壳聚糖是甲壳素的脱乙酰化产物,是一种线性多糖,由N-乙酰氨基葡萄糖[N-acetyl-D-(+)-glucosamine,GlcNAc]和氨基葡萄糖(glucosamine,GlcN)组成,通过β-1,4-葡萄糖苷键连接,具有多种生物活性[1-2],如抗真菌活性[3]、抗氧化活性[4]、抗病毒活性[5]等。壳聚糖的高相对分子质量和高聚合度导致其在中性pH下的溶解度较低。壳聚糖易溶于弱酸,但溶解后壳聚糖溶液黏度较高。壳聚糖溶液的高黏度是其在食品、化妆品、农业和健康工业的主要限制因素[6-9]。因此,为了获得分子尺寸更均匀、更易溶解的壳聚糖,有必要将壳聚糖转化为低聚物。聚合度<20、相对分子质量<3.9 kDa的壳聚糖称为壳寡聚体、壳寡糖[10]。

酶法制备是生产具有更高生物活性物质壳寡糖最有前途的方法[11]。壳聚糖酶(EC 3.2.1.132)是一种催化壳聚糖中β-1,4-键断裂形成壳寡糖的酶[12]。在碳水化合物活性酶(carbohydrate-active enzymes,CAZy)数据库中,壳聚糖酶通常分为GH-5、GH-7、GH-8、GH-46、GH-75和GH-80这6个糖苷水解酶家族[13]。GH-46、GH-75和GH-80目前仅含有壳聚糖酶,特别是GH-46家族的壳聚糖酶主要来自细菌,真菌壳聚糖酶主要分布在GH-75家族[14]。

提高酶解产物的产量可以从对酶本身的性质与反应底物的性质2个方面进行研究。本研究利用壳聚糖为碳源诱导Bacillus BC-X5发酵产生胞外壳聚糖酶Csn1,并且对Csn1进行了纯化。对Csn1的生化特性进行了研究。选取了几种壳聚糖底物,并对底物进行了傅里叶红外、X射线衍射以及凝胶渗透色谱分析[15-17]。利用薄层色谱法[18]对该壳聚糖酶的作用模式进行分析。采用HPLC[19]及凝胶渗透色谱对Csn1降解不同壳聚糖底物的过程进行检测,以期为工业化酶法生产壳寡糖提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

SDS、Tris(分析纯),Solarbio公司;乙酸、乙酸钠、3,5-二硝基水杨酸(3,5-dinitrosalicylic acid,DNS)、EDTA、硫酸铵、考马斯亮蓝R-250、粉末壳聚糖(100目,脱乙酰度80%左右,重均分子质量=100 000)(分析纯),国药集团化学试剂有限公司;粉末壳聚糖(100目,脱乙酰度80%左右,重均分子质量=150 000)、D-氨基葡萄糖盐酸盐(分析纯),上海麦克林生化科技有限公司;薄层层析硅胶板,烟台江友硅胶开发有限公司;壳二糖～壳六糖标品[(GlcN)2～(GlcN)6],(含量≥95%),上海鸿永生物科技有限公司;透析袋(8 kDa),上海源叶生物科技有限公司;DEAE FF 16/10、Superdex-75 10/300 GL预装柱,美国Bio-RAD Laboratories公司;Modified Bradford Protein Assay Kit分析试剂盒,生工生物工程(上海)股份有限公司;超滤离心管(10 kDa),德国Merck Millipore公司。

1.2 实验仪器

HH-S数显恒温水浴锅,常州市金坛友联仪器研究所;K10219D酶标仪,美国Bio Tek Instruments公司;NGCTM3rd Story Expansion Frame蛋白纯化仪,美国Bio-RAD Laboratories公司;Thermo Scientific Nicolet iS10型红外光谱仪,赛默飞世尔科技有限公司;Mini Flex 600X射线衍射分析仪,日本理学公司;Prominence LC-20AD,日本岛津公司;FD-1A-50真空冷冻干燥机,博医康(北京)仪器有限公司;10 kDa切向流超滤膜包系统Vivaflow200,赛多利斯斯泰帝生物技术公司。

1.3 菌种及培养基

本研究使用的菌株为Bacillus BC-X5,保藏于本实验室。该菌在牛肉膏蛋白胨固体斜面上4 ℃保存。

产酶培养基(g/L):胶体壳聚糖6.0、(NH4)2SO4 6.782、KH2PO4 0.879、乳糖6、大豆蛋白4、NaCl 4.5、MgSO4·7H2O 0.9、K2HPO4 0.7,pH 6.5。

1.4 实验方法

1.4.1 酶活性的测定方法

使用经过修改的DNS法[20]。将200 μL酶液加入800 μL 10 mg/mL的壳聚糖底物(壳聚糖溶于0.05 mol/L pH 5.4的醋酸-醋酸钠缓冲液)混匀,50 ℃反应20 min。反应结束后立即加入1.5 mL的DNS溶液,沸水浴10 min后冰水迅速冷却,用去离子水稀释5倍。以灭活的粗酶液(上清液100 ℃水浴10 min)作为空白对照,540 nm处测定吸光值,每组3个平行,取平均值。以D-氨基葡萄糖盐酸盐作为标准曲线,计算酶和底物反应的还原糖量。酶活性单位(U):一定条件下,每mL酶液每min释放生成还原糖的物质的量(μmol)。

1.4.2 蛋白浓度的测量

使用分析试剂盒,以牛血清白蛋白为标准品,采用Bradford方法测定蛋白质浓度。

1.4.3 粗酶液的制备

用接种环刮取2环接种于液体牛肉膏蛋白胨培养基,37 ℃、180 r/min培养12 h活化。取2 mL活化后的培养液转接于50 mL液体牛肉膏蛋白胨培养基培养8 h得到种子液。以7%接种量将种子液接种至250 mL锥形瓶中,其中含有50 mL的产酶培养基,初始pH 6.5,30 ℃,200 r/min 发酵48 h。将发酵液8 000 r/min,4 ℃ 离心10 min,取上清液用于酶的纯化。

1.4.4 酶的分离纯化

所有步骤均在低于4 ℃的条件下进行。将培养液(8 000 r/min,10 min)离心后,得到上清液,在冰浴条件下向上清液中缓慢加入(NH4)2SO4固体至70%饱和,4 ℃静置过夜。8 000 r/min离心15 min,收集沉淀物,重新溶解在pH 7.0的50 mmol/L的Tris-HCl缓冲液中,8 000 r/min离心15 min后除去不溶残留物。经过透析袋(8 kDa)透析脱盐、酶液经0.22 μm水系滤膜过滤后,用10 kDa切向流超滤膜包系统Vivaflow200浓缩,然后进入DEAE FF 16/10层析柱,用50 mmol/L pH 8.5 Tris-HCl缓冲液平衡,以50 mmol/L pH 8.5 Tris-HCl缓冲液中含有的0～1.0 mol/L NaCl的线性梯度洗脱收集吸附的蛋白质,用离心超滤管(10 kDa截流)浓缩。将浓缩物装入Superdex-75 10/300 GL层析柱,用pH 7.0的50 mmol/L 的Tris-HCl缓冲液进行洗脱,收集有酶活性的组分进行冷冻干燥,-80 ℃保存。并命名为Csn1。

1.4.5 SDS-PAGE

使用浓缩胶(质量分数15%的聚丙烯酰胺)和分离胶(质量分数12%的聚丙烯酰胺)进行的SDS-PAGE预估壳聚糖酶的相对分子质量。使用考马斯亮蓝R-250染色。

1.4.6 Csn1的特性研究

壳聚糖酶Csn1与底物在50 ℃下反应20 min,研究Csn1的最适pH,采用不同的缓冲液、50 mmol/L醋酸-醋酸钠缓冲液(pH 3.0～6.0)、50 mmol/L Tris-HCl缓冲液(pH 6.0～9.0)和50 mmol/L 甘氨酸-NaOH缓冲液(pH 9.0～10.0)。为研究酶的pH稳定性,将该酶在上述缓冲液(pH 3.0～10.0)中37 ℃孵育1 h,然后测定酶的残余活力。研究Csn1的最适温度,在30～80 ℃,在50 mmol/L磷酸盐缓冲液(pH 7.0)中测定了最适温度。在30～80 ℃不同温度下孵育1 h,测定了酶的热稳定性,并测定了酶的残余活力。在热失活方面,将酶在50 mmol/L磷酸盐缓冲液中(pH 7.0)在不同温度(45、50、55 ℃)下分别孵育1、2、4、6、12、24 h,然后检测其剩余活力。一系列金属离子(Na+、K+、Co2+、Cu2+、Mg2+、Ca2+、Mn2+、Zn2+、Fe3+、Sr2+)和化学物质(SDS,Na2EDTA)以10 mmol/L的浓度加入反应混合物中,考察它们对酶活力的影响。

1.4.7 Csn1的作用模式分析

采用薄层色谱法对该壳聚糖酶的水解模式进行分析。纯化后的壳聚糖酶30 μL分别与70 μL 5 g/L不同聚合度的壳寡糖底物(GlcN)2～(GlcN)6混合,在pH 5.5,45 ℃孵育24 h,取样时间分别为0.25、0.5、1、4、8、12、24 h。取等量的反应混合物装于硅胶板上。展开剂为乙酸乙酯∶乙醇∶水∶氨水=5∶5∶4∶0.3(体积比),显色剂为2 mg/mL茚三酮/乙醇溶液。

1.4.8 壳聚糖样品的制备

壳聚糖底物的结晶度影响酶解作用[21]。当结晶度较低时,壳聚糖分子间相互作用减弱、结构更加无序和松散,有利于酶与底物相结合,从而促进酶解作用[22]。本研究在前期筛选发酵培养基成分时发现,壳聚糖底物经过弱酸溶解后,其结晶度会一定程度的降低,且壳聚糖酶活性有所提高。因此对不同粉末壳聚糖底物同时制备为胶体壳聚糖底物,来探究Csn1的最适酶解底物。

28 g NaOH溶解于40 mL蒸馏水中,加入1 g壳聚糖粉末,100 ℃搅拌反应6 h,清洗至中性烘干,制得脱乙酰度>90%的壳聚糖粉末样品。壳聚糖底物a为粉末壳聚糖(100目,脱乙酰度80%左右,重均分子质量=100 000),壳聚糖底物c为壳聚糖底物a利用该方法制备得。壳聚糖底物e为粉末壳聚糖(100目,脱乙酰度80%左右,重均分子质量=150 000),壳聚糖底物g为壳聚糖底物e利用该方法制备得。

1 g壳聚糖粉末溶解于30 mL 0.3 mol/L盐酸中,搅拌使其完全溶解,加适量水稀释,用0.2 mol/L NaOH溶液调至中性使壳聚糖析出,收集壳聚糖沉淀,清洗干净后冷冻干燥,制得胶体壳聚糖样品。壳聚糖底物b和壳聚糖底物f为壳聚糖底物a、壳聚糖底物e利用该方法制备得的胶体壳聚糖底物,壳聚糖底物d和壳聚糖底物h为壳聚糖底物c、壳聚糖底物g利用该方法制备得的高脱乙酰度胶体壳聚糖底物。

1.4.9 壳聚糖样品脱乙酰度的测量

采用傅里叶红外光谱分析。测试仪器为红外光谱仪,测样方式为衰减全反射法,扫描次数16次,扫描范围4 000～525 cm-1,分辨率为4 cm-1。脱乙酰度按公式(1)[23]计算:

脱乙酰度

(1)

式中:A1320、A1420分别表示样品在1 320、1 420 cm-1处的吸光值。

1.4.10 壳聚糖样品的结晶度测量

X射线衍射分析在具有铜靶辐射(λ=1.540 6)的射线衍射分析仪上测定(40 kV,40 mA)。扫描范围2θ=5°～40°,扫描速度为5 °/min。结晶度按照公式(2)计算[24]:

结晶度指数

(2)

式中:I110,(110)晶面(2θ≈20°)的最大衍射强度;Iam,2θ≈16 °处非结晶区的衍射强度。

1.4.11 酶解产物的分析

将1.4.8节中制备的壳聚糖底物,分别用pH 5.5的50 mmol/L醋酸-醋酸钠缓冲液配制为10 mg/mL浓度备用。纯化后的壳聚糖酶Csn1 0.2 mL与0.8 mL壳聚糖底物在45 ℃下水浴反应,以灭活后的酶为对照,进行后续酶解产物的分析研究。

样品的重均分子质量由凝胶渗透色谱测定。色谱柱:TSK guardcolumn PWXL和TSK G5000-PWXL联柱。流动相为0.2 mol/L醋酸/0.1 mol/L醋酸钠溶液,流速0.5 mL/min,柱温保持30 ℃,RID-10A示差折射检测器检测。测试样品质量浓度为2 mg/mL,TOSOH pullulan为分子质量标准,进行数据处理得到重均分子质量。

用HPLC仪分析壳聚糖产物。采用视差检测器,色谱柱为氨基糖柱,以乙腈-蒸馏水(体积比7∶3)为洗脱液,流速1 mL/min,柱温30 ℃。

2 结果与分析

2.1 壳聚糖酶的纯化

正粗酶液经盐析及层析后的分离纯化结果如表1所示。经过上述分离纯化步骤后,壳聚糖酶的纯化倍为8.5倍,比酶活性为(11.9±1.5) U/mg。

收集的洗脱液经过SDS-PAGE分析,结果如图1所示,泳道5～7在44.3 kDa附近有明显条带,说明纯化效果较好且纯度较高,选用纯化后的蛋白进行后续酶学性质研究。

2.2 壳聚糖酶Csn1的酶学特性研究

由图2可知,Csn1在45～55 ℃的整个温度范围内观察到最高的活性,并在55 ℃下最高(图2-a),该酶在不同温度下孵育1 h后,在30～55 ℃内保持了80%以上的最大活性(图2-b)。酶的热失活结果表明,Csn1在45、50、55 ℃的半衰期分别为24、12、2 h(图2-c)。后续长时间反应可选择45 ℃为反应温度。

Csn1在pH 5.5的醋酸-醋酸钠缓冲液中显示出最大的催化活性(图2-d),pH<5.5时酶活性随着pH上升而增加,pH>5.5时酶活性随着pH的升高而降低。在pH=8.0时酶活性基本上完全丧失。在pH 5～7、37 ℃条件下孵育1 h后仍保持约80%的初始酶活性(图2-e)。

测定了不同金属离子和化学物质对Csn1活性的影响(表2)。结果表明Mn2+对酶促反应是促进作用,Na+、K+和Mg2+对酶促反应基本无影响,Fe3+、Ca2+、Cu2+、Co2+和Sr2+对酶促反应有抑制作用。EDTA对酶促反应有抑制作用,SDS对酶促反应基本无影响。

2.3 壳聚糖酶Csn1的作用模式

利用该酶对壳低聚糖进行水解反应,并用薄层色谱法进行产物分析,由图3-a～图3-c可知,该壳聚糖酶与(GlcN)2、(GlcN)3和(GlcN)4反应后都未检测出新的壳低聚糖产物。由图3-d、图3-e可知,该酶与(GlcN)5底物生成(GlcN)2和(GlcN)3产物,而(GlcN)6底物生成(GlcN)2、(GlcN)3和(GlcN)4产物。从而可推断出该壳聚糖酶具有内切酶活性,并且与壳聚糖反应位点至少为还原端起5个单位。

2.4 壳聚糖底物样品的表征

本研究所选用的壳聚糖样品中,壳聚糖a与壳聚糖样品e为2种不同来源的商品壳聚糖粉末;样品c与样品g分别为以样品a与样品e为原料利用热碱法制得的高脱乙酰度的壳聚糖粉末;样品b、d、f、h分别为以样品a、c、e、g为原料制得的胶体壳聚糖。

如图4所示,壳聚糖的特征谱带包括在1 655 cm-1处能观测到酰胺Ⅱ带;在1 560 cm-1处观测到酰胺Ⅱ带以及在1 320 cm-1处观测到酰胺Ⅲ带。通过1.4.9节中的公式计算可得各个样品的脱乙酰度(表3)。结合表3的脱乙酰度结果与图4的红外图谱可知,随着样品脱乙酰度的升高,其在1 655 cm-1处的峰强度会逐渐减弱,而1 560 cm-1处的峰强度会随脱乙酰度的增加而增加。这与HWANG等[25]的实验结果一致。

如图5所示,壳聚糖原料在2θ=10.4°、19.8°显示了2个特征峰,呈现了“L-2 polymorph”晶型衍射。壳聚糖底物c和g在2θ=21.4 °处出现了新的衍射峰,呈现了“tendon hydrate polymorph”晶型衍射图[26]。随着分子质量的降低与脱乙酰度的增加,壳聚糖底物c和g在2θ=10.4°、19.8°处衍射峰强度有所增加。说明壳聚糖脱乙酰度增加与分子质量降低会提高壳聚糖的结晶度,与表3结晶度结果一致。

如表3所示,比较底物a和底物c、底物e与底物g的脱乙酰度、重均分子质量和结晶度,结果表明,热碱法脱乙酰可以降低壳聚糖的脱乙酰度,但同时会使壳聚糖底物的重均分子质量降低与结晶度升高。比较底物a与底物b、底物c与底物d、底物e与底物f、底物g与底物h的脱乙酰度、重均分子质量和结晶度,结果表明,粉末壳聚糖制成胶体壳聚糖可以使其结晶度降低,同时会稍微降低其重均分子质量,但其脱乙酰度几乎保持不变。

2.5 壳聚糖底物酶解过程的凝胶渗透色谱分析

对不同酶解时间反应后的壳聚糖底物进行凝胶渗透色谱分析,比较其分子质量降解情况。由图6可知,壳聚糖样品大都在前4 h内降解较快,后4 h降解缓慢。比较底物b、d、f、h与底物a、c、e、g反应1 h后的分子质量大小(表4、表5),可以看出胶体状态下的壳聚糖底物比粉末状态下底物更容易被Csn1降解,这可能是因为胶体状态下壳聚糖表面产生了空隙更有利于酶促反应进行,同时胶体状态下壳聚糖的结晶度也有一定程度的下降,也能促进酶促反应的进行。结合表3中的壳聚糖底物结晶度检测结果以及底物a、c;b、d;e、g;f、h的分子质量变化,可以看出结晶度的提升使得Csn1的降解速率都有所下降。结果表明,结晶度的升高可能会影响壳聚糖底物与壳聚糖酶的结合,从而影响底物的降解效率。

2.6 壳聚糖底物酶解产物的HPLC分析

对不同酶解时间反应后的壳聚糖上清液进行HPLC分析(图7),结果如图8所示,该酶作用于壳聚糖底物a～h时,壳寡糖的生成速率大都在前4 h内生成较快,后缓慢趋于稳定。这与底物降解的结果类似。壳聚糖底物b的寡糖产量最高,(GlcN)2的产量为1.112 mg/mL,(GlcN)3的产量为1.636 mg/mL,(GlcN)4的产量为0.824 mg/mL。杨云洁[27]研究了工程菌BM103表达的壳聚糖酶降解规律,酶解反应在0～60 min时壳聚糖水解较缓慢,(GlcN)2、(GlcN)3和(GlcN)5含量低,60～180 min时底物平均分子质量迅速降低,此时(GlcN)2、(GlcN)3占比提高,(GlcN)5少量累积。WANG等[28]研究海洋来源的Bacillus paramycoides BP-N07产的壳聚糖酶,酶解4 h后溶液中未检测出壳聚糖,壳寡糖产物为(GlcN)2～(GlcN)4,壳寡糖产物总含量为(4.063±0.288) mg/mL。CHEN等[29]研究了从深海中筛选得到的菌株Streptomyces niveus产的壳聚糖酶,结果表明该酶在37 ℃,pH 6.0条件下得到(GlcN)2最终质量浓度为1.8 mg/mL。综上可得,BC-X5产的壳聚糖酶Csn1制备(GlcN)2～(GlcN)4的得率较高,且反应速度快,具有一定的应用前景。

3 结论与讨论

本文从芽孢杆菌BC-X5的发酵上清液中,通过硫酸铵盐析、脱盐、弱阴离子离子交换层析、分子筛层析纯化出一种分子质量约为40 kDa的壳聚糖酶,该酶最适反应温度为55 ℃,最适pH值为5.5,Mn2+对酶反应有促进作用。对所制得的壳聚糖底物和商品壳聚糖底物进行酶解实验。考察了不同壳聚糖底物在不同酶解时间下壳聚糖底物分子质量的变化和壳寡糖产物的生成量。结果显示,壳寡糖的生成速率和底物分子质量降低速率大多在前4 h内较快,后缓慢趋于稳定。以商品壳聚糖(重均分子质量=100 000,脱乙酰度80%)为原料所制得的胶体壳聚糖为底物时所生成的寡糖产量最高,(GlcN)2的产量为1.112 mg/mL,(GlcN)3的产量为1.636 mg/mL,(GlcN)4的产量为0.824 mg/mL。结果表明该酶反应速度快,且(GlcN)2～(GlcN)4产量较高,有一定的工业化应用前景。

壳寡糖具有更高的商业价值与应用前景,但目前酶法生产壳寡糖产量较低,因此高效制备壳寡糖已经成为酶法制备壳寡糖的关键。本研究从酶Csn1的最适反应条件与底物选择2个方面进行研究,提高了制备壳寡糖的得率与效率,为工业化酶法生产壳寡糖提供了参考。后续可以考虑从提高该酶的热稳定性以及筛选出更加合适的底物等方面来进一步提高酶法制备壳寡糖的产量与效率。

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Characterization of chitosanase produced by Bacillus BC-X5 and study on chitosan oligosaccharides preparation

DONG Yunpeng, CAI Jun*

(School of Life and Health Sciences, Hubei University of Technology, Wuhan 430000, China)

ABSTRACT The yield of chitosan oligosaccharides (COS) produced by enzymatic hydrolysis can be enhanced by optimizing both the enzyme characteristics and the selection of suitable substrates.In this study, a chitosanase with an approximate molecular weight of 40 kDa was purified from the fermentation broth of a Bacillus strain using ammonium sulfate precipitation, DEAE FF 16/10, and Superdex 75 10/300 GL column chromatography.The enzyme exhibited optimal activity at pH 5.5 and remained stable between pH 5.0 and 7.0.Its highest activity was observed at 55 ℃, with stability maintained from 30 ℃ to 55 ℃.Thin-layer chromatography analysis revealed that the enzyme hydrolyzed chitosan and COS with a degree of polymerization greater than four, producing primarily (GlcN)2, (GlcN)3, and (GlcN)4.Additionally, two commercially available chitosan powders were utilized to prepare a series of substrates, which were characterized by Fourier transform infrared spectroscopy, X-ray diffraction and gel permeation chromatography.Post-reaction analysis indicated that the chitosan substrate with approximately 80% deacetylation and a molecular weight of 100 000 yielded the highest concentration of oligosaccharides:(GlcN)2 at 1.112 mg/mL, (GlcN)3 at 1.636 mg/mL, and (GlcN)4 at 0.824 mg/mL.These findings suggest that the enzyme’s efficiency is influenced by the substrate’s molecular weight and deacetylation degree.This study provides valuable insights for optimizing enzymatic processes in the industrial production of COS.

Key words chitosanase;enzymatic properties;substrate screening;chitooligosaccharides

DOI：10.13995/j.cnki.11-1802/ts.044396

引用格式：董云鹏,蔡俊.芽孢杆菌BC-X5产壳聚糖酶的表征及壳寡糖制备研究[J].食品与发酵工业,2026,52(11):10-17.DONG Yunpeng, CAI Jun.Characterization of chitosanase produced by Bacillus BC-X5 and study on chitosan oligosaccharides preparation[J].Food and Fermentation Industries,2026,52(11):10-17.

第一作者：硕士研究生(蔡俊教授为通信作者,E-mail:hgdcaijun@hbut.edu.cn)

基金项目：国家自然科学基金项目(32302019);湖北省重点研发项目(2022BBA0053)

收稿日期：2025-09-03,改回日期:2025-10-27