荔枝(Litchi chinensis Sonn)是一种属于无患子科的热带和亚热带水果[1],因其诱人的颜色、独特的风味以及丰富的营养和保健作用而受到人们的喜爱[2]。荔枝果肉富含糖分,还含有多种氨基酸、维生素和矿物质,适合酿制荔枝酒[3]。荔枝酒是一种新兴的健康果酒,常以新鲜的荔枝为原料,参照葡萄酒的酿造工艺生产而成[4-5]。厂家的生产工艺略有差异,多数厂家采用低温发酵或中温发酵,也有少量厂家采用高温发酵的方式进行酿制。不同发酵温度酿制的荔枝酒,其滋味、风味差异甚大[6]。究其原因可能是不同发酵温度影响了酵母的代谢及荔枝果实带来的内源菌群的生长[7]。发酵温度如何影响酿酒酵母、内源菌群的生长?温差如何介导内源菌群的演替,进而影响它们的代谢性能及成品荔枝酒的口感及风味?目前尚未见有较为系统的研究报道[8-9]。
为探索食品发酵过程中微生物群落的演替规律及其对产品品质的影响,基于新一代宏基因组学技术,结合高通量测序手段[10-11],可全面解析发酵样品微生物群落的结构、功能活性及其与发酵条件的协同关系等,显示出在食品发酵领域具有广泛的应用前景[12]。GAO等[13]通过在赤霞珠葡萄酒自然发酵研究中揭示了酵母与醇类、酸类、酯类等主要代谢物之间的密切关联。张金萍等[14]结合宏基因组测序与GC-MS技术,分析了青稞酒发酵过程中的微生物多样性及关键代谢通路的贡献微生物。张清玫等[15]则聚焦于3种香型白酒大曲微生物群落及其功能特征,解析其与风味物质之间的关系。
本研究以不同发酵温度(15、25、35 ℃)下发酵的荔枝酒为对象,采用宏基因组测序技术系统分析其微生物群落结构与功能特征,同时结合GC-MS风味物质检测结果,探索微生物在风味代谢中的作用及其与发酵温度的响应关系。旨在解析发酵过程中主要优势微生物种类及其变化趋势,揭示关键代谢通路与风味物质合成之间的联系,评估发酵温度对微生物功能与风味形成的调控效应。本研究结果有助于从微生物生态与功能基因层面揭示荔枝酒发酵过程中风味形成机制,并为发酵条件优化和功能菌种筛选提供理论支持与实践指导。
1 材料与方法
1.1 材料与设备
新鲜荔枝(白糖罂),海口南北批发市场;酿酒酵母DV10,丹斯达发酵股份有限公司;Agilent1260高效液相色谱、PE690-SQ8T气相-质谱联用仪,安捷伦科技公司;TL-650Y超声波细胞破碎仪,江苏天翎仪器有限公司;SB-5200D超声波清洗机,宁波新芝生物科技有限公司;DB-5色谱柱(60 m×0.25 mm×0.25 μm),Agilent J&W Scientific公司。
1.2 荔枝酒制作
以新鲜荔枝为原料,经去皮去核打浆压榨后得到荔枝汁,并通过滤布过滤至无明显荔枝残渣,后添加SO2杀菌一定时间,虹吸取出上清液,用白砂糖将可溶性固形物调整为22°Brix。采用3 000 L发酵罐,装液量为2 400 L。每罐添加480 g酿酒酵母DV10,酵母预先在5 L荔枝汁中活化并接种,使整个发酵体系质量浓度为0.2 g/L。于15、25、35 ℃的温度下恒温发酵,定期取0.5 L酒样离心,用于理化指标分析测定和宏基因组学测定。
1.3 荔枝酒理化指标的测定
可溶性固形物(total soluble solids,TSS)、总酸及pH值、酒精度(%vol)的测定参照GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法(含第1号修改单)》[16]中规定的方法进行。总酚(total phenolic content,TPC)的测定参照GB/T 8313—2018《茶叶中茶多酚和儿茶素类含量的检测方法》中的Folin-Ciocalteu法测定[17];总黄酮(total flavonoids,TFC)的测定参照刘展眉等[18]的方法进行。
1.4 样本采集
选择荔枝酒发酵过程的不同时间点(15 ℃:2、6、10、14、18 d;25 ℃:2、6、10 d;35 ℃:2、4、6 d)进行采样,经初次离心(4 ℃,12 000 r/min,10 min)后,弃上清液,沉淀菌体用1 mL无菌磷酸盐缓冲液重悬并混匀,随后进行低速离心(4 ℃,3 000 r/min,5 min)以沉淀大颗粒固体(果渣),转移上层菌体悬液至新管。提取后DNA质量经NanoDrop检测,并经1%琼脂糖电泳确认无降解。
1.5 基因组DNA提取与测序
采用QIAamp DNA Stool Mini Kit提取发酵样本总DNA,建库后在Illumina NovaSeq平台进行PE150测序。通过fastp进行质量控制与接头去除,使用MEGAHIT拼接contigs,Prodigal预测ORF并构建非冗余基因集[19]。利用MetaGeneMark对≥500 bp的contigs进行基因预测,然后采用CD-HIT软件(95% identity、90% coverage)对所预测基因进行聚类,选取最长的基因作为每个cluster的代表序列,构建初始非冗余基因集合。获得非冗余基因集后,基于各种数据库比对注释结果分析预测样本中微生物群落的功能特征[13]。
1.6 物种分类与功能注释
基于reads进行物种注释,使用Kaiju软件将reads比对Nr微生物库(包含细菌、真菌、古细菌、病毒、微小动植物)进行物种注释[20],并通过Bowtie2预测物种的实际相对丰度。对于功能注释,将Unigenes通过DIAMOND软件(阈值evalue<=1e-5)比对到KEGG数据库,同时集合基因丰度表格计算数据库比对结果的丰度信息,以进行组间功能差异分析和比较。
1.7 荔枝酒挥发性风味物质检测
分析平台:Thermo scientific ISQ 7000/Trace 1300_1310。色谱柱:DB-5(60 m×0.25 mm×0.25 μm)。仪器参数设定为:进样口温度280 ℃,EI离子源温度230 ℃,高纯氦气(纯度>99.999%)作为载气,分流比10∶1,进样量1.0 μL,溶剂延迟5 min。升温程序为:初始温度70 ℃,10 ℃/min的速度升至200 ℃,然后以5 ℃/min的速度升至280 ℃,并维持10 min。采用全扫描模式进行质谱检测,质谱检测范围为30～550(m/z)[21]。
1.8 生物信息学分析
物种注释:采用Kraken2和Bracken软件对拼接后的序列进行物种分类注释,分析微生物多样性及优势菌群变化趋势[22]。功能注释与通路分析:使用DIAMOND软件将预测的基因比对至KEGG数据库,分析主要代谢通路(如碳代谢、氨基酸代谢、信号转导等)丰度分布。风味相关功能基因分析:利用Humann3分析风味代谢通路中关键酶基因的丰度变化,并结合不同温度下的表达差异进行关联性分析[23]。
1.9 统计分析
所有数据均以3次生物重复进行统计。微生物组成和功能通路丰度的显著性分析采用ANOVA(P<0.05),组间差异采用Tukey HSD进行多重比较。相关性分析采用Spearman相关系数,绘制热图和网络图可视化微生物与风味物质之间的关系。图表绘制使用R软件(version 4.2.2)和Origin 2022进行[24]。
2 结果与分析
2.1 不同温度发酵荔枝酒微生物α多样性分析
由图1-a～图1-c可知,15 ℃发酵时,种水平上只有第10天和第18天的样品间差异不显著(P>0.05),其余发酵时间点之间差异显著(P<0.05)。25 ℃发酵时,种水平上微生物α多样性指标都存在显著差异(P<0.05)。35 ℃发酵时,种水平上不同发酵时间点之间差异都不显著(P>0.05)。基于主坐标分析(principal coordinates analysis,PCoA)可以发现,从种水平看,15 ℃发酵6～18 d的样品,其微生物群落结构与25、35 ℃发酵的样品存在显著差异,可被有效区分,仅15 ℃发酵2 d的样品,群落结构独立于同温度下的其他发酵阶段样品。
a-15 ℃发酵;b-25 ℃发酵;c-35 ℃发酵;d-PCoA
图1 不同温度发酵荔枝酒微生物种水平多样性分析
Fig.1 Analysis of microbial diversity at species level in lychee wine fermented at different temperatures
2.2 不同温度发酵荔枝酒微生物群落组成
不同发酵温度条件下的荔枝酒种水平上的菌群分布如图2所示。共注释到1 293个种,其中种水平丰度占据前10的分别是荔枝肠膜明串珠菌(Leuconostoc litchii)、乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)、乳脂乳球菌(L.cremoris)、运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)、酿酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)、发酵粘液乳杆菌(Limosilactobacillus fermentum)、假肠膜明串珠菌(L.pseudomesenteroides)、苏奥古姆明串珠菌(L.suionicum)、嗜柠檬酸明串珠菌(Leuconostoc citreum)和肠膜状明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)。15 ℃发酵条件下,发酵2 d时,加入的酿酒酵母(32.5%)是主要发酵微生物,至发酵第6天时快速降低至2.2%,到第18天时又升高至3.8%;在此温度下发酵6～18 d的时间内,荔枝肠膜明串珠菌占主导地位,其丰度为1.4%～24.3%,在发酵14 d时达到最大值。25 ℃发酵时,发酵2 d时乳酸乳球菌丰度最高,其次荔枝肠膜明串珠菌和乳脂乳球菌。6～10 d时,运动发酵单胞菌、乳酸乳球菌和荔枝肠膜明串珠菌变成了主要微生物,在此期间人工接入酿酒酵母的丰富值占0.57%～4.86%,说明中温条件下发酵,荔枝本身带来的内源微生物影响发酵进程。35 ℃发酵时,发酵粘液乳杆菌占主导地位(13.3%),其次是运动发酵单胞菌(5.4%)、酿酒酵母(4.3%)及苏奥古姆明串珠菌(2.8%),可见在35 ℃的高温发酵时,接入的酿酒酵母并未占据主导地位,而是由荔枝果实本身带来的内源微生物占主导,这也说明高温条件下发酵,采用添加SO2化学杀菌剂是无法有效抑制内源微生物的生长的。
图2 种水平荔枝酒发酵菌群分布图
Fig.2 Microbial community structure in lychee wine fermented at different temperature
温度对菌群结构具有显著调控作用。荔枝酒在低温条件下发酵有利于人工接入的酿酒酵母有效主导整个发酵进程,保证发酵的安全进行。而在中高温度条件下发酵,由荔枝本身带来的内源微生物异常活跃,人工接入的酿酒酵母难以主导整个发酵过程。
2.3 不同温度发酵荔枝酒微生物群落功能差异分析
基于KEGG数据库对3种温度下发酵荔枝酒的微生物基因进行功能注释,如图3所示的排在前25的3级代谢通路可知,15 ℃发酵2 d时氧化磷酸化(oxidative phosphorylation)丰度较高,其他代谢通路的丰度较低;发酵6～18 d时嘧啶代谢(pyrimidine metabolism)、嘌呤代谢(purine metabolism)、同源重组(homologous recombination)、肽聚糖生物合成(peptidoglycan biosynthesis)、甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢(glycine, serine and threonine metabolism)、半胱氨酸与甲硫氨酸代谢(cysteine and methionine metabolism)、错配修复(mismatch repair)、淀粉和蔗糖代谢(starch and sucrose metabolism)、ABC转运器(ABC transporters)、群体感应(quorum sensing)、丙氨酸、天门冬氨酸和谷氨酸代谢(alanine, aspartate and glutamate metabolism)、氨基糖和核糖代谢(amino sugar and nucleotide sugar metabolism)、磷酸戊糖途径(pentose phosphate pathway)、氨酰tRNA生物合成(aminoacyl-tRNA biosynthesis)、代谢通路(metabolic pathways)、氨基酸生物合成(biosynthesis of amino acids)、次级代谢产物生物合成(biosynthesis of secondary metabolites)、2-氧代羧酸代谢(2-oxocarboxylic acid metabolism)、二元组分系统(two-component system)等通路的丰度相对较高,而丙酮酸代谢(pyruvate metabolism)、碳代谢(carbon metabolism)、不同环境下的微生物代谢(microbial metabolism in diverse environments)、糖酵解/糖原异生(glycolysis/gluconeogenesis)、核糖体(ribosome)及氧化磷酸化(oxidative phosphorylation)通路的丰度较低。
a-所有样本中代谢通路注释到的基因数目;b-不同发酵时间和温度下的差异代谢物热图
图3 荔枝酒中微生物代谢通路热图
Fig.3 Heatmap of microbial metabolic pathways in lychee wine
25 ℃发酵2 d时,氧化磷酸化、二元组分系统、错配修复、半胱氨酸与甲硫氨酸代谢、甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢的代谢通路丰度相对较低,其余代谢通路的丰度相对较高;发酵6 d时,错配修复、淀粉和蔗糖代谢、氧化磷酸化的丰度相对较低,其余通路的丰度相对较高;发酵第10天时,核糖体、错配修复、淀粉和蔗糖代谢、ABC转运器、群体感应通路的丰度相对较低,其余通路的丰度较高。
35 ℃发酵条件下发酵第2天时仅有错配修复、半胱氨酸与甲硫氨酸代谢、核糖体、不同环境下的微生物代谢及丙酮酸代谢的通路丰度相对较高,其余代谢通路丰度相对较低;到了发酵第4～6天时样品的氧化磷酸化、2-氧代羧酸代谢通路的丰度较低,其余通路较高。
2.4 不同温度发酵荔枝酒理化性质的变化分析
如表1所示,可溶性固形物总体表现为随发酵进行先下降后稳定,具体表现为15 ℃组经18 d的发酵下降至8.45°Brix,而25 ℃ 及35 ℃经10 d和6 d的发酵后,可溶性固形物分别下降至7.67、8.1°Brix。发酵结束后,15 ℃和25 ℃发酵的酒样酒精度保持在11%vol左右,差异不显著;而35 ℃发酵的酒样其酒精度仅有8.33%vol,可能的原因是在高温条件下与活跃的内源微生物有关,内源微生物的快速生长消耗了大量的糖类物质,导致其酒精度较低。总酸随发酵时间延长逐步升高,发酵结束时高温(35 ℃)组总酸含量(8.66 g/L)显著高于低温组(25 ℃组的5.42 g/L及15 ℃组的6.47 g/L)。pH值的变化趋势与总酸的变化相反,随发酵时间的延长逐渐降低,25 ℃发酵的酒样pH值下降最显著(最终为3.55),可能与该组酒样所含的有机酸种类有关。总黄酮含量的变化,15 ℃组和25 ℃组的变化趋势一致,随着发酵时间的延长逐渐升高,而35 ℃组的变化趋势与之相反,说明高温短时间发酵不利于总黄酮的保留。总酚含量的变化在3种发酵温度发酵时随发酵时间的延长呈现无规律变化。
表1 不同温度发酵荔枝酒的理化指标
Table 1 Physicochemical indicators of lychee wine fermented at different temperatures
荔枝酒样品可溶性固形物/°Brix酒精度/%vol总酸/(g/L)pH值总酚/(g/L)总黄酮/(mg/L)15 ℃ 2 d20.00±1.00a2.40±0.26h2.77±0.02j4.91±0.03a3.31±0.05b76.11±5.98e15 ℃ 6 d15.00±1.00b4.97±0.21g4.84±0.04g4.26±0.02c2.87+0.07d76.22±5.67e15 ℃ 10 d10.33±0.58de8.53±0.25d5.80±0.07e4.16±0.02d3.23±0.06bc85.48±2.89de15 ℃ 14 d9.33±0.58ef10.32±.053c6.07±0.05d4.15±0.01d2.93±0.02d89.70±7.85cd15 ℃ 18 d8.45±0.08fg11.10±0.17ab6.47±0.02c3.91±0.02f2.83±0.11d103.08±2.00a25 ℃ 2 d14.67±0.58b8.36±0.60d3.02±0.01i4.52±0.07b3.12±0.07c90.17±5.17bcd25 ℃ 6 d8.27±0.75g10.59±0.85bc3.77±0.01h4.11±0.04d2.88+0.03d99.94±12.17ab25 ℃ 10 d7.67±0.58g11.09±0.89a5.42±0.02f3.55±0.11h3.31±0.08b105.22±12.5835 ℃ 2 d12.67±0.58c6.67±0.21f6.04±0.02d4.54±0.06b3.45±0.02a101.50±1.69ab35 ℃ 4 d10.53±0.56d7.57±0.21e8.34±0.07b4.00±0.01e2.85+0.20d86.44±5.12de35 ℃ 6 d8.10±0.66g8.33±0.15d8.66±0.003a3.65±0.07g2.90±0.08d85.17±05.89de
注：同列字母不同表示差异显著(P<0.05)。
2.5 不同温度发酵荔枝酒挥发性风味化合物的变化分析
通过固相微萃取-气相色谱-质谱联用技术(solid phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry,SPME-GC-MS)技术共检测出3种发酵温度发酵的荔枝酒挥发性风味化合物共41种,包括醇类16种、有机酸11种、酯类5种、糖类7种、烯烃和烷烃类各1种。这些物质共同构成了不同温度发酵荔枝酒独特而复杂的风味特征。
2.5.1 差异挥发性风味代谢物热图分析
不同温度发酵荔枝酒样品之间在挥发性风味代谢物组成上存在明显差异(图4)。其中,2,3-丁二醇、丙二醇、赤藓糖醇、异丙醇、莽草酸、乳酸、抗坏血酸、D-半乳糖等代谢物在35 ℃高温组(GC-T3)富集显著,呈现上调趋势,可能与高温诱导的产酸代谢与应激代谢相关;1,2,3-丁二醇、对羟基苯乙醇、肌醇、甘油、2-羟基异己酸、琥珀酸、3-苯基乳酸、2-羟基-3-甲基丁酸、棕榈酸、硬脂酸、琥珀酸单乙酯、1-棕榈酸单甘油酯在25 ℃中温组(GC-T2)显著富集上调;1-甲氧基-2-甲基丙烷-1-烯-1-醇、D-山梨醇、乳糖、蜜二糖及D-果糖在15 ℃低温组(GC-T1)显著富集上调。
图4 不同温度发酵荔枝酒差异挥发性风味代谢物热图
Fig.4 Heatmap of volatile flavor metabolites in fermented lychee wine at different temperatures
2.5.2 差异挥发性风味代谢产物所在通路富集分析
差异挥发性风味物质代谢通路富集分析结果(图5)表明,不同发酵温度下差异代谢物前8位代谢通路:半乳糖代谢(galactose metabolism)、抗坏血酸与醛糖酸代谢(ascorbate and aldarate metabolism)、不饱和脂肪酸的生物合成(biosynthesis of unsaturated fatty acids)、三羧酸循环(TCA cycle)、苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成(phenylalanine, tyrosine and tryptophan biosynthesis)、硫代谢(sulfur metabolism)、磷脂代谢(glycerolipid metabolism)及肌醇磷酸代谢(inositol phosphate metabolism)等。
图5 差异风味代谢产物代谢通路气泡图
Fig.5 Metabolic pathways bubble diagram of different flavor metabolites
半乳糖代谢通路中形成的差异代谢物有甘油、D-山梨醇、肌醇及D-半乳糖等;抗坏血酸与醛糖酸代谢通路中形成的差异代谢物有肌醇及单脱氢抗坏血酸;不饱和脂肪酸的生物合成通路中形成的差异代谢物有棕榈酸和硬脂酸;三羧酸循环和硫代谢通路中,形成的差异代谢物有琥珀酸;苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成通路中形成的代谢物有莽草酸;磷脂代谢通路中形成的差异代谢物仅有乳酸。磷酸肌醇代谢代谢通路中形成的差异代谢物为肌醇。
通过差异风味代谢物热图分析可以发现,苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成通路在高温组得到富集;不饱和脂肪酸的生物合成通路、三羧酸循环和硫代谢通路、磷酸肌醇代谢通路在中温组得到富集;磷脂代谢通路在低温组得到富集;而半乳糖代谢通路在中高温组得到富集。
综上分析可以发现,25 ℃是荔枝酒发酵过程中风味代谢、功能通路最活跃的温度,可实现糖醇类、芳香酯类和芳香醇类的协同合成;而35 ℃条件下虽代谢速率高,但倾向于非目标代谢产物累积,风味复杂但协调性下降;15 ℃组则表现为风味生成缓慢,香气积累时间较长。
2.6 微生物多样性与理化参数及风味代谢物相关性分析
2.6.1 微生物多样性与理化参数相关性
由图6可知,酿酒酵母菌与可溶性固形物及pH显著正相关(P<0.05)。发酵粘液乳杆菌、假肠膜明串珠菌、苏奥古姆明串珠菌、肠膜状明串珠菌与总酸显著正相关。运动发酵单胞菌与总黄酮显著正相关。
图6 不同温度发酵荔枝酒的主要微生物与理化参数相关性
Fig.6 The correlation between the main microorganisms and physicochemical parameters of lychee wine fermented at different temperatures
注:*、**和***分别表示P<0.05、P<0.01和P<0.001水平的显著相关性。
2.6.2 微生物多样性与风味物质的相关性
从图7可以得出,荔枝肠膜明串珠菌、酿酒酵母分别与D-果糖、乳糖和蜜二糖显著正相关(P<0.05);乳酸乳球菌、乳脂乳球菌分别与甘油、琥珀酸、棕榈酸、硬脂酸、对羟基苯乙醇、3-苯基乳酸、2-甲基-1,2-丙二醇、2-羟基-3-甲基丁酸、2-羟基异己酸及琥珀酸单乙酯显著正相关,说明这2种微生物对上述香气物质贡献度达显著水平(P<0.05);而假肠膜明串珠菌及苏奥古姆明串珠菌却与上述物质呈显著负相关关系(P<0.05),说明此2种微生物对上述风味物质的负面影响较大;运动发酵单胞菌与1-棕榈酸单甘油酯、1,2,3-丁二醇及肌醇显著正相关(P<0.05);假肠膜明串珠菌及苏奥古姆明串珠菌、肠膜状明串珠菌分别与丙二醇、异丙醇及D-半乳糖显著正相关(P<0.05)。发酵粘液乳杆菌与2,3-丁二醇、乳酸、赤藓糖醇、抗坏血酸及莽草酸显著正相关(P<0.05)。嗜柠檬酸明串珠菌与D-山梨糖醇、1-甲氧基-2-甲基丙烷-1烯-1-醇显著正相关(P<0.05)。可见,酿酒酵母、乳酸乳球菌、乳脂乳球菌、荔枝肠膜明串珠菌、假肠膜明串珠菌、苏奥古姆明串珠菌、运动发酵单胞菌、肠膜状明串珠菌、发酵粘液乳杆菌及嗜柠檬酸明串珠菌可能对发酵荔枝酒的风味物质产生重要影响,进而影响产品的品质。
图7 微生物多样性与风味物质的相关性
Fig.7 Correlation between microbial diversity and flavor substances
3 结论
本研究通过宏基因组学技术分析了不同发酵温度(15、25、35 ℃)荔枝酒发酵过程中微生物群落结构。结果表明,在3种发酵温度下荔枝酒中除人工接入的酿酒酵母外,明串珠菌、乳球菌、乳杆菌及运动发酵单胞菌等是主要的内源微生物;通过GC-MS分析共鉴定出3种发酵温度下26种差异风味代谢物,经KEGG分析,半乳糖代谢、抗坏血酸与醛糖酸代谢、不饱和脂肪酸的生物合成等得到显著富集。对主要微生物与理化指标、差异风味代谢物作进一步关联分析,发现它们之间在不同程度上呈现一定的相关性,特别是乳球菌与多种风味物质呈正相关,而明串珠菌与总酸呈正相关关系。从发酵安全性角度看,15 ℃的低温条件下人工接入的酿酒酵母能主导发酵进程,成品酒精度高,利于内源微生物长时间缓慢累积风味物质,整体风味及口感较好。可见,不同的发酵温度不仅影响荔枝酒发酵过程中内外源微生物的结构,而且还影响其代谢功能,进而影响荔枝酒的品质。以上结果可为荔枝酒发酵过程中“微生物-代谢-风味-品质”的调控机制提供理论依据。
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