脱氧雪腐镰刀菌烯醇(deoxynivalenol,DON)是一种由镰刀菌属真菌产生的霉菌毒素,广泛污染全球谷物。随着气候变化加剧,温带地区谷物中的DON污染持续恶化。研究发现,全球未加工食用谷类中DON的检出率近60%,远高于联合国粮食及农业组织报告的霉菌毒素总体污染率(约25%)[1-2]。中国作为谷物消费大国,DON暴露在以小麦、玉米为主食的地区尤为突出。一项基于河南省膳食暴露评估的研究提示,约52%成年人的DON及其衍生物暴露水平超过欧洲食品安全局(European Food Safety Authority,EFSA)2017年提出的DON及其衍生物组每日耐受摄入量(group tolerable daily intake,g-TDI)[3-4]。因此,开展基于中国人群的DON风险评估具有重要意义。
目前DON的风险评估主要以小鼠体重增长减少作为关键毒性终点,并据此推导出对应5%效应水平的基准剂量95%置信区间下限[benchmark dose lower confidence limit,BMDL5;0.11 mg/(kg BW·d)][4]。然而近年来DON免疫毒性备受关注,多项研究表明,即使在尚未出现体重增长抑制的剂量下,DON仍可导致免疫功能发生显著改变。例如,体外研究显示DON在nmol浓度即可激活巨噬细胞、调节T细胞功能并扰乱细胞因子分泌[5-6];体内研究也表明在极低剂量[≤25 μg/(kg BW·d)]下,小鼠仍表现出系统性低度炎症(部分外周器官炎症基因上调及血浆IL-1β升高)[7]。提示仅以生长抑制效应为关键毒性终点可能低估DON的健康风险,免疫毒性或可作为DON风险评估关键毒性终点。
DON的风险评估目前主要依赖于动物数据,但由于动物与人类在毒性效应及毒代动力学方面存在显著种属差异,动物结果向人类外推具有不确定性,阻碍风险评估的准确性。为突破基于动物实验的传统风险评估的局限性,欧美等国近年来积极推进新途径方法(new approach methodologies,NAMs),整合多学科技术构建更贴近人体健康效应的评价策略,最终替代动物进行安全评价。在各类NAMs中,人源体外模型可提供高通量、靶器官的毒性数据,但通常缺乏吸收、分布、代谢与排泄(absorption,distribution,metabolism,and excretion,ADME)等体内过程,因此无法直接应用于风险评估。基于生理毒代动力学(physiologically based toxicokinetic,PBTK)模型为解决这一问题提供了重要手段。PBTK模型通过模拟化学物在体内的ADME过程,将外暴露剂量与内暴露浓度相关联,再结合体外毒性数据和基于PBTK模型的反向剂量法,可将体外效应浓度换算为外暴露毒性剂量,据此确定起始点(point of departure,PoD)并推导化学物安全暴露水平,为风险评估提供依据。该策略已被初步验证可用于不同毒性终点的体外至体内的定量外推(quantitative in vitro to in vivo extrapolation,QIVIVE)[8-9]。
本研究拟整合文献数据与实验获得的代谢参数,构建DON中国人PBTK模型;同时收集并整理文献报道的人源免疫细胞的体外毒性数据,并通过基于PBTK模型的反向剂量法将其外推至体内毒性剂量水平,进而预测DON人体免疫毒性效应并推导相应PoDs。本研究旨在建立一种整合人源体外数据与PBTK模型的NAMs评估框架,为DON的健康危害评估与风险评估提供补充证据,有助于阐明谷类DON污染对中国人的健康影响,从而推动NAMs在风险评估中的应用。
1 材料与方法
1.1 中国人PBTK模型构建
本研究在WANG等[10]构建的高加索人DON PBTK模型基础上,针对中国人群的生理和代谢特征进行参数调整和模型优化。利用Berkeley Madonna软件(版本10.6.1;CA,USA)构建中国人DON的PBTK模型,旨在定量表征经口暴露后DON在人体血液及各组织/器官中的ADME过程(图1)。为模拟真实膳食暴露场景,模型采用重复暴露设定以反映DON的内暴露水平。模型构建所需参数主要包括以下三类:1)中国人群的生理与解剖学参数;2)DON的理化参数;3)描述其ADME过程的动力学参数(具体参数及来源详见电子版增强出版附表1～附表3,https://doi.org/10.13995/j.cnki.11-1802/ts.045765)。具体设定如下:口服摄入的DON经胃排空进入肠腔,在肠道组织中的吸收采用一级动力学过程描述,相关吸收速率常数见附表3。体内分布假设为灌注限制型(perfusion-limited),各组织-血浆分配系数(Kp)采用瓦赫宁根大学食品安全研究(Wageningen Food Safety Research,WFSR)开发的QIVIVE工具[11]中集成的Berezhkovskiy算法计算,输入包括分子质量、正辛醇-水分配系数(logP)、解离常数(pKa)、血浆游离分数(fuplasma)等理化参数(见附表2)。既往研究表明DON主要在肝脏经UDP-葡萄糖醛酸转移酶(UDP-glucuronosyltransferases,UGTs)介导的Ⅱ相代谢反应(葡萄糖醛酸化)进行生物转化[12]。鉴于目前缺乏中国人的DON肝脏清除数据,本研究采用体外代谢孵育实验,利用中国人肝微粒体测定DON体外肝脏固有清除率(intrinsic hepatic clearance,CLint)(详见1.2节)。该CLint值结合中国人肝脏微粒体蛋白含量(39.45 mg/g)[13]及肝脏质量外推获得体内肝脏清除率。DON主要经尿液排泄,模型中肾脏清除机制设定为肾小球滤过,滤过率为1.8 mL/(min·kg BW)[14]。
表1 DON基于人体免疫毒性的预测PoDs
Table 1 Predicted PoDs for human immunotoxicity of DON
毒性终点BMDL5/[μg/(kg BW·d)]BMD5/[μg/(kg BW·d)]BMDU5/[μg/(kg BW·d)]文献(CD69+CD25+)T淋巴细胞活化抑制2.686.509.86巨噬细胞替代活化(CD209)抑制74.9094.36134.00炎症因子(IL-1β)分泌抑制20.7072.97108.00[20]炎症因子(TNF-α)分泌抑制31.5060.8486.50炎症信号通路激活(NF-κB报告基因)抑制18.0034.8048.40[21]趋化因子(RANTES)分泌抑制282.00a331.74a414.00a[22]炎症因子(TNF-α)分泌促进8.38a21.90a44.70a[23](CD71+)T淋巴细胞活化抑制21.18b63.54242[24]
注：a最佳模型的AIC比FULL模型的AIC高出2个以上单位,提示模型拟合不足,数据变异较大,结果需谨慎使用;b BMDU/BMDL >10,不确定性较大,参照既往研究做法,用BMD/3代替BMDL值[8]。
图1 DON PBTK模型示意图
Fig.1 Schematic diagram of the PBTK model for DON
1.2 体外肝微粒体孵育
为了获得中国人的DON代谢清除的动力学参数(即CLint),本研究基于PINCKAERS等[15]所述的底物消耗法采用混合性别中国人肝微粒体进行DON的体外孵育试验,具体试剂和仪器信息见附录1.1节。孵育体系总体积为160 μL,包含0.1 mol/L PBS、5 mmol/L尿苷二磷酸葡萄糖醛酸(uridine diphosphate glucuronic acid,UDPGA)、25 μg/mL丙甲菌素及NADPH再生系统(包含1.3 mmol/L NADP+、3.3 mmol/L葡萄糖-6-磷酸、3.3 mmol/L MgCl2、0.4 U/mL葡萄糖-6-磷酸脱氢酶和0.05 mmol/L柠檬酸钠)。DON工作液用甲醇配制,终浓度为50 nmol/L,DMSO终体积分数≤1%,微粒体蛋白终质量浓度为1 mg/mL。将体系于37 ℃恒温振荡水浴锅中预孵育1 min后,加入UDPGA启动反应,对照组加入等体积PBS。随后于37 ℃恒温振荡水浴锅中分别孵育0、2.5、5、10、15、30、60、90 min,反应通过加入160 μL冰甲醇终止,随后18 000×g离心5 min沉淀蛋白,上清液转移至样品管进行液相色谱-串联质谱(liquid chromatography-tandem mass spectrometry,LC-MS/MS)分析(详见附录1.2节)。检测结果参照PINCKAERS等[15]报道的公式(1)计算DON体外CLint。
(1)
式中:V,1 mg微粒体蛋白对应的孵育体系体积,μL/mg pro;t1/2,半衰期,根据ln(2)/k计算,min;k(1/min)为消除速率常数,通过底物浓度自然对数与时间关系的线性回归线斜率计算得到。
1.3 PBTK模型验证及敏感性分析
模型常通过对比文献报告的毒代动力学实测值与模型预测值来进行验证。由于缺乏DON的中国人血液暴露数据,本研究的模型验证基于24 h尿液中游离DON累积排泄量的模型预测值与实测值的比较进行。实测值来源于文献报道的中国成人尿液样本中游离DON平均浓度[3,16],结合人体约1.5 L/d的排尿体积[16],估算24 h游离DON的排泄量。对于文献中的总DON浓度,采用尿液中游离DON占总DON的27.4%作为换算系数[17],对其进行校正以得到相应的游离DON浓度。此外,对模型开展局部敏感性分析,以识别对模型预测静脉血中DON最大浓度(Cmax)影响较大的参数,具体方法详见附录1.3节。
1.4 体外免疫毒性数据收集
本研究以“(Deoxynivalenol)AND(Immunotoxicity)”为检索词在PubMed数据库中检索DON在体外人源免疫细胞模型中开展的免疫毒性相关研究并以EFSA报告[4]作为补充资料,使用WebPlotDigitizer(版本4.8)提取DON引起免疫毒性的浓度-反应数据[18],并根据对照组数据对所有处理组数据进行标准化处理。文献数据的筛选遵循以下标准:1)毒性终点指标能体现免疫细胞功能或状态改变(如细胞因子/趋化因子分泌水平、表面活化/分化标志物表达、关键免疫信号通路的激活状态等);2)至少包含4个剂量组(包括对照);3)至少有1个剂量组数据具有统计学显著性,且具有明确的浓度-反应关系;4)数据至少来自2次独立实验。
1.5 基于PBTK模型的反向剂量法推导DON人体外暴露剂量-反应关系
采用基于PBTK模型的反向剂量法,将从文献中获得的DON体外浓度-反应曲线转化为各指标所对应的DON人体外暴露剂量-反应曲线。通常认为只有游离的化学物才能跨膜进入胞内并与靶标作用,因此本研究以游离浓度作为体外-体内换算的基础。依据前期工作建立的方法[19],结合化学物在体外体系中在蛋白质、脂质以及培养板材料等之间的分配行为,计算DON在体外培养液中的游离分数fuvitro。DON在人体血液中的游离分数fublood则通过血浆游离分数fuplasma与全血与血浆药物浓度比(blood/plasma ratio,BPr)相除得到。随后分别根据fuvitro和fublood分别将体外浓度与血液浓度换算为对应的游离浓度,假设体外试验中DON的游离浓度等效于其静脉血中的游离Cmax。采用反向剂量法,利用PBTK模型建立内暴露浓度与外暴露剂量之间的对应关系,从而得到各体外效应浓度对应的人体外暴露剂量。对体外试验中的每个浓度点重复上述步骤,实现体外浓度-反应曲线到外暴露剂量-反应曲线的转化。随后,为推导DON基于免疫毒性PoDs,本研究对预测的外暴露剂量-反应曲线进行基准剂量(benchmark dose,BMD)分析,方法详见附录1.4节。
1.6 数据分析
本研究中体外代谢实验数据均来自至少3次独立实验,结果以“平均值±标准差”表示。数据分析及图形绘制采用GraphPad Prism软件(版本10.4.1)。
2 结果
2.1 DON体外肝脏固有清除率
在肝微粒体质量浓度为1 mg/mL,DON浓度为50 nmol/L条件下,DON剩余浓度随代谢时间延长呈显著的时间依赖性下降(图2)。通过将代谢孵育不同时间后DON剩余浓度取自然对数并将其与对应的孵育时间进行线性拟合,结果显示DON剩余浓度的对数与孵育时间呈高度线性相关(R2=0.971 9),表明DON在人肝微粒体中的代谢消除符合一级动力学特征,代谢消除速率常数k为0.009 958/min,根据公式(1)算得DON在中国人肝微粒体的CLint为0.01 mL/(min·mg pro)。
图2 DON(50 nmol/L)在中国人肝微粒体孵育实验中的清除
Fig.2 Clearance of DON (50 nmol/L) in Chinese human liver microsome incubation experiments
注:CDON为DON剩余浓度;黑色圆点和橙色三角分别代表含有和不含有辅助因子的孵育样品,以3次独立实验的“平均值±标准差”表示。
2.2 PBTK模型验证
为评价建立的中国人DON PBTK模型的预测性能,将模型预测值和中国人生物监测数据进行了对比,如图3所示[3,16]。结果显示,河南省、四川省、安徽省3组人群的24 h游离DON累积排泄量分别为19.68、4.98、27.26 μg,在匹配了三地外暴露水平[1.52、0.41、2.59 μg/(kg BW·d)]和成人平均体重(66.48、66.48、62.2 kg)后,模型预测的24 h尿中游离DON累积排泄量相对于实测值分别高1.78倍、1.90倍和1.93倍,预测值与实测值的倍数误差均在2倍之内,提示模型预测性能良好,敏感性分析结果详见附录2.1节和附图1。
图3 PBTK模型预测与中国人群实测的24 h尿液游离态DON累计排泄量对比
Fig.3 Comparison of 24-hour cumulative urinary free DON excretion between PBTK model predictions and actual measurements in the Chinese population
注:误差线表示预测值2倍误差范围。
2.3 基于PBTK模型的反向剂量法推导DON人体外暴露剂量-反应关系
本研究共筛选纳入了5篇DON体外免疫毒性研究[20-24],提取并整合8项免疫毒性相关终点的浓度-反应数据(见附图2),涵盖不同单核细胞(U937、THP-1)来源的巨噬细胞,在脂多糖、白介素-4等不同极化刺激条件下的细胞因子释放与信号通路响应,以及外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMCs)中T淋巴细胞活化等指标,具体信息见附表4。随后,基于体外细胞培养液与血浆中DON的游离分数,分别为0.940 3和0.862 0,对蛋白结合进行校正,反向使用PBTK模型,将文献获得的体外浓度-反应关系外推为DON诱导免疫功能/表型相关指标改变的人体外暴露剂量-反应曲线(图4)。
图4 基于PBTK模型的反向剂量测定法预测DON人体免疫毒性的外暴露剂量-反应曲线
Fig.4 Predicted dose-response curves for immunotoxicity of DON obtained by using PBTK modeling-based reverse dosimetry
2.4 基于人体免疫毒性效应的PoDs
本研究对8项免疫毒性终点的剂量-反应关系(图4)进行了BMD分析,采用BMDL5作为PoDs。如表1所示,在所评估的免疫毒性终点指标中,最敏感的是DON对CD69+CD25+双阳性T细胞活化的抑制效应,最不敏感的是对人早幼粒白血病细胞系(HL-60)中趋化因子RANTES分泌的抑制效应,二者BMDL5分别为2.68、282 μg/(kg BW·d),相差105倍。在T淋巴细胞活化指标中,CD71+T细胞活化的敏感性低于CD69+CD25+双阳性T细胞,其BMDL5为21.18 μg/(kg BW·d)。在炎症因子相关终点中,DON基于NF-κB报告基因活性的抑制效应BMDL5为 18 μg/(kg BW·d),同时DON可促进经典活化巨噬细胞(M1)释放炎症因子TNF-α,BMDL5=8.38 μg/(kg BW·d),并抑制替代活化巨噬细胞(M2)对TNF-α和IL-1β的释放,BMDL5分别为31.5和23.5 μg/(kg BW·d)。此外,巨噬细胞替代活化标志(CD209)抑制效应的BMDL5为74.9 μg/(kg BW·d)。
3 结论与讨论
为实现对DON在中国人体内ADME的可靠预测,本研究构建了适用于中国人的PBTK模型。尽管已有基于高加索人参数的DON PBTK模型报道[10],但本研究的敏感性分析表面,模型预测对多项生理与解剖学参数以及肝脏代谢相关参数较为敏感,尤其是组织血流量与组织体积等参数。鉴于中国人与高加索人在体重、器官质量及血流量等生理与解剖学特征上存在差异,直接采用高加索人参数可能引入体内剂量指标(如血液Cmax)的系统性偏倚。基于此,本研究针对敏感且具有明确人群差异证据的生理与解剖学参数进行中国人群特异性再参数化;对于目前缺乏证据支持存在种族差异的参数,则优先沿用已发表模型或通用文献值,以尽量减少额外假设并降低参数不确定性。
为获得中国人DON的肝脏清除参数,本研究采用中国人肝微粒体体外孵育试验测得DON的微粒体固有清除率CLint为0.01 mL/(min·mg pro)。该值与F☞STE等[25]报道的高加索人结果[0.008 mL/(min·mg pro)]接近,提示中西方人群在微粒体水平的代谢差异可能有限。进一步结合微粒体蛋白含量及肝脏质量等生理差异进行体内外推,估算中西方人体内肝脏清除率约分别为32 L/h 与27.63 L/h,二者差异不明显。这可能与DON主要经UGT2B4/UGT2B7介导的葡萄糖醛酸化代谢有关,这些同工酶的等位基因在亚洲与欧美人群的频率差异可能不足以显著影响酶活性或底物亲和力[26-27],从而未导致明显的DON代谢的种族差异。
本研究通过整合文献中人源免疫细胞模型的浓度-反应数据,利用基于PBTK模型的反向剂量法得到DON外暴露剂量-反应曲线,进而推导其基于人体免疫毒性的PoDs。所得PoDs范围从2.68～282.00 μg/(kg BW·d),差异主要源于体外数据中细胞类型与毒性终点选择的不同(附表4)。其中基于T淋巴细胞活化干扰效应以及炎症反应(如TNF-α及IL-1β分泌抑制和NF-κB通路激活抑制)的PoDs低于小鼠体重增长减少的PoD[0.11 mg/(kg BW·d)],提示此类早期免疫毒性终点可为推导更具保护性的人类健康指导值(如TDI)提供关键依据。
为探索基于NAMs获得的PoDs在DON风险评估中的潜在应用,可以本研究预测的PoDs为基础,采用不确定系数100(其中10为体外-体内外推不确定性,10为人群个体差异)[19],推导得到基于免疫毒性的暂定健康指导值范围为0.027～2.82 μg/(kg BW·d),用于与实际暴露水平相比进行初步评估。文献报道我国不同地区成人DON平均膳食估计日摄入量范围为0.41～2.59 μg/(kg BW·d)[3,16,28],与上述健康指导值部分重叠,提示需高层级的风险评估策略。需要强调的是,此处健康指导值的不确定性仍具有讨论空间。免疫毒性涉及多环节的机制通路,且其毒性终点类型多样,体外指标(如淋巴细胞活化、炎症反应)对真实不良健康结局的外推可靠性可能因试验体系、剂量范围和时间尺度差异而受限。即使采用常用的QIVIVE不确定性系数,其对免疫毒性的适用性(是否足够保护或过于保守)也有待更多类似案例和交叉验证予以确认。未来研究应结合基于机制的不良结局通路证据以及体内/人群数据,对PoD选取和不确定系数分配进行讨论,以更好地平衡指导值的保守性与准确性。
本研究仍存在一定局限性。首先,PBTK模型构建主要基于中国成年人群的生理数据,未充分纳入孕妇或婴幼儿等人群的独特毒代动力学特征,PoDs在易感亚群的适用性有待完善;此外,当前建模参数采用成年人群平均值,未纳入参数的个体变异性,目前尚难以表征PoDs在人群中分布特征及其不确定性。未来研究可通过蒙特卡洛模拟或整合亚群特定参数以优化模型,从而改进对不同人群及人群差异的表征。最后,本研究仅关注DON单一暴露,而现实膳食中DON常与其他真菌毒素(如雪腐镰刀菌烯醇、玉米赤霉烯酮等)联合存在,可能产生协同或累加效应,后续工作应整合多毒素暴露模型以更全面评估风险。
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