪香气强度的贡献,计算了这些挥发性化合物的OAV。OAV是评估挥发性化合物在食品感官特性中重要性的关键指标,当OAV≥1时,表明该化合物对香气有重要贡献[24]。结果显示,L9-1和L8-8发酵乳中丁酸和己酸的OAV均超过了1(表2),而辛酸的OAV均小于1,这表明丁酸和己酸在发酵乳的香气特征中发挥了重要作用。然而,OAV仅能反映化合物对香气的贡献,却无法直接揭示其对奶酪香气的贡献程度[25],因此,本研究进一步采用三点检验法,精确评估丁酸和己酸对奶酪风味强度的影响。分别通过差别检验和相似性检验,对发酵乳L9-1、L8-8和补充丁酸和己酸含量至L9-1的样品TL8-8之间的香气差异程度进行了评估。在差别检验中,实验样本为L9-1和L8-8,如表3和图3所示,共进行了24次差别检验,获得了23个正确答案,表明L9-1和L8-8之间存在显著的感官差异(P<0.001),与之对应的是2种发酵乳的奶酪香气得分同样存在显著差异。在相似性检验中,实验样本为L9-1和TL8-8。TL8-8是通过向L8-8中补充丁酸和己酸,使其中丁酸的含量达到9 459 μg/kg,己酸的含量达到2 335 μg/kg。如表3所示,共进行了54次相似性检验,获得了21个正确答案,通过查表可知,评估者有95%的置信度判断L9-1和TL8-8在奶酪香气方面没有明显差异,而且实际能够区分样品的评估者比例不超过30%。如图3所示,奶酪香气强度感官评价结果与相似性检验结果一致,L9-1和TL8-8在奶酪香气得分上没有显著性差异。结果表明,添加丁酸和己酸确实提高了L8-8的奶酪香气强度,且丁酸和己酸对发酵乳的奶酪香气强度具有不可或缺的作用。
表3 发酵乳三点检验结果
Table 3 Results of triangle test of fermented milk
检验目的检验次数正确答案数P检验结果差别检验2423<0.001不相似相似性检验5421<0.05相似
图3 发酵乳的奶酪香气强度感官评价
Fig.3 Sensory evaluation of cheesy aroma in the fermented milk
注:***表示P<0.001,ns表示实验结果中没有显著差异。
2.4 关键风味成分含量的最佳范围
在以往的研究中,对于奶酪香气关键风味化合物的探究主要聚焦于定性或定量测定,而对这些化合物的最佳含量范围的关注相对较少。为了得到丁酸与己酸含量对奶酪香气强度影响变化规律,我们将L9-1和L8-8发酵乳中丁酸和己酸的含量差作为基准,并据此向L8-8中添加2种酸。如表4所示,随着丁酸与己酸含量的递增,发酵乳中奶酪香气强度呈现出同步上升的趋势。当丁酸和己酸含量之比达到4.5,且丁酸和己酸的含量分别为13 354和2 937 μg/kg时,发酵乳的奶酪香气强度达到峰值。然而,一旦超过这一含量阈值,香气强度便会随着含量的进一步增加而逐渐减弱。这一现象表明,在决定L.bulgaricus发酵乳的奶酪香味方面,丁酸和己酸发挥着至关重要的作用,其含量对香气强度具有显著的调控效应。值得注意的是,QDA仅能对奶酪香气强度进行量化并不能对发酵乳的品质进行评价[26]。本研究结果揭示,当丁酸含量处于9 459～13 354 μg/kg、己酸含量介于2 335～2 937 μg/kg,丁酸含量与己酸含量之比为4.1～4.5时,奶酪香气最为浓郁。需特别指出的是,本研究虽发现丁酸(13 354 μg/kg)与己酸(2 937 μg/kg)的协同组合在感官评价中得分最高,但该结果并不排除其他含量配比的风味优化潜力,可能存在更优的含量组合。研究发现丁酸和己酸的含量对奶酪风味强度有重要影响,低浓度会使奶酪风味过于淡薄,缺乏足够的风味强度,但过高的浓度则会使奶酪风味变得过于浓烈,这样可能会掩盖其他愉悦的风味成分,导致整体风味失衡[27],这可能是由于丁酸和己酸的气味描述除了和奶酪香气有关外,还与一些不愉快的气味(酸败的、汗味的)有关[28]。因此,在发酵工艺设计与加工参数调控中,应谨慎调整发酵参数,使关键香味化合物的含量控制在一个适宜的范围内,避免盲目提高,以确保奶酪香气的稳定呈现。这一发现对于解决酸奶同质化问题具有重要意义。通过调控发酵工艺改变关键香气化合物的产量和浓度,可以有效控制发酵乳奶酪香气属性的强度,从而开发出具有不同奶酪风味强度的系列酸奶产品,满足消费者对差异化产品的需求。
表4 不同丁酸和己酸含量对奶酪香气强度的影响
Table 4 Effects of butanoic and hexanoic acids contents on the intensity of cheesy aroma
添加量丁酸与己酸含量比丁酸含量/(μg/kg)己酸含量/(μg/kg)香气强度0.1 C1.62 9541 7934.15cd0.5 C3.77 5122 0344.00d1.0 C4.19 4592 3355.62ab1.5 C4.311 4062 6365.55b2.0 C4.513 3542 9376.60a5.0 C5.325 0394 7435.13bc10 C5.744 5137 7534.00d
注：“C”为L9-1和L8-8发酵乳中丁酸和己酸含量的差值。同列不同小写字母表示不同香气强度之间差异显著(P<0.05)。
3 结论与讨论
论文通过深入分析4种挥发性脂肪酸的奶酪风味贡献,揭示了丁酸与己酸的核心作用,解析了其含量范围及其比例对奶酪香气的决定性作用,本研究为奶酪香型特色L.bulgaricus的靶向筛选提供了关键参考指标,即当L.bulgaricus在发酵过程中能够产生9 459～13 354 μg/kg丁酸和2 335～2 937 μg/kg己酸,且两者比例稳定在4.1～4.5时,可显著强化奶酪风味特征,这一发现确立了菌株筛选的定量化标准。研究表明,在发酵乳生产中通过定向选育高产特定挥发性脂肪酸的菌株并精准调控其代谢,可在无外源添加的前提下实现发酵乳奶酪风味的内源性提升,为控制和优化发酵乳的风味提供了具体的参考,也为通过菌株筛选和发酵调控实现“零添加”的风味增强提供了借鉴。
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