白酒是著名的蒸馏酒之一,由于其开放式的生产工艺、丰富的微生物种类,赋予白酒丰富、特殊的香气[1],这是白酒的魅力,也是其品质难以稳定提高的原因。目前在白酒酿造领域,微生物的精准调控与利用对风味物质的形成起着至关重要的作用[2-3]。其中,吡嗪类物质因其具有扩张血管、改善血循环及护肝等功能,富含浓郁的坚果香和烘烤香,是中国白酒最重要的功能性物质之一[4-5]。同时,中国白酒也是吡嗪类物质含量最丰富的传统发酵食品之一,目前在白酒中最多检测到了27种吡嗪类物质[6],适量增加吡嗪类物质对提升基酒风味,促使口感富有浓郁层次等均具有显著作用[7]。
当前,通过外加功能性原料或者功能菌株强化等方式均能对浓香型白酒中吡嗪类物质的含量进行补充和优化,但微生物资源作为白酒行业的“生命线”,功能菌株强化是白酒风味增量的关键安全突破口之一。因此,白酒行业对功能微生物的研究与应用已成为了研究热点。现有研究旨在通过优化微生物代谢途径,提升白酒风味物质的产量及品质,取得了一定的进展。例如,有研究者采用传统分离方法在高温大曲中筛选2株产吡嗪类化合物的菌株,将其应用到酱香型白酒生产中,最后检测到酒样中四甲基吡嗪含量能达到6.34 mg/L[8];同时,也有研究者通过蛋白酶透明圈初筛再经液态发酵筛选出1株高产四甲基吡嗪的地衣芽孢杆菌,发酵液的产量为12.22 mg/L[9],利用传统分离方法从清香型大曲中筛得1株芽孢杆菌,经发酵培养基的优化后使得四甲基吡嗪产量达3.32 g/L[10],通过紫外诱变结合酪素平板水解圈直径及乙偶姻显色进行筛选,在酱醪中筛选得到贝莱斯芽孢杆菌,且通过改变培养条件使四甲基吡嗪积累量达到1 895.08 mg/kg[11];有研究者将产吡嗪类菌株应用到大曲生产中,对大曲微生物群落进行扰动,整体提升了大曲挥发性风味物质,其中吡嗪类物质产量达981.66 μg/kg[12]。然而,传统功能微生物在开放性生产环境的白酒酿造应用中面临诸多挑战,其中最为突出的矛盾集中在传统自然筛选所得的野生型微生物合成相关代谢产物的能力十分有限,该方法更具有典型的“筛选周期长、菌株稳定性差和效率低”等瓶颈,难以满足当今白酒酿造的实际生产应用。
常压室温等离子体(atmospheric and room temperature plasma,ARTP)诱变技术作为一种安全性高、操作快速简单、突变率高、安全环保的新型非理性微生物育种手段[13],在相关行业已广泛应用于快速提升目标微生物的相关能力,也取得了长足的进步。如有研究利用ARTP诱变技术对凝结芽孢杆菌进行非理性选育,显著提高了其在动物饲料和人类膳食剂中的益生性能[14];也有研究者利用ARTP技术突变得到的谷氨酸棒状杆菌生产L-丝氨酸和蔗糖,相比原始菌株产量分别提高了35.9%和66.7%[15];还有研究者利用ARTP技术对白僵菌进行一次诱变二轮筛选后,获得了具有更强发酵能力的菌株[16];但值得注意的是,受限于ARTP诱变的随机性,突变大多为无效和负向突变,且无法定向筛选到目标菌株,存在明显盲目性。因此,传统筛选与ARTP诱变接续选育策略有望构建“高突变率-定向筛选”的互补体系,在传统发酵行业中优势突出。例如,有研究从酱油传统发酵醪中分离得到目标芽孢杆菌,经ARTP诱变后淀粉酶和蛋白酶显著提高了143.10%和90.54%[17],实现了菌株来源可靠和能力快速提升的双重效果。然而,目前在白酒酿造领域对吡嗪类物质菌株的研究多集中于传统自然筛选与菌株自身培养条件优化,而菌株单独ARTP诱变、传统筛选与ARTP诱变接续选育以及相关菌株实际白酒糟醅发酵效果的研究仍鲜有报道,相关目标菌株对吡嗪类物质的发酵增量效果及其机制也不清晰。
基于此,本研究以四川产区不同大曲为筛选对象,联合高粱固态培养基纯培养模拟发酵评估,利用传统筛选与ARTP诱变接续选育获得高产吡嗪类物质菌株,分别从分子生物学、形态特征及生理生化鉴定等方面系统分析菌株特性。进一步探究菌株在白酒糟醅实际发酵的应用效果,初步明确目标菌株对吡嗪类物质的发酵增量效果,为白酒行业提升产品品质与创新酿造工艺提供新的微生物资源与理论依据。
1 材料与方法
1.1 试验材料和试剂
1.1.1 样品
大曲来源:四川泸州、成都、宜宾等典型浓香型白酒产区的大曲成品。
1.1.2 培养基
营养肉汤(nutrient broth,NB)培养基:合成培养基,121 ℃灭菌15 min,添加1.5%(质量分数)琼脂后为营养琼脂(nutrient agar,NA)培养基。
葡萄糖蛋白胨水培养基(g/L):葡萄糖5.0、蛋白胨5.0、K2HPO4 2.0、pH 7.2,121 ℃灭菌15 min。
高粱固态发酵培养基:碎高粱与水以2∶1(g∶mL)混合均匀,80 ℃润粮1 h,加入蒸过的谷壳(以碎高粱质量的25%计),拌匀分装到250 mL三角瓶中(每个瓶装65 g),在121 ℃下灭菌35 min,灭完菌100 ℃即放气取出、打散,冷却至40～50 ℃后接种种子液。
1.1.3 主要试剂和仪器
主要试剂:环己酮标品、色谱级乙醇,上海麦克林生化科技股份有限公司;戊二醛(分析纯)、无水乙醇,国药集团化学试剂有限公司;锇酸(分析纯),北京中镜科仪技术有限公司。
分子生物学试剂:DNA提取试剂盒,OMEGA bio-tek公司。
主要仪器:DVB/CAR/PDMS萃取头,Supelco公司;K960梯度PCR仪,Bio-Rad公司;HVA-85高压蒸汽灭菌锅,Sanyo公司;HH-B11·600-BS-Ⅱ电热恒温培养箱,上海跃进医疗器械有限公司;JSM-IT700HR扫描电子显微镜、Smart Coater离子溅射仪,JEOL公司;K850临界点干燥仪,Quorum公司。
1.2 实验方法
1.2.1 菌株的广泛筛选与初步验证
菌株的筛选:将不同产地的大曲粉混合均匀,称取5 g,接入无菌45 mL NB培养基,摇床培养24～36 h,制成菌悬液。进一步采用平板涂布法[16],每个梯度各做5个平行,37 ℃倒置培养24 h,将平板培养基上长势良好且菌落形态上有较大差异的细菌采用平板划线法进行纯化,然后接入NA斜面培养基,4 ℃保存备用,待测定。
菌株的初步验证:利用V-P实验[18],从筛选的菌株中选出阳性菌株,待进一步复筛。
1.2.2 高产吡嗪类菌株的复筛
种子液:将初步筛选V-P显色阳性的菌株接入NB培养基中放置于37 ℃恒温培养箱24 h,调整菌液为1×108 CFU/mL,将菌液在4 000 r/min,常温离心5 min后,弃上清液,使用等量无菌水重悬,重复该步骤3次,制得种子液。
高粱固态发酵:将种子液1×108 CFU/mL、1%的接种量接入准备好的高粱固态发酵培养基中,打散摇匀,置于37 ℃培养9 d,再转移至55 ℃培养3 d,发酵结束后,待测定。
GC-MS检测条件:参考LIN等[19]描述的方法进行发酵样品挥发性物质检测。检测数据通过与标准谱库(NIST2017)对比进行组分鉴定,对匹配度大于85%的物质予以分析。
1.2.3 ARTP诱变条件
精准移取10 μL标准化菌悬液均匀涂布于灭菌不锈钢载片(直径12 mm),置于ARTP诱变仪载物台,参照王诗卉[20]的方法并做修改:高纯氦气,流量10 SLM、射频功率120 W、等离子体射流温度(22±0.5) ℃、处理距离2.0 mm、诱变时间150 s进行等离子体辐照,处理结束后立即将载片浸入含1 mL无菌生理盐水的EP管,通过涡旋混合仪振荡洗涤(1 200 r/min, 60 s)实现菌体回收,采用梯度稀释法(10-3～10-4稀释梯度)对诱变菌悬液进行定量,取100 μL均匀涂布于NA培养基,37 ℃恒温培养24 h后挑选11株菌株,待测定。
1.2.4 菌株16S rDNA和生理生化鉴定
DNA的提取:采用的是OMEGA bio-tek公司DNA提取试剂盒进行菌株DNA的提取,送检待测定。
扫描电镜鉴定:离心收集足量菌体,用PBS轻轻漂洗,弃PBS加入3%(体积分数)戊二醛,悬浮固定;菌体用超纯水清洗3次,每次10 min。经1%(体积分数)锇酸后固定1～2 h,再经超纯水清洗3次,每次10 min;乙醇逐级脱水,脱水剂浓度梯度为30%→50%→70%→90%→100%(均为体积分数,100%浓度换3次),每次15 min;将菌体滴在盖玻片上,并放进临界点干燥仪进行干燥;将盖玻片用导电胶黏到样品台上,并放入离子溅射仪进行喷金处理,然后采用扫描电子显微镜进行观察。
生理生化鉴定:参照《常见细菌系统鉴定手册》[21]对菌株的生长曲线和生理生化特性进行测定。
1.2.5 诱变菌株在糟醅发酵中产吡嗪类物质能力
根据浓香型白酒传统工艺,取四川某浓香型白酒厂的入窖糟醅25 kg,对照组(CK)仅添加20%传统大曲,实验组添加20%传统大曲和M-6(糟醅质量的1%、1×108 CFU/mL),拌和均匀,于厌氧泡沫箱中室温密封发酵60 d,取样待测。
2 结果与分析
2.1 菌种的初步筛选结果
大曲样品通过富集后,通过稀释涂布平板法、平板划线纯化后共分离得到50株菌株,分别编号X-1～X-50,通过V-P显色,得到8株V-P阳性菌株,对强阳性X-9、X-23、X-30、X-41 4株微生物进行高粱固态发酵试验,利用顶空固相微萃取-气相色谱-质谱联用技术(headspace solid-phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry,HS-SPME-GC-MS)测定发酵结束后固态样品挥发性物质(表1)。结果显示,相较其他菌株,X-23的挥发性物质总量达到(462.74±57.19) mg/kg,吡嗪类物质含量[(118.03±9.23) mg/kg]均显著高于X-9、X-30和X-41(P<0.05),X-9和X-41的吡嗪类产量无显著差异,因此选择X-23菌株作为自然传统筛选获得原始菌株进一步开展ARTP诱变接续选育。
表1 挥发性物质及吡嗪类含量 单位:mg/kg
Table 1 Volatile substances and pyrazine content
菌株编号挥发性物质总量吡嗪类物质含量X-9281.98±25.69d4.22±2.40cX-23462.74±57.19a118.03±9.23aX-30401.68±29.47b20.17±1.36bX-41342.67±53.16c10.91±2.73c
注：不同字母表示差异显著(P<0.05)。
2.2 ARTP诱变复筛吡嗪类高产菌株
使用ARTP对X-23菌株进行诱变,根据1.2.3节的方法进行ARTP处理,发现150 s后的菌株致死率大幅降低,从存活的菌株中随机挑选长势较好的11株诱变后菌株,编号M-0～M-10进行V-P显色,均呈阳性,选择M-0、M-6、M-8、M-10呈强阳性的4种菌株进行高粱固态发酵实验。如图1所示,出发菌株(X-23)挥发性物质总量为1 063.08 mg/kg,以愈创木酚、苯酚等酚类物质(611.01 mg/kg)为主,占比57.48%,同时检测出2.5-二甲基吡嗪、四甲基吡嗪2种吡嗪类物质。诱变菌株的挥发性物质总量显著提高,含量在1 728.66～2 554.17 mg/kg,相较于X-23提高62.61%～140.26%,M-0、M-8、M-10的酯类、酸类、醛类、吡嗪类含量显著提高,M-6的醇类(161.17 mg/kg)、吡嗪类(1 240.36 mg/kg)含量最高,是X-23的3.85倍和14.51倍,其中四甲基吡嗪的含量为1 027.52 mg/kg。诱变后吡嗪类物质的种类均增加,共检测到2,5-二甲基吡嗪、2,6-二甲基吡嗪、2,3,5-三甲基吡嗪、3,5-二乙基-2-甲基-吡嗪和四甲基吡嗪5种吡嗪物质,该物质一直被认为是白酒中的重要香气成分[22],此外,诱变后的菌株发酵挥发性物质中检测出2,3-丁二醇,普遍认为该物质可与吡嗪类前体物质乙偶姻相互转换[23],因此选择M-6作为高产吡嗪类目标功能菌株进行后续研究。
a-挥发性物质百分比;b-挥发性物质总量
图1 M-6与X-23的挥发性物质百分比、挥发性物质总量图
Fig.1 The percentage of volatile substances and total amount of volatile substances of M-6 and X-23
2.3 菌株分子生物学分析
对诱变前后的菌株X-23与M-6进行分子生物学鉴定。经ARTP诱变处理后,菌株M-6与原始菌株X-23的序列同源性仍高达99.8%,表明诱变未改变其物种属性,经NCBI数据库BLAST比对及系统发育分析(图2),2菌株与模式菌株枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)KCTC-13429聚于同一进化支,且同源性均高于99.2%,据此将2菌株鉴定为枯草芽孢杆菌。
图2 X-23与M-6的16S rRNA的系统进化分析
Fig.2 Phylogenetic analysis of 16S rRNA of X-23 and M-6
2.4 突变菌株M-6形态特征及生理生化鉴定
出发菌株和M-6生长曲线呈S型增长,在培养30 h后进入稳定期(图3-a)。在NA培养基上37 ℃培养30 h,诱变前后菌落形态呈不规则、有褶皱,较为干燥;革兰氏染色均呈阳性(图3-b);进一步通过扫描电镜观察到菌株形态均呈杆状,无鞭毛,但诱变后菌体变长,这可能由于ARTP诱变后导致菌株表观形态差异[24],有研究表明微生物形态改变与次级代谢产物密切相关[25]。例如,有研究通过ARTP诱变后蜡状芽孢杆菌个体形态变得细长,但菌落形态无显著变化,最终导致的结果却是其壳聚糖酶活性提高13.19%[26];还有研究利用枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)突变株JNC002.001经ARTP技术诱变后,孢子形成效率从38.13%骤降至0.33%,但纳豆激酶活性却显著提升1.84倍至300 FU/mL[27]。在本试验体系中,经ARTP技术诱变处理后,突变株M-6代谢产物中吡嗪类物质的含量呈现显著提升趋势,同时诱变后的菌株菌体显著变长(图4),这可能是突变株M-6胞内空间的扩张为各类代谢反应提供了更充足的物理容纳环境,而这种胞内微环境的优化可能通过提升代谢途径的运行效率[28],最终推动了挥发性代谢产物总量的增加,尤其促成了吡嗪类特征性物质的显著累积。
a-生长曲线;b-革兰氏染色
图3 M-6和X-23的生长曲线及革兰氏染色图
Fig.3 Growth curves of M-6 and X-23 and Gram staining images
图4 X-23与M-6扫描电镜图
Fig.4 X-23 and M-6 scanning electron microscope images
如表2所示,生理生化测定结果显示X-23和M-6淀粉水解、过氧化氢酶试验、柠檬酸盐试验、葡萄糖发酵试验、V-P试验、氧化酶试验呈阳性,而由于ARTP技术诱变,M-6明胶液化、丙二酸盐试验也呈现阳性,诱变后菌株代谢途径更加丰富,提高了蛋白质代谢的能力,表明提高了含氮化合物的代谢能力,为吡嗪类物质提供更多的前体物质[29]。结合分子测序分析结果,最终将M-6菌株鉴定为枯草芽孢杆菌属。
表2 X-23与M-6生理生化特性
Table 2 Physiological and biochemical characteristics of X-23 and M-6
指标M-6X-23明胶液化试验+-淀粉水解实验++过氧化氢酶试验++柠檬酸盐试验++丙二酸盐试验+-葡萄糖发酵试验(有氧)产酸不产气产酸不产气葡萄糖发酵试验(厌氧)产酸不产气产酸不产气甲基红试验--V-P试验++硝酸盐还原试验--苯丙氨酸脱氨酶--氧化酶试验++吲哚试验--
注：“+”表示阳性,“-”表示阴性。
2.5 诱变菌株M-6对糟醅实际发酵特性及挥发性物质的影响
将诱变菌株M-6进行糟醅实际发酵实验。结果显示,发酵结束后2组糟醅水分含量均呈轻微上升趋势(图5-a),这可能与微生物代谢过程中的水分释放有关,pH值则均出现一定程度降低(图5-b)。2组糟醅酸度均明显升高,且M-6组酸度显著高于CK组(图5-c),表明M-6菌株具有更强的产酸能力,结合挥发性物质进行综合分析,M-6糟醅挥发性物质总量提升了46.25%[(3 203.16±139.86) mg/kg],其中酯类、醇类、醛酮类、吡嗪类及苯酚类物质含量均显著增加,酯类作为最主要的挥发性物质,占比为72.24%,特征酯类物质中乙酸乙酯、己酸乙酯和丁酸乙酯分别提高了30.70%、34.75%和69.96%,该结果与杨阳等[30]的研究一致,其报道显示酒醅酸度显著增加的同时总酯含量明显提升,表明酸度可通过促进酸酯转化过程对挥发性物质组成产生调控作用。此外,M-6组中异戊醇和苯乙醇含量分别提高54.22%和11.38%。在吡嗪类物质方面,CK组仅检测出微量二甲基吡嗪(<0.2 mg/kg),而M-6组中检测到二甲基吡嗪[(21.37±2.82) mg/kg]、三甲基吡嗪[(27.23±1.95) mg/kg]和四甲基吡嗪[(60.71±1.42) mg/kg],已有研究指出芽孢杆菌属微生物是白酒发酵过程中的重要功能菌株,其生长迅速,能够分泌淀粉酶、蛋白酶等多种酶类,与吡嗪类物质的合成呈正相关,并对白酒风味的形成具有突出贡献[31],本研究结果与此一致,以实验结果的方式进一步验证了目标菌株M-6在糟醅实际发酵过程中不仅能够促进吡嗪类风味物质的合成,还能增强酯类物质的积累,为提升浓香型白酒的整体风味品质提供了数据支撑。但值得注意的是,与CK组相比,M-6组在发酵终点的乙醇含量显著降低14.28%(P<0.05),有研究报道部分乙醇在白酒发酵后期可进一步转化为酯类风味物质[32],这可能也是促成M-6组中酯类物质大量累积的重要原因之一。但不可否认的是,M-6组存在整体乙醇发酵性能的下降,乙醇含量与主要的挥发性风味物质含量均呈现此消彼长的变化规律,未来可以结合更多的多功能进化、合成微生物组策略、发酵工艺调控等途径深入开展研究,以期实现白酒发酵过程中乙醇含量与品质的协调平衡点。
a-水分;b-pH;c-酸度;d-乙醇;e-挥发性物质含量
图5 M-6糟醅发酵前后理化及挥发性物质含量图
Fig.5 M-6 Changes in the physicochemical properties and volatile substance content before and after the fermentation of the dregs
注:CK,对照组;M-6,实验组;“***”表示显著差异(P<0.01)。
3 结论
基于白酒酿造系统本源微生物,本研究通过平板涂布法联合高粱固态培养基纯培养模拟发酵评估,采取传统自然筛选获得1株具有相对高产吡嗪类物质菌株X-23,进一步利用ARTP技术进行诱变选育,得到1株高产吡嗪类物质的菌株M-6。研究结果表明,X-23和M-6菌株鉴定均为枯草芽孢杆菌属,经过诱变显著改变了功能菌株的菌体形态,间接提升了该菌株的代谢效率;在高粱固态发酵培养基纯培养模拟发酵中发现,目标功能菌株M-6的挥发性物质较原始菌株显著提高,其中吡嗪类物质产量高达1 240.36 mg/kg。此外,将诱变菌株M-6应用进行糟醅实际发酵实验,菌株强化糟醅实际发酵后,发现糟醅酸度显著提升而乙醇含量显著降低,挥发性物质总量显著提升(酯类物质为主要挥发性物质,占比高达72.24%),同时醇类物质、醛酮类和吡嗪类也均显著提升[吡嗪类物质含量为(110.06±3.85) mg/kg]。菌株M-6在糟醅实际发酵体系中表现出了较强的吡嗪类物质合成能力,该研究为我国传统白酒行业提升产品品质与创新酿造工艺提供了新的微生物资源与理论依据。
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