α-L-鼠李糖苷酶(EC 3.2.1.40)属于碳水化合物活性酶(CAZy)中的糖苷水解酶GH78和GH106家族,可特异性水解鼠李糖苷、鼠李糖脂和糖缀合物中非还原性末端α-1,2、α-1,3、α-1,4和α-1,6连接的L-鼠李糖残基。该酶广泛存在于微生物和植物中,底物特异性强和催化效率高[1-2]。大部分α-L-鼠李糖苷酶的最适温度为40～60 ℃,最适pH为4.0～8.0,由于其良好的热稳定性,在食品、保健品和医药领域应用广泛。在食品工业中,α-L-鼠李糖苷酶可水解柚皮苷,显著降低果汁的苦味,改善果汁口感和澄清度,并生成普鲁宁等具备抗炎、抗氧化活性的物质[3]。作为生物催化剂,α-L-鼠李糖苷酶可参与糖苷类药物和抗肿瘤药物等的合成[4]。该酶还广泛应用于黄酮的生物转化,以改善其溶解性、生物利用度和生物活性[5]。其中,芦丁经该酶催化脱除鼠李糖残基后生成的异槲皮素分子更小,溶解性和肠道吸收率提升,生物利用度是芦丁的2～3倍,同时抗氧化能力也明显增强[6-7],具有更好的市场前景,同时异槲皮素的市场价值是芦丁的1 000倍以上。这些转化实现了黄酮结构优化和活性提升,为功能食品、药物的开发提供了有效手段,极大提升了其利用价值。
α-L-鼠李糖苷酶可通过微生物发酵和基因工程制备[3,8-9]。微生物发酵多以黑曲霉、棘孢曲霉和多形拟杆菌等为生产菌,通过优化培养基和发酵条件提升酶产量,具有成本低、易规模化等优点,但纯化难度较大[10-12]。目前高产菌株的筛选与工艺优化仍是关键的技术难点。基因工程法基于分子克隆和重组表达,可实现在大肠杆菌等宿主中生产高纯度α-L-鼠李糖苷酶,以满足工业需求[13-15]。
毕赤酵母具备高效表达与分泌、易遗传操作、可完成真核蛋白糖基化等翻译后修饰等优势,是理想的α-L-鼠李糖苷酶表达平台[1,8,16]。其可通过分泌表达、表面展示和胞内表达实现蛋白的表达和分泌。其中表面展示可将目标蛋白锚定于细胞表面,广泛应用于抗体筛选、疫苗研发、酶固定化等领域[1,17-19]。但目前使用毕赤酵母表达α-L-鼠李糖苷酶仍存在表达量低、工业稳定性差和生产成本高等瓶颈。基于此,本团队在α-L-鼠李糖苷酶的高效表达及应用方面开展了系列研究。目前,以毕赤酵母为底盘细胞,已成功构建多种酶活显著提高的工程菌株,如GS115/pPIC9K-Rha、GS115/pPIC9K-SP6-Rha、GS115/pPIC9K-Rha-gcw61等,并将其用于落新妇苷向高价值的花旗松素转化中。但仍存在酶活较低,转化率有限的问题,且对其他黄酮类化合物的催化效果未知[20]。
因此,本研究以实验室前期构建的表面展示毕赤酵母GS115/pPIC9K-Rha-gcw61为出发菌株,分别在摇瓶和发酵罐水平对发酵条件进行优化,以提高α-L-鼠李糖苷酶的酶活;并探究发酵后酶液将芦丁转化为高价值异槲皮素的应用;进一步采用固定化方法提高酶活稳定性和储存时间。本研究为α-L-鼠李糖苷酶的工业化生产及高值黄酮类化合物的生物转化提供了技术支持和理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
毕赤酵母工程菌GS115,上海碧云天生物技术有限公司;表达载体pPIC9K(9.2 kb,Amp),北京酷来搏科技有限公司;重组菌株GS115/pPIC9K-Rha-gcw61,前期构建并由本实验室的微生物保藏中心冷冻保存;酵母氮源培养基、芦丁、异槲皮素等,北京索莱宝科技有限公司;酵母提取物、胰蛋白胨等,Oxoid公司;无水甲醇、乙腈、二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide, DMSO)等(均为色谱纯),上海麦克林生化股份有限公司。
SS-325型全自动灭菌锅,日本TOMY仪器有限公司;SCIENTZ-IID超声波细胞粉碎机,加拿大爱威斯汀公司;Allegra 64R高速冷冻离心机,美国BACKMAN公司;PHS-2C型pH计,梅特勒-托利多仪器上海公司;1260 Infinity II高效液相色谱仪,美国Agilent公司;SpectraMax i3X多功能酶标仪,奥地利Molecular Devices公司;Biotech-5JG玻璃发酵罐,上海保兴生物设备工程有限公司。
1.2 培养基
10×YNB(g/L):无酵母氨基氮源134。
YPD培养基(g/L):酵母粉10、蛋白胨20、葡萄糖20,115 ℃高压灭菌20 min;固体培养基加入15 g/L琼脂。
BMGY培养基(g/L):酵母提取物10、蛋白胨20、甘油20,加水至700 mL,121 ℃灭菌20 min,无菌条件下加入100 mL PB,100 mL YNB培养基,4 mL生物素(0.2 mg/L),1 mL氨苄青霉素,定容至1 L。
BMMY培养基:不加甘油,其他成分与配制方法同BMGY培养基。
发酵罐培养基(g/L):磷酸(85%)26.7 mL/L、CaSO4·2H2O 1.18、K2SO4 18.2、MgSO4·7H2O 7.27、KOH 4.13、甘油40、硫酸铵10,121 ℃灭菌20 min。PTM1微量元素(g/L):CuSO4·5H2O 6、NaI 0.08、MnSO4·H2O 3、NaMoO4·2H2O 0.2、H3BO4 0.02、CoCl2 0.5、ZnCl2 20、FeSO4·7H2O 65、生物素0.2、硫酸5 mL/L,过膜除菌。
YPG培养基(g/L):酵母提取物10、蛋白胨20、甘油10,121 ℃灭菌20 min。
MGY培养基(g/L):YNB 13.4,甘油10,组氨酸10,121 ℃灭菌20 min。
SOC培养基(g/L):蛋白胨20、酵母提取物5、NaCl 0.5、KCl 0.2、MgCl2 0.96、葡萄糖3.6、MgSO4 1.2,115 ℃灭菌20 min。
1.3 GS115/pPIC9K-Rha-gcw61菌株的构建及摇瓶培养
1.3.1 重组菌株GS115/pPIC9K-Rha-gcw61的构建
以pPIC9K-3flag-STM-Gcw61为模板,通过反向PCR获得不含STM的线性化载体。以pPIC9K-Rha为原始菌株,PCR扩增Rha基因片段,回收纯化。采用无缝克隆酶Basic Mix将线性化载体与Rha片段在50 ℃进行连接,并转化至大肠杆菌JM109,经菌落PCR及测序验证后获取重组质粒pPIC9K-Rha-Gcw61。随后用Sal Ⅰ酶线性化重组质粒pPIC9K-Rha-Gcw61,电转法导入毕赤酵母GS115,经MD平板及G418-YPD平板涂布,筛选阳性及具有高拷贝数的转化子。经菌落PCR验证及测序后正确的转化子命名为GS115/pPIC9K-Rha-Gcw61,并于-80 ℃保存[20]。
1.3.2 重组菌株GS115/pPIC9K-Rha-gcw61的摇瓶培养
将构建的GS115/pPIC9K-Rha-gcw61菌株接种于YPD固体培养基上,30 ℃培养2 d,挑取单菌落接种到YPD液体培养基,30 ℃,190 r/min培养22～24 h获得种子液。以2%接种量(体积分数)接种到BMGY培养基,30 ℃培养18 h后离心收集菌体。用BMMY培养基重悬菌体,30 ℃培养6 d,每24 h加入1%甲醇(体积分数)诱导产酶。发酵液4 ℃,8 000 r/min离心10 min收集菌体,取0.5 g菌体用4 mL pH 5的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液制备菌液,于600 nm处测定吸光度[8]。
1.4 α-L-鼠李糖苷酶活力测定
用50 mmol/L pH 5的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液配制对硝基苯酚(p-nitrophenol,pNP)标准溶液,60 ℃孵育5 min,加入100 μL 1 mol/L Na2CO3溶液,405 nm处测定吸光度绘制标准曲线。酶活力测定:150 μL缓冲液与40 μL 5 mmol/L pNPR混合,60 ℃预热2 min,加入10 μL菌液,60 ℃反应5 min,加入1 mol/L Na2CO3中止反应,405 nm测定吸光值。酶活力单位(U)定义为在60 ℃、pH 5条件下,每分钟消耗1 μmoL pNPR所需的酶量[21]。
1.5 摇瓶水平培养基与培养条件优化
1.5.1 单因素试验
研究培养基成分及培养条件对GS115/pPIC9K-Rha-gcw61菌株发酵后α-L-鼠李糖苷酶活力的影响。将一级种子液分别接种至YPD、YPG、BMGY、MGY、SOC培养基中,并优化培养基成分和接种量,包括碳源种类(葡萄糖、甘油、果糖、乳糖、麦芽糖、蔗糖)及含量(0.5%、1.0%、1.5%、2%,质量分数)、接种量(1.0%、1.5%、2%、2.5%、3%,体积分数)、氮源种类[蛋白胨、玉米浆、(NH4)2SO4、NH4H2PO4]及含量(1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%,质量分数)。按照1.3节所述方法对菌株发酵培养,并测定OD600和酶活力。
1.5.2 响应面试验
在单因素试验基础上,采用响应面试验探究不同因素间的相互作用,以进一步优化培养条件。各因素及水平如表1所示。
表1 响应面因素与水平 单位:%
Table 1 Factor and level of response surface experiment
因素-10+1A:甘油11.52B:(NH4)2SO422.53C:接种量22.53
1.6 发酵罐水平扩大培养
使用5 L发酵罐对GS115/pPIC9K-Rha-gcw61菌种进行扩大培养。使用YPD平板和BMGY培养基制备一级和二级种子液。二级种子液以7%接种量(体积分数)加入发酵罐,培养基中补加4.35 mL/L的无菌PTM1微量元素,在1 000 r/min、30 ℃、pH 5.0、通气比2 vvm下进行前期发酵并检测溶氧(dissolved oxygen,DO)水平。甘油消耗完毕后,以6 mL/h速率进行50%甘油流加,根据菌体适应情况缓慢增加流速,维持DO>20%,菌体达180～220 g/L后转入饥饿阶段。饥饿1 h后,以4～8 mL/h流加含PTM1的甲醇进行产酶诱导,当酶活力降低时终止培养。同时探究DO水平(20%、30%、40%)对酶活力的影响[8,22]。
1.7 α-L-鼠李糖苷酶对芦丁的转化
准确称取50、75、100、125、150 mg芦丁,各加入1 mL 50 mmol/L柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液(pH 5.0),配制质量浓度为50～150 g/L的芦丁底物,随后加入20 μL DMSO提高其溶解度,各增加1.8 U/mL酶液,40 ℃反应48 h,每12 h取样,并加入DMSO终止反应,使用HPLC测定体系中的芦丁和异槲皮素含量。仪器条件:流动相A:乙腈,流动相B:体积分数为0.4%醋酸水溶液,进样量5 μL,流速1 mL/min,检测波长260 nm,柱温40 ℃。以不同浓度的芦丁和异槲皮素标准品绘制标准曲线[5]。
1.8 α-L-鼠李糖苷酶的固定化及酶学性质研究
将1%的琼脂和1%卡拉胶(质量分数)溶解,并于121 ℃灭菌15 min,加入终质量分数为2%的菌体混匀,将混合液放在冰上固化15 min。得到的凝胶在0.3 mol/L的KCl溶液中浸泡30 min,用刀切成小块,再用去离子水清洗;将颗粒悬浮在含有0.3 mol/L的KCl中,冰上孵育10 min,用0.3 mol/L的KCl溶液洗涤颗粒,再用去离子水清洗,4 ℃保存备用。
取适量固定化α-L-鼠李糖苷酶于EP管中,分别在40、50、60、70、80 ℃下检测酶活力,探究固定化酶的最适温度和温度耐受性。将固定化酶分别在pH 3、4、5、6、7下检测酶活力,探究固定化酶的最适pH和pH稳定性;将固定化酶置于50 mmol/L柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液(pH 5)中,4 ℃条件下储存,每10 d取样测定酶活力,探究其储存稳定性[23]。
1.9 数据分析
实验重复3次,结果以“平均值±标准差”表示,使用Design Expert进行响应面试验设计与数据分析,Origin进行绘图。使用SPSS进行显著性差异分析(P<0.05)。
2 结果与分析
2.1 GS115/pPIC9K-Rha-gcw61摇瓶培养工艺优化
2.1.1 单因素试验
在摇瓶水平探究了培养基及培养条件对GS115/pPIC9K-Rha-gcw61生长及α-L-鼠李糖苷酶活力的影响。培养基种类对菌株的生物量和酶活力影响显著,其中毕赤酵母在YPG培养基中OD600值最高,可达14.0(图1-a),这是由于毕赤酵母的发酵周期较长,甘油作为迟效碳源更有利于其生长[24]。而BMGY培养发酵后的酶活力最高,达48 U/mL,推测BMGY培养基中的氮源更为丰富,有利于重组蛋白的合成。因此,选用BMGY培养基进行后续的优化。
a-培养基种类;b-碳源种类;c-接种量;d-碳源质量分数;e-氮源种类;f-氮源质量分数
图1 不同培养条件对GS115/pPIC9K-Rha-gcw61 OD600及α-L-鼠李糖苷酶酶活的影响
Fig.1 Effects of different cultivation conditions on the OD600 of GS115/pPIC9K-Rha-gcw61 and activity of α-L-rhamnosidase
对BMGY培养基的组分及浓度进行了优化。首先探究了碳源种类对发酵产酶的影响,结果表明以甘油为碳源,毕赤酵母的生物量、浓度和α-L-鼠李糖苷酶活力均达到最大值(图1-b)。推测是由于以蔗糖、果糖等碳源经糖酵解产生的ATP较少,且生成的乙醇和CO2会抑制毕赤酵母的生长;而毕赤酵母在代谢甘油过程中产生更多ATP,能量供应充足,促进细胞生长;另外,甘油作为相容性溶质,有助于抵抗渗透压、维持细胞稳定和蛋白表达[25-26]。因此,选择甘油作为培养基碳源。
进一步研究了不同接种量对菌株发酵产酶的影响。结果显示,接种量为2.5%时,菌株的生物量和酶活力达到最高,分别为13 U/mL和58 U/mL(图1-c)。这是由于较高接种量可加快发酵启动和菌体生长,但是接种量更高则可能造成营养消耗过快和代谢产物积累,从而影响酶的产量。
探究了甘油添加量对毕赤酵母发酵产酶的影响。当甘油添加量为1.5%时,OD600和酶活力达到最高,分别为13.5 U/mL和65 U/mL(图1-d)。表明适量甘油可为毕赤酵母提供能量和碳骨架,促进细胞生长和重组蛋白的合成;但甘油含量过少,会导致菌体饥饿,影响蛋白表达,甘油含量过高,可能导致渗透压应激,抑制菌体生长[26]。
氮源是影响毕赤酵母发酵的重要因素,探究了有机氮源和无机氮源对菌体生长和酶活力的影响。蛋白胨可显著提升菌体生物量(OD600=11.2),但以(NH4)2SO4为氮源时酶活力最高(125 U/mL)(图1-e)。推测菌体过度生长可能与产酶存在能量竞争,而无机氮源能促进酶合成[27]。结合BMGY培养基特性,选择(NH4)2SO4为氮源用于后续优化。
氮源添加量对毕赤酵母生长和酶活力的影响如图1-f所示。(NH4)2SO4的质量分数为2.5%时,菌体OD600和酶活力达最高,分别为11 U/mL和136 U/mL。这是由于氮源浓度过低会导致细胞代谢失衡和酶活力下降,而过高则易造成菌体过度生长、自溶及pH升高,不利于蛋白表达。因此确定(NH4)2SO4的质量分数为2.5%。
2.1.2 响应面试验
根据单因素试验结果,选取甘油添加量(A)、(NH4)2SO4添加量(B)、接种量(C)这3个对毕赤酵母发酵产酶显著影响的因素作为自变量,以酶活力为响应值(Y),利用Design-Expert软件设计三因素三水平的响应面试验,实验设计和结果如表2所示。
表2 Box-Behnken设计方案及结果
Table 2 Design of Box-Behnken and corresponding results
甘油添加量/%(NH4)2SO4添加量/%接种量/%酶活力/(U/mL)11.523105212.5313331.5229241.52.52.51615122.56861.5339371.52.52.51658132.57191.52.52.51621022.53154111.52.52.51601222.5214213232.58414222.5801512.52121161.53288171.52.52.5166
采用Design-Expert软件对实验数据进行方差分析,结果如表3所示。各因素与响应值间的回归模型方程为:Y=-1 834.92+278.55A+1 316.75B+96C+1AB-4.807 17e-14AC-8BC-88.1A2-260.1B2-13.1C2。模型的P值小于0.000 1,决定系数R2为0.993 6,说明回归模型显著,酶活力实测值和预测值拟合度较好,可用此模型预测甘油添加量、(NH4)2SO4添加量、接种量对酶活力的影响。其中A、C、A2、B2的P值均小于0.05,表明其是显著模型项,对酶活力有显著影响,而AB、AC和BC对响应值的影响并未达到显著水平,说明不同因素之间存在相互作用。各因素对响应值的影响可通过方差分析中的F值评价,F值越大,说明对响应值的影响越显著,故不同因素对酶活力的影响顺序为:甘油添加量>接种量>(NH4)2SO4添加量。
表3 响应面模型的方差分析表
Table 3 Analysis of variance table for response surface model
类型平方和自由度均方F值P值模型21 623.9892 402.66125.94<0.000 1A561.131561.1329.410.001 0B10.13110.130.530 70.490 0C220.501220.5011.560.011 4AB0.250 010.250 00.013 10.912 1AC0.000 010.000 00.000 01.000 0BC16.00116.000.838 60.390 2A22 042.5312 042.53107.06<0.000 1B217 803.16117 803.16933.15<0.000 1C245.16145.162.370.167 8残差值133.55719.08失拟项106.75335.585.310.070 2净误差26.8046.70总变异21 757.5316
对结果进行多元回归分析,得到不同因素对酶活力交互影响的等高线图和响应面图(图2)。等高线的曲,表明3个因素两两存在交互作用。当甘油添加量为1.59%,(NH4)2SO4添加量2.49%,接种量2.90%时,α-L-鼠李糖苷酶的酶活力最大,可达到165.7 U/mL。对实验结果进行验证,实际测定的平均酶活力为170 U/mL,比优化前提高了70%,实测值与预测值接近,证明了响应面模型可靠,可以有效用于优化发酵产酶条件。
a-(NH4)2SO4和甘油;b-接种量和甘油;c-接种量和(NH4)2SO4
图2 两因素交互影响的等高线和响应面图
Fig.2 Isocontours and response surface plots of the interaction between two factors
2.2 发酵罐水平扩大培养
2.2.1 发酵罐培养过程中OD600和酶活力变化
以上述优化的BMGY为种子培养基,并放大至5 L发酵罐体系开展补料分批培养,以进一步提升α-L-鼠李糖苷酶活力。当发酵20 h时,溶氧快速上升,表明碳源已耗竭,此时开始补料甘油。结果表明补料5 h后湿菌重达到190 g/L,表明分批补料对细胞积累有显著的促进作用。随后,停止补料并饥饿1 h,以确保甘油耗尽,以调整细胞状态,便于后续的诱导表达;随后流加甲醇进行诱导以分泌α-L-鼠李糖苷酶,其酶活力呈现先迅速上升,后增长缓慢并下降的趋势。可能是由于发酵后期产生的蛋白酶,使α-L-鼠李糖苷酶部分降解,从而降低产物的稳定性和总酶活力。当发酵86 h时,OD600、湿菌重和酶活力分别为132、295 g/L和944 U/mL,酶活力为摇瓶发酵时的5.6倍(图3)。表明通过发酵工艺优化和分批补料策略可有效提高α-L-鼠李糖苷酶的表达水平。
a-OD600;b-湿菌重;c-酶活力
图3 发酵罐培养过程中GS115/pPIC9K-Rha-gcw61的OD600和α-L-鼠李糖苷酶活力变化
Fig.3 Changes in OD600 of GS115/pPIC9K-Rha-gcw61 and activity of α-L-rhamnosidase during fermentation tank cultivation
2.2.2 溶氧水平对菌株生长和酶活力的影响
采用DO-stat动态调控策略进一步优化发酵过程,探究在不同DO水平对菌株生长和酶活力的影响。结果表明当DO为30%时,发酵86 h后酶活力和菌种浓度最高,酶活力可达到1 380 U/mL,比优化前提高了68%,显著高于王德庆[28]报道的17.08 U/mL和分子优化后的53.84 U/mL;OD600达到190,比优化前提高了69%,湿菌重达352 g/L,比优化前提高了84%(图4)。这是由于合适的DO值有利于菌株生长促进三羧酸循环和氧化磷酸化,提供充足ATP支持细胞生长和蛋白合成,但是DO过高可能会导致内质网应急,干扰外源蛋白的正确折叠,而低溶氧会导致电子传递链受阻,ATP合成不足,细胞生长受限[29-30]。与优化前相比,通过精准调节溶氧对DO-stat动态调控,有效提升了菌体的生物量和α-L-鼠李糖苷酶的表达量,表明溶氧调控也是影响发酵的关键因素。同时,仅通过补料策略提升有限,而溶氧与补料协同优化可以显著提升菌株的表达潜力。
a-OD600;b-湿菌重;c-酶活力
图4 不同DO水平对GS115/pPIC9K-Rha-gcw61生长和α-L-鼠李糖苷酶活力的影响
Fig.4 The effect of different DO levels on the OD600 of GS115/pPIC9K-Rha-gcw61
2.3 α-L-鼠李糖苷酶对芦丁的转化
探究了发酵产生的α-L-鼠李糖苷酶在芦丁转化中的应用。结果表明α-L-鼠李糖苷酶可有效将芦丁转化为异槲皮素(图5)。当芦丁质量浓度为50、75 g/L时,转化率在24 h内达到90%以上,随着底物浓度的增加,转化为异槲皮素的效率降低,可在48 h内将90%以上的芦丁(质量浓度为100～150 g/L)转化。这是由于芦丁在水中的溶解度有限,部分已溶解的芦丁转化为异槲皮素后,剩余芦丁才能溶入水中进行转化,导致芦丁浓度越高,转化为异槲皮素所需的时间越长[14]。α-L-鼠李糖苷酶对高浓度芦丁仍具良好转化能力,但如何进一步缩短高底物浓度下的转化时间,提升整体转化效率,仍需进一步研究。
图5 α-L-鼠李糖苷酶对不同质量浓度芦丁的转化
Fig.5 Transformation of different concentrations of rutin by α-L-rhamnosidase
2.4 固定化α-L-鼠李糖苷酶的酶学性质研究
采用固定化方法提高α-L-鼠李糖苷酶的稳定性和使用次数,并研究其酶学性质。随着温度升高,固定化酶活力呈现先升高后降低的趋势,当温度为60 ℃时,固定化酶的酶活力最高,随后随着温度的升高,固定化酶的活性开始降低,此时酶蛋白的活性中心可能因受热失活,因此,固定化酶的最适反应温度为60 ℃(图6-a)。固定化α-L-鼠李糖苷酶在30～60 ℃时酶活力较高,说明固定化酶有较好的温度稳定性,当温度高于60 ℃时,酶活力下降较快(图6-b)。研究了固定化酶的最适pH,其酶活力随pH的升高呈现先升高后降低的趋势,当pH值为5时酶活力最高(图6-c)。进一步研究其pH稳定性,当pH<4时,酶活力随着pH的升高而升高,当pH>4时,酶活力逐渐降低,表明固定化酶在pH=4时稳定性较好(图6-d)。与游离酶相比,固定化α-L-鼠李糖苷酶不仅表现出更高的温度和pH稳定性,还能在较宽的反应条件范围内保持较高活性,显著提升了其工业价值。固定化α-L-鼠李糖苷酶的酶活力随着储存时间的增加缓慢降低,在储存60 d时,相对酶活力为68%(图6-e),具有较好的储存稳定性,便于长期保存,其综合性能更适合工业化生产需求。后续可通过优化固定化方法及条件,持续提升其稳定性和重复使用次数,使其更适合连续生产和工业化应用。
a-固定化酶的最适温度;b-温度稳定性;c-固定化酶的最适pH;d-pH稳定性;e-储存稳定性
图6 固定化α-L-鼠李糖苷酶的酶学性质
Fig.6 Enzymatic properties of immobilized α-L-rhamnose glycosidase
3 结论
针对α-L-鼠李糖苷酶在工业化生产中存在发酵生产成本高和游离酶不能重复利用的问题。本研究从摇瓶和发酵罐水平优化了工程菌GS115/pPIC9K-Rha-gcw61的发酵工艺以提高α-L-鼠李糖苷酶活力,研究其在芦丁转化中的应用,并采用固定化法进一步提高了酶的储存稳定性。结果表明使用BMGY培养基,1.59%甘油,2.49% (NH4)2SO4,在2.90%接种量下,酶活力提升至170 U/mL。发酵罐培养表明在发酵时间86 h,30%溶氧下,酶活力达1 380 U/mL,是摇瓶培养的8.12倍。使用发酵后酶液对芦丁转化以生成异槲皮素,当芦丁质量浓度低于75 g/L时,转化率可在24 h内达到90%以上,在较高质量浓度(100、125、150 g/L)下,转化率可在48 h内达到90%以上。固定化α-L-鼠李糖苷酶的最适温度为60 ℃,最适pH值为5,在4 ℃下储存50 d,固定化酶的酶活力可保留70%以上,具有较好的储存稳定性。本研究为α-L-鼠李糖苷酶的高效制备及在工业中的应用提供了理论依据和工艺支撑。
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