双曲酿造工艺中糟醅微生物群落与挥发性风味物质演变规律及相关性分析

在白酒生产过程中,所选用的糖化发酵剂会显著影响糟醅微生物群落的组成及其代谢活性,从而决定酒体风味物质的形成与构成。按照生产过程中使用的糖化发酵剂类型,白酒可划分为大曲白酒、小曲白酒和麸曲白酒等[1]。其中,大曲白酒作为主要种类之一,因其开放式制曲环境培育了丰富多样的微生物群落,从而赋予酒体独特的风味特征。然而,传统大曲白酒工艺依赖于窖池、陶坛、地缸等容器进行发酵,且存在劳动强度大、生产效率低、质量稳定性差、发酵周期长等问题,导致单位面积基酒产出率较低,产能扩张受限于漫长的发酵周期和巨大的资本投入[2-3]。随着智能制造理念的深入,白酒酿造行业也从粗放式生产向机械化、自动化、智能化和数字化生产转变,带来了行业经济效益的增加。目前,白酒配料、蒸馏、收酒等生产环节已基本实现自动化生产。然而,在窖池发酵方面,半机械化的生产状态仍然存在[4]。范伟国等[5]研制了一种清香型白酒立式发酵设备,将不锈钢发酵罐、温控装置、进出料系统等结合起来,使白酒生产完全实现机械化成为可能。程伟等[6]设计了一种清香型白酒固态发酵箱及其翻箱装置,提高了白酒生产自动化、智能化水平。目前清香型白酒已可采用不锈钢发酵槽车代替窖池发酵,配合高度机械化的润粮、蒸粮、蒸酒、粮糟输送、摊晾、加曲装置,已可实现高度机械化、智能化生产,而以目前的技术条件,浓香型白酒酿造还离不开窖泥,仍主要采用窖池发酵[7]。麸曲是采用熟麦麸为基质,接种纯种曲霉、根霉、酵母菌等,通过控制温度、湿度等条件培养,烘干、粉碎而成的发酵剂[8],使用麸曲酿造白酒虽然出酒率较高,但通常风味较为单一。研究发现,根霉和酵母混合培养制作麸曲能使二者互利共生,最终达到提高出酒率的效果[9-10]。因此,本研究以不锈钢独立发酵槽代替传统窖池,以混合均匀后的中温大曲和麸曲作为糖化发酵剂,开发了一款适合机械化、智能化生产的新风格基酒,满足多样化的市场需求。

白酒的风味是决定其品质的最重要因素[11]。近年来,随着组学技术的快速发展,白酒酿造过程中糟醅微生物演替规律及其与风味形成的关联性研究已成为热点。贾勇磊等[12]以不同发酵时间点的泸型酒糟醅为研究对象,对其微生物群落和挥发性代谢物进行关联分析,结果表明,糟醅微生物和挥发性代谢物有明显的时间特征,其组成和含量随着发酵时间的延长不断变化。Lactobacillus、Limosilactobacillus、Weissella、Thermoascus、Thermomyces、Issatchenkia等是糟醅发酵的优势菌群,其与己酸乙酯、乳酸乙酯和乙酸乙酯等163种代谢物质生成具有密切的关系。陈卓等[13]应用Illumina MiSeq高通量测序技术和顶空固相微萃取-气相色谱质谱联用(headspace solid-phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry,HS-SPME-GC-MS)技术解析洞酿酱香型白酒第3轮次糟醅发酵过程中微生物多样性与挥发性风味物质变化,相关性结果表明,曲霉属(Aspergillus)与大多数酯类物质呈极显著正相关(P<0.01),Priceomyces和乳杆菌属(Lactobacillus)与十七烷酸乙酯呈极显著正相关(P<0.01)。在糟醅发酵过程中,理化指标会影响其中微生物的生长代谢、酶的活性,进而造成微生物群落的改变,从而对白酒风味品质造成影响[14]。因此,通过解析微生物群落与理化指标、酶活力及风味物质之间的相互作用关系,能够更深入地掌握白酒发酵机理,提升发酵过程的可控性,最终实现白酒品质的优化提升。

综上所述,本研究以双曲酿造白酒工艺糟醅为研究对象,综合运用HS-SPME-GC-MS及高通量测序技术,系统解析发酵过程中糟醅微生物群落结构与挥发性风味物质的动态变化规律及其关联机制。将为双曲酿造工艺的精准调控与优化提供理论依据,对提升白酒品质及工艺标准化产生重要的实践价值。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

NaCl、HCl、H2SO4、CuSO4、亚甲基蓝、酒石酸钾钠、亚铁氰化钾、乙酸钠、冰乙酸、Na2HPO4、柠檬酸、NaOH等(分析纯),国药集团化学试剂有限公司;可溶性淀粉、葡萄糖(分析纯),成都市科隆化学品有限公司;2-辛醇(色谱级),上海麦克林生化科技股份有限公司;MagBeads FastDNA Kit for Soil土壤基因组DNA提取试剂盒,美国MP Biomedicals公司。

1.2 仪器与设备

GCMS-QP2020 NX气质联用仪,日本岛津有限公司;HP-INNOWAX毛细管色谱柱(60 m×0.25 mm×0.25 μm),美国安捷伦公司;PALRTC全自动前处理进样平台、DVB/CarbonWR/PDMS-120 μm萃取头,广州智达实验室科技有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 样品采集及保存

双曲发酵糟醅取自四川泸州某酒厂取样,双曲酿造白酒的生产以不锈钢独立发酵槽(2.5 m×2.5 m×2.5 m)为容器,其酿造工艺流程图如图1所示。根据发酵时间取发酵0(入窖)、1、2、3、4、6、8、10、12、15 d(出窖)的糟醅(分别编号为S1、S2、S3、S4、S6、S8、S10、S12、S15),取样方法参考专利[15],设置3个不锈钢独立发酵槽作为平行,将所取样品分为5份,理化、酶活和风味样品于-20 ℃下保存,微生物和备样于-80 ℃下保存。

1.3.2 理化指标和酶活力检测

发酵温度使用探针式电子温度计检测,糟醅水分、酸度、还原糖、淀粉、酒精度参照DB34/T 2264—2014《固态发酵酒醅分析方法》,糖化酶活力、液化酶活力参照王丹丹[16]的方法,发酵力参照QB/T 4257—2011《酿酒大曲通用分析方法》。

1.3.3 挥发性风味物质检测

样品前处理:称取2 g混匀后的糟醅,加入20 mL去离子水混合并在4 ℃下振荡30 min,4 ℃、10 000 r/min 离心10 min后取上清液,通过0.22 μm膜过滤。吸取5 mL滤液于20 mL顶空样品瓶中,加入2 g NaCl和10 μL内标(2-辛醇0.242 g/L)。采用自动进样,加热振荡器设置温度为60 ℃,振荡速度450 r/min,平衡时间5 min,萃取头顶空吸附45 min,热解吸5 min。

GC条件:HP-INNOWAX毛细管色谱柱(60 m×0.25 mm×0.25 μm),载气采用高纯度He(纯度>99.999%),采用恒线速度模式和分流进样模式,分流比2∶1,柱流量0.98 mL/min,进样口温度250 ℃,升温程序为45 ℃保持3 min,以3 ℃/min升至145 ℃,再以6 ℃/min升温至200 ℃,再以15 ℃/min升至235 ℃保持8 min。

MS条件:电子电离源,离子源温度230 ℃,接口温度250 ℃,电子能量70 eV,质量扫描范围35.00～500.00 m/z。

定性及半定量分析:以保留时间及保留指数为定性依据,通过美国国家标准技术研究所(National Institute of Standards and Technology,NIST)20谱库检索,筛选并去除相似度<80%的峰和硅氧烷类杂质。利用各化合物峰面积与内标物质峰面积之比,计算出各挥发性风味物质的含量。

1.3.4 微生物群落结构的扩增子测序

糟醅总DNA提取:参照土壤基因组DNA提取试剂盒说明书提取样本DNA。

PCR扩增定量:以稀释后的基因组DNA为模板,根据测序区域的选择,使用带Barcode的特异引物和高效高保真酶进行PCR,确保扩增效率和准确性。使用正向引物338F(ACTCCTACGGGAGGCAGCA)和反向引物806R(GGACTACHVGGGTWTCTAAT)对细菌16S V3～V4区进行扩增。使用正向引物ITS5F(GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG)和反向引物ITS1R(GCTGCGTTCTTCATCGATGC)对真菌 ITS1 区进行扩增。由上海派森诺生物科技股份有限公司在Illumina MiSeq 2500平台上进行双端测序。获得的原始数据由该公司提供的云平台分析系统进行深度处理和分析。

1.4 数据处理

使用GraphPad Prism 10.1.2和Origin 2025软件对理化性质、酶活力、风味变化规律进行作图,微生物Alpha多样性与物种组成分析由派森诺基因云平台提供(https://www.genescloud.cn)。使用R语言代码计算Spearman相关系数,Gephi.0.10.1对关联网络可视化。

2 结果与分析

2.1 糟醅发酵过程中理化性质、酶活力变化规律分析

糟醅发酵期间的热量主要源自微生物生长代谢所产生的生物热,通过监测发酵体系温度的动态变化,可有效评估糟醅微生物群落的代谢活性水平。如图2-a所示,糟醅的入窖温度为23.8 ℃,发酵前期温度迅速上升,到4 d时升至顶温37.3 ℃。其中,在发酵的3～6 d,糟醅温度均稳定在37 ℃左右,6 d以后温度开始缓慢下降,到出窖前,糟醅温度降低至29.6 ℃。可以发现,双曲酿造过程中,糟醅顶温达到37.3 ℃,高于单独中温曲发酵的30 ℃左右[17],推测是由于麸曲中的霉菌和酵母菌在发酵前期更为活跃导致产生更多热量。水是白酒发酵过程中所有生化反应的必需介质,微生物的生长代谢及其微环境中的物质循环、能量转换和信息传递都直接或间接依赖于水的参与[18],当水分含量不足时,不仅会影响高粱原料的充分糊化,还会导致环境水分活度无法满足微生物正常生长的需求[19]。整个发酵过程中,糟醅水分的变化范围为51.85%～61.48%,在糟醅发酵的0～4 d,糟醅水分从51.85%迅速上升至59.70%,之后水分上升速率变缓,在出窖前,糟醅水分含量为61.48%。一方面是发酵过程物质降解代谢水分,另一方面固体物质消耗浓缩水分。

淀粉是微生物生长繁殖的主要碳源,糟醅在发酵过程中,淀粉在微生物的作用下水解成葡萄糖等单糖,并在各种酶的作用下转化成酒精,因此淀粉和还原糖的含量间接反映了白酒发酵进程的基本情况[20]。如图2-b所示,糟醅淀粉含量的变化范围为13.47%～26.6%,在发酵的0～4 d,糟醅淀粉含量迅速从26.6%下降到15.60%,之后下降速率变缓,到出窖前,糟醅淀粉含量为13.47%。糟醅还原糖含量在0 d时为2.59%,在1 d时有所上升,达到4.65%,说明此时微生物将淀粉分解为还原糖的速率大于消耗还原糖的速率,从而导致还原糖含量上升。1 d以后糟醅还原糖含量迅速下降,并于6 d以后保持相对稳定,出窖前糟醅还原糖含量为0.14%。

糟醅酸度的提升主要来源于乳酸菌的代谢产生,合适的酸度能抑制部分有害微生物的生长,为有益微生物提供良好的生长环境[21]。如图2-c所示,在发酵过程中,糟醅酸度的变化范围为0.85～2.16 mmol/10 g,在发酵的0～2 d糟醅酸度上升缓慢,仅从0.85 mmol/10 g上升至0.89 mmol/10 g,之后酸度上升速率有所上升,可能是由于产酸菌多为厌氧菌,当窖内氧气消耗殆尽时产酸菌开始大量生长繁殖,使糟醅酸度快速上升[22]。到出窖前,糟醅酸度为2.16 mmol/10 g。酒精是糟醅发酵的主要产物,酒精度的高低是鉴定出窖糟醅的主要质量指标,也是判断发酵过程是否正常的重要依据。0 d时糟醅内无酒精生成,6 d时酒精度升至8.78%vol后上升速率减缓,到出窖前,糟醅酒精度为9.76%vol。

白酒酿造是边糖化边发酵的过程,因此对发酵糟醅液化酶活力、糖化酶活力和发酵力进行检测对了解糟醅发酵进程具有重要意义[16]。如图2-d所示,糟醅发酵过程中,液化酶活力与糖化酶活力均在1 d时上升到最大值,分别为1 572.11、1 167.48 U/g,这是由于发酵初期窖内氧气充足,加上麸曲中霉菌具有较高活性,使其迅速生长繁殖并产生液化酶和糖化酶。之后由于温度、酒精度、酸度、氧气等的变化,使产酶微生物与酶活性受到抑制导致迅速下降,在6 d后维持相对稳定。酵母菌等微生物利用糖化酶、液化酶等产生的葡萄糖代谢乙醇和CO2[23],发酵力可直观显示出糟醅在发酵过程中酵母菌等微生物代谢酒精的能力,在糟醅发酵的0～3 d,发酵力由0.13 U迅速上升至0.87 U,之后维持相对稳定,在8 d后略有降低,到出窖前,糟醅发酵力为0.75 U。由此可知:双曲进入糟醅发酵体系后,在发酵前期其麸曲为主体的霉菌、酵母菌在有氧条件下进一步生长繁殖并进行酶的代谢,使得酶活力指标攀升,促进糖化、产酒发酵进程,而随着发酵的进行,窖内氧气、酸度、酒精度等环境因素的改变导致其生长繁殖、代谢等生命活动受抑制从而使糟醅酶活力降低。

2.2 糟醅发酵过程中挥发性风味物质组成及变化规律分析

采用HS-SPME-GC-MS技术检测双曲发酵过程糟醅,共检测出114种挥发性风味物质,其中酯类60种、酸类9种、醇类24种、醛酮类11种、其他类10种。

如图3-a所示,在发酵前期,糟醅中醇类物质的种类逐渐增加并在3 d时达到最高(16种)。随着发酵过程的进行醇类物质种类有所下降,并保持在12种左右。整个发酵过程中,糟醅中酸类物质种类无明显变化规律,保持在6～9种。酯类物质的种类呈增加趋势,在15 d时糟醅中酯类物质的种类最多,为42种,醛酮类和其他类物质在发酵过程中并没有体现出明显的变化规律,保持在9种以下。

如图3-b所示,在0～3 d时,糟醅中醇类和酸类物质含量逐渐升高,在3 d时含量分别为27.85、2.33 mg/L,但在4 d时有所降低,之后又呈增加趋势,15 d时含量分别为31.44、5.22 mg/L,出窖糟醅中,含量较高的醇类和酸类物质包括异戊醇、苯乙醇、乙酸、辛酸、己酸等,在整个发酵期内,酯类物质含量一直增加,从0 d的10.26 mg/L升到15 d的113.26 mg/L,出窖糟醅中含量较高的酯类物质为丁二酸二乙酯、棕榈酸乙酯、乙酸乙酯、乳酸乙酯、己酸乙酯等。醛酮类和其他类物质的变化则无明显规律,分别在1.21～2.15 mg/L和1.57～4.77 mg/L。另外,由图3-c可知,糠醇、顺-3-壬烯醇、异丁酸、2-辛酮、反式-肉桂酸乙酯、甲酸庚酯、苯乙酸乙酯等风味物质在发酵前期含量较高,随着发酵的进行逐渐降低甚至消失,说明此类风味多为发酵前期相对丰度含量较高的微生物产生,随着发酵的进行被其余微生物利用,合成其他风味物质。异丁醇、异戊醇、苯乙醇、4-乙烯苯酚等风味物质含量在发酵过程中呈现波动上升趋势,说明此类风味物质在整个发酵过程中被微生物不断合成与利用。丁二酸二乙酯、棕榈酸乙酯、亚油酸乙酯、乙酸乙酯、乳酸乙酯等风味物质随着发酵的进行含量逐渐升高,说明此类风味物质为双曲发酵过程中的主要产物。

2.3 糟醅发酵过程中微生物群落演替规律分析

2.3.1 微生物Alpha多样性分析

如表1所示,所有样本的Good’s_coverage指数均在99.9%以上,说明测序结果能很好地反映样本中细菌、真菌的真实组成。Chao1指数代表样本中物种的丰富度,指数越大,表明物种丰富度越高,糟醅发酵过程中真菌丰富度总体上呈先降低后升高趋势,细菌丰富度变化则与之相反。Shannon指数和Pielou_e指数分别代表样本中物种的多样性和均匀程度,指数越大,表明物种多样性和均匀程度越高,糟醅发酵过程中真菌多样性和均匀程度总体上呈上升趋势,细菌多样性和均匀程度则是到3 d时升至最高后开始明显降低,且0～3 d时多样性和均匀程度真菌<细菌,4 d及以后多样性和均匀程度真菌>细菌。综上所述,在糟醅发酵前期,微生物群落物种丰富度、多样性和均匀程度均为真菌<细菌,随着发酵的进行微生物群落物种丰富度、多样性和均匀程度转变为真菌>细菌。

2.3.2 微生物演替规律分析

如图4-a所示,发酵过程糟醅样品中共检测出5个真菌门类,其中优势菌门为子囊菌门(Ascomycota)、毛霉门(Mucoromycota)、担子菌门(Basidiomycota),在整个发酵过程中,Ascomycota的平均相对丰度为94.76%,占据绝对优势,Ascomycota是多种香型白酒及食醋等发酵食品中的优势真菌门[24]。高丰度的Ascomycota对驱动糟醅活性微生物群落变化起重要作用[25]。Mucoromycota在1～4 d时相对丰度较高,分别为11.24%、12.63%、6.67%、4.81%,而Basidiomycota在整个发酵过程中相对丰度处于较低水平。

如图4-b所示,发酵过程糟醅样品中共检测出76个真菌属,其中优势菌属(平均相对丰度>1%)共10种,包括嗜热真菌属(Thermomyces)、踝节菌属(Rasamsonia)、曲霉属(Aspergillus)、嗜热子囊菌属(Thermoascus)、酿酒酵母属(Saccharomyces)、复膜孢酵母属(Saccharomycopsis)等。发酵开始时, Thermomyces为主导菌属,随着发酵的进行其相对丰度逐渐降低,变化范围为50.45%～15.54%,Thermomyces具有产生高活力耐高温酶类的能力,这些酶能够有效降解糟醅中的淀粉和半纤维素,促进微生物对酿酒原料的利用,从而产生特定的风味物质[26-27]。到发酵结束时,主导菌属转变为Rasamsonia,其相对丰度变化总体上呈逐渐升高的趋势,变化范围为4.31%～44.51%。另外,Aspergillus、Thermoascus、Saccharomyces的相对丰度总体上均呈先升高后趋于稳定的变化规律,而Saccharomycopsis和Rhizopus作为兼性厌氧和好氧菌,在发酵前期由于氧气含量充足使其具有较高的相对丰度,从0 d的1.51%和0.58%,于1～2 d升至最高相对丰度分别为23.49%和12.59%,之后由于氧气消耗导致其相对丰度迅速下降,到发酵结束时相对丰度仅分别为1.82%和0.88%。

如图5-a所示,发酵过程糟醅样品中共检测出17个细菌门类,其中优势菌门为厚壁菌门(Firmicutes)、变形菌门(Proteobacteria)、放线菌门(Actinobacteriota),在整个发酵过程中,Firmicutes的平均相对丰度为88.09%,占据绝对优势,此外Proteobacteria和Actinobacteriota在0～3 d相对丰度较高,并分别于1 d和2 d到达最高相对丰度(30.67%和25.76%)。WANG等[28]研究发现,Firmicutes和Proteobacteria是浓香型和芝麻香型白酒酿造过程中主要的菌群。王欢等[29]研究发现,在酱香型白酒堆积发酵过程中Firmicutes、Proteobacteria和Actinobacteriota是主要的优势菌群。

如图5-b所示,发酵过程糟醅样品中共检测出268个细菌属,其中优势菌属共11种,包括乳杆菌属(Lactobacillus)、粘液乳杆菌属(Limosilactobacillus)、魏斯氏菌属(Weissella)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、糖多孢菌属(Saccharopolyspora)、高温放线菌属(Thermoactinomyces)等。在糟醅发酵前期(0～3 d)细菌群落物种多样性较高,Weissella、Staphylococcus、Saccharopolyspora、Kroppenstedtia等微生物相对丰度较高,为此时间段的主导菌属,其变化范围分别为21.64%～34.37%、8.88%～14.07%、3.71%～22.03%、4.38%～13.32%,在糟醅发酵3 d以后,细菌群落物种多样性逐渐降低,Lactobacillus和Limosilactobacillus成为糟醅中的主导菌属,在发酵的6～15 d,二者平均相对丰度之和>98%,占据绝对优势。具体来看,0 d时Lactobacillus和Limosilactobacillus相对丰度仅分别为0.11%和0.02%,且于0～2 d均保持极低水平,3 d时二者相对丰度有较大提升,分别达到19.73%和21.64%,随着发酵过程的推进Lactobacillus的相对丰度逐渐上升,到10 d时达到最大值90.52%后有所下降,到发酵结束时,其相对丰度为76.72%。已有研究报道Lactobacillus是清香型、浓香型白酒酿造过程中糟醅中的优势菌属[30-31],也是白酒发酵过程中微生物演替的生物标志微生物[32]。对于Limosilactobacillus而言,其相对丰度于4 d时到达最大值39.65%后又逐渐降低,到10 d后有所回升,直到发酵结束时,其相对丰度为21.79%。

为探究双曲糟醅发酵过程中微生物之间的相互作用关系,对属水平相对丰度>0.01%的微生物基于Spearman相关系数(P<0.05且|ρ|>0.7)构建相关性网络,结果如图6所示,微生物相关性网络共得到59个节点和713条边,网络的平均聚类系数为0.812。相关性网络图中共6个菌门(3个细菌、3个真菌),其中节点总数占比细菌门(71.19%)>真菌门(28.81%),细菌和真菌中占比最大的门类分别为厚壁菌门(Firmicutes,35.60%)和子囊菌门(Ascomycota,18.64%)。根据微生物之间的相关性可知,正相关关系占84.29%,负相关关系占15.71%,表明在整个发酵过程中,微生物之间主要为协同作用。在负相关关系中,Firmicutes和Ascomycota作为发酵后期的绝对优势菌门,与其余菌门间均存在负相关关系,因此认为二者与其余菌门的拮抗作用可能是推动发酵过程中微生物群落结构演变的原因之一。

关键物种通常被理解为在被移除后会对群落产生不成比例的有害影响的物种[33],对维持生态系统结构、生物多样性和功能稳定性具有决定性作用。进一步通过筛选关键物种探究影响发酵糟醅微生物群落稳定性的物种,以度(degree,≥20)、接近中心性(closeness centrality,≥0.6)和中介中心性(betweenness centrality,≤20)为条件筛选关键物种[33-34]。结果如表2所示,在该筛选条件下共得到21种关键物种,其中Thermoactinomyces、Bacillus、Staphylococcus、Weissella、Unclassified_f_Pseudonocardiaceae、Kroppenstedtia和Saccharopolyspora共7种菌属的相对丰度>1%,而Pseudomonas、Monascus、Pantoea、Furfurilactobacillus、Companilactobacillus、Glutamicibacter等14种相对丰度<1%的菌属同样对维持微生物群落结构稳定性起到关键作用。值得注意的是,一些平均相对丰度较高的优势菌属如Rasamsonia、Lactobacillus、Thermomyces、Limosilactobacillus等均不属于关键物种且在共现网络中的作用远不及丰度较低的菌属,这一现象表明,高丰度微生物往往具有高度特化的代谢功能,使其能够在特定环境(如低pH、低氧或营养限制)中独立生存;具备完整的代谢通路,能够自主合成必需物质并且具有更强的资源获取能力和竞争能力,从而导致其与其他菌属间共现关系多表现为中性或者拮抗作用,与文悦等[32]的研究结果一致。

2.4 糟醅发酵过程中微生物与挥发性风味物质相关性分析

通过Spearman相关性分析了发酵过程中平均相对丰度>1%的21种微生物菌属与114种挥发性风味物质之间的关系,选择系数|ρ|>0.6且显著性P<0.05构建了相关性网络(图7),结果表明,乙酸、乙酸乙酯、乳酸异戊酯、丁二酸二乙酯、亚油酸乙酯等12种挥发性风味物质的连接度最高(13),值得注意的是,与这12种挥发性风味物质呈显著相关的微生物完全一致,均为Rasamsonia、Unclassified_f_Pseudonocardiaceae、Thermomyces、Weissella、Saccharopolyspora、Klebsiella、Gluconobacter、Bacillus、Unclassified_f_Aspergillaceae、Lactobacillus、Staphylococcus、Thermoactinomyces和Kroppenstedtia。其中,Unclassified_f_Pseudonocardiaceae和Rasamsonia分别为连接度最高的细菌属和真菌属(32和36),Unclassified_f_Pseudonocardiaceae与异戊醇、乙酸、乙酸乙酯、棕榈酸乙酯等31种挥发性风味物质呈显著负相关,仅与异丁酸呈显著正相关,Rasamsonia与乙酸、苯乙醇、乙酸乙酯、乳酸乙酯、丁二酸二乙酯等32种挥发性风味物质风味呈显著正相关,仅与甲酸庚酯、反式-肉桂酸乙酯、糠醇和异丁酸呈显著负相关。除Rasamsonia外,Lactobacillus和Unclassified_f_Aspergillaceae均具有较高的连接度(均为28)且与较多重要风味物质如苯乙醇、乙酸、乙酸乙酯等呈显著正相关(27和24),因此认为Rasamsonia、Lactobacillus和Unclassified_f_Aspergillaceae是风味物质形成的重要贡献者[35]。

2.5 糟醅发酵过程中微生物与理化指标、酶活力相关性分析

为了探究理化指标、酶活力与微生物群落之间的相关性,计算了理化指标、酶活力与发酵过程中平均相对丰度>1%的微生物菌属Spearman相关系数并绘制相关性热图,结果如图8所示。

还原糖、淀粉、糖化酶活力、液化酶活力与Thermomyces、Weissella、Staphylococcus、Saccharopolyspora、Thermoactinomyces、Bacillus等菌属显著正相关(P<0.001),表明此类菌属在双曲酿造过程中主要参与糟醅糖化过程。水分、酸度、酒精度与Lactobacillus、Rasamsonia、Unclassified_f_Aspergillaceae呈高度显著正相关(P<0.001),与Limosilactobacillus、Aspergillus呈极显著正相关(P<0.01),Saccharomyces的生长温度较高,同时其生命活动会释放出大量生物热,造成糟醅温度的升高[36],且能发酵还原糖产生酒精导致其与发酵力、温度与呈高度显著正相关(P<0.001),另外,Limosilactobacillus也与温度与发酵力呈高度显著正相关(P<0.001)。值得注意的是,与淀粉、还原糖、糖化酶活力、液化酶活力呈显著正相关的菌属多为发酵前期的主导菌属,而与水分、酸度、酒精度、发酵力呈显著正相关的菌属多为发酵后期的主导菌属,这些结果表明,理化参数对微生物群落的形成具有很强的选择性作用。

3 结论与讨论

本研究以不锈钢独立发酵槽代替传统窖池,以混合均匀后的中温大曲和麸曲作为糖化发酵剂,开发了一款适合机械化、智能化生产的新风格基酒,采用高通量测序技术和顶空固相微萃取-气相色谱质谱联用技术研究双曲发酵糟醅微生物群落结构以及挥发性风味物质,同时还对其理化指标、酶活力进行检测,并通过关联性分析探究微生物与风味、理化和酶活力之间的相关性。研究发现,发酵过程糟醅中共检测出114种挥发性风味物质,其中酯类60种、酸类9种、醇类24种、醛酮类11种、其他类10种。共检测出76个真菌属和268个细菌属,相对丰度>1%的真菌属共10种,细菌属共11种,其中Thermomyces、Aspergillus、Weissella等为发酵前期(0～3 d)的主导菌属,Rasamsonia、Lactobacillus、Limosilactobacillus等为发酵后期(4～15 d)的主导菌属。通过对微生物间的相关性共现网络分析发现,厚壁菌门(Firmicutes)和子囊菌门(Ascomycota)与其余菌门的拮抗作用可能是推动发酵过程中微生物群落结构演变的原因之一,通过筛选双曲发酵过程中的关键物种,发现优势菌属和平均相对丰度<1%的菌属均能对维持微生物群落结构稳定性起到关键作用。通过对微生物和风味物质的相关性网络分析发现,Rasamsonia、Lactobacillus和Unclassified_f_Aspergillaceae是双曲酿造过程中风味物质形成的重要贡献者。理化指标、酶活力与微生物群落间相关性分析表明,淀粉、还原糖、糖化酶活力、液化酶活力呈显著正相关的菌属多为Thermomyces、Weissella、Staphylococcus等发酵前期的主导菌属,而与水分、酸度、酒精度、发酵力呈显著正相关的菌属多为Lactobacillus、Rasamsonia等发酵后期的主导菌属,而发酵力、温度仅与Limosilactobacillus、Saccharomyces呈高度显著正相关。本研究阐明了双曲发酵过程中理化指标、酶活力、风味物质和微生物群落的动态变化规律及其相关性,对双曲酿造工艺生产过程控制及工艺优化具有重要的参考价值。目前对于双曲酿造工艺的研究还存在较大局限性,后续将从不同比例大曲与麸曲的混合对微生物组成及演替的影响以及不锈钢发酵槽与传统窖池内发酵的差异性等方向进行探索,进一步优化发酵工艺,提升白酒品质。

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