黄油作为一种重要的乳制品,其品质核心取决于乳脂风味的丰富性与平衡性。传统发酵黄油的风味形成依赖于乳酸菌对乳成分的代谢转化,需长达24～48 h的生产周期,且存在风味单一、特征化合物含量低(如丁酸乙酯<3%、苯乙醛<1%)的缺陷[1]。为突破这一局限,酶工程技术被引入乳制品风味调控领域,其通过高效释放风味前体物质或直接生成挥发性风味化合物,显著克服了传统微生物发酵存在的周期长和风味单一等问题[1-2]。脂肪酶和蛋白酶在乳制品风味改良中展现出独特优势:脂肪酶可特异性水解乳脂甘油三酯,释放具有奶油香、果香特征的短链脂肪酸(short-chain fatty acid,SCFAs)[3],脂肪酶的有效性因其区域特异性、脂肪酸链长度特异性和立体特异性而差异很大,Palatase 20000L以其高水解效率著称,酶解过程中产生挥发性有机化合物,如丁酸、己酸、己醛、2-壬酮、2-十一酮和δ-十二内酯[4];蛋白酶则降解乳蛋白生成游离氨基酸和小分子肽,通过Strecker降解或微生物转化形成醛类、酮类等风味物质[5]。
尤其值得关注的是,双酶协同或酶-发酵联用的工业化潜力已在多项研究中得到验证。胡鹏丽等[6]使用脂肪酶结合磷脂酶的双酶法对稀奶油进行酶解,制得香气纯正、浓郁的奶味香精,通过GC-MS分析,酶解产物的风味物质主要是丁酸、辛酸、癸酸和一些内酯等物质。GAO等[7]使用木瓜蛋白酶酶解辅助乳酸发酵蛋清,发现与酸奶特征风味相关的二乙酰、乙醛、丙酮、酸、醇和酮水平显著增加,芳香族氨基酸和鲜味氨基酸的含量也显著增加。肖琳等[8]采用脂肪酶酶解结合植物乳植杆菌、德氏乳杆菌保加利亚亚种、双歧乳杆菌与唾液链球菌嗜热亚种作为外加复合发酵菌剂的多种微生物发酵作用对黄油进行风味改良,产品的酸香韵、奶香韵和厚重感均有显著增强。
单一酶处理或酶-发酵简单联用已展现出一定潜力,现有研究仍存在两大瓶颈,一是双酶与发酵的级联效应缺乏系统解析,尤其对关键挥发性化合物的形成路径与协同机制尚未明确,二是底物竞争未解决,同步酶解导致脂肪酸与氨基酸前体共存,引发微生物代谢分流,降低风味合成效率。本研究提出一种“分步酶解预处理-微生物发酵”协同体系,通过时序性控制前体释放路径,优先脂肪酶预处理水解乳脂释放SCFAs(如丁酸、己酸),为乳酸菌提供初始碳源;蛋白酶接力处理,在SCFAs代谢基础上释放疏水性氨基酸(如亮氨酸、苯丙氨酸),规避底物竞争;最后定向发酵转化,前体经微生物代谢高效转化为丁酸乙酯(奶油香)、2-庚酮(奶酪香)及苯乙醛(焦糖香)[4-5]。该策略将发酵周期缩短至12～18 h,显著提升风味多样性,为黄油生产的高效化与品质升级提供技术支撑。
1 材料和方法
1.1 关键材料
脂肪酶Palatase 20000L(酶活力≥20 000 LU/g)、蛋白酶:Flavorzyme® 1000L(酶活力500 LAPU/g)、Neutrase® 0.8L(酶活力0.8 AU/g)、Protamex® 1.6(酶活力1.6 AU-N/g)、NS 37071(酶活力≥4 AU-A/g),诺维信(中国)生物技术有限公司,参照厂商提供的技术手册使用[4]。
菌种:德氏乳杆菌保加利亚亚种(Lactobacillus bulgaricus subsp. bulgaricus)和唾液链球菌嗜热亚种(Streptococcus salivarius subsp. thermophilus)按活菌比例3∶2复配,中国台湾亚芯生物企业有限公司。
其他试剂:浓缩乳清蛋白粉wpc80(蛋白含量80%),美国glanbia公司;O-邻苯二醛、三氯乙酸(trichloroacetic acid,TCA)、无水硼酸钠、L-丝氨酸,上海麦克林生化科技股份有限公司;β-巯基乙醇,美国Sigma-Aldrich公司。
1.2 实验方法
1.2.1 分步酶解及发酵工艺
将黄油与去离子水按料液比=1∶3(g∶mL)混合,调节pH值至7.0,添加0.5% (质量分数) Palatase 20000L,于50 ℃搅拌反应4 h[3]。反应结束后85 ℃灭酶15 min,离心(10 000×g,15 min)收集上清液,脂肪酶酶解上清液依据 GB 5009.229—2025《食品安全国家标准 食品中酸价的测定》测定酸值(以KOH计,mg/g)。将脂肪酶处理液与浓缩乳清粉按1∶9的质量比混合,分别添加0.5% (质量分数) 的4种蛋白酶(Flavorzyme®、Neutrase®、Protamex®、NS 37071),按各自最适条件[Flavorzyme®:50 ℃, pH 7.0;Neutrase®:45 ℃, pH 6.5;Protamex®:55 ℃, pH 6.0;NS 37071:50 ℃, pH 7.0(参照Novozymes®厂商提供的NS 37071技术手册)]反应2 h[5,9]。灭酶后离心取上清液,通过以下指标筛选最佳蛋白酶:水解度(degree of hydrolysis,DH):采用OPA法测定[10];疏水性肽段比例:HPLC分析(C18柱,乙腈-水梯度洗脱)[10-11];
苦味值:感官评价(10人专家组按0～5 分评分),本研究组建专业感官评价小组,参照ISO 13299:2016标准进行定量描述分析(quantitative descriptive analysis, QDA)。具体流程如下,按照GB/T 16291.1—2012《感官分析 选拔、培训与管理评价员一般导则 第1部分:优选评价员》招募10名成员(5男5女,年龄25～40岁),于独立实验室将酶解黄油融化后冷却至(10±1) ℃,每份5 g装入棕色玻璃瓶,采用 0～5分标度法进行评分(表1)[12-13]。苦味值参照物:咖啡因;鲜味参照物:谷氨酸钠(monosodium glutamate, MSG)溶液,均以质量分数表示;奶香参照物:新鲜稀奶油。
表1 黄油感官评价表
Table 1 Butter Sensory Evaluation Sheet
分值苦味苦味参照物浓度鲜味鲜味参照物浓度奶香味奶味参照物0无苦味纯净水无鲜味纯净水无奶香味纯净水1微弱苦味(可察觉)0.05% 咖啡因微弱鲜味0.05% MSG微弱奶香味低脂牛奶2轻度苦味(明显)0.08% 咖啡因轻度鲜味0.10% MSG轻度奶香味全脂牛奶3中度苦味(较强)0.12% 咖啡因中度鲜味0.15% MSG中度奶香味稀奶油4重度苦味(不愉悦)0.18% 咖啡因强烈鲜味0.20% MSG 重度奶香味融化黄油5极强苦味(难以接受)0.25% 咖啡因极致鲜味0.30% MSG极致奶香味奶酪
将经过脂肪酶和蛋白酶处理后的灭酶黄油乳清混合液,冷却后添加0.1%的混合乳酸菌种(德氏乳杆菌保加利亚亚种∶唾液链球菌嗜热亚种=3∶2),42 ℃发酵8 h,发酵结束65 ℃,30 min灭菌,测定发酵过程中pH值和OD600值变化[14]。
1.2.2 挥发性成分分析
样品制备:分别于脂肪酶处理、蛋白酶处理及发酵终点取样,称取样品3 g于萃取瓶中,加入转子,70 ℃预平衡5 min,使用老化完成的50/30 μm DVB/CAR/PDMS SPME萃取头(270 ℃老化30 min)在70 ℃温度下顶空吸附40 min,SPME萃取头在GCMS进样口中250 ℃热解吸5 min。色谱条件:HP-5MS UI,60 mm×0.25 mm×0.25 μm,进样口250 ℃,载气 He(1 mL/min),升温程序:50 ℃(3 min)-2 ℃/min-180 ℃-20 ℃/min-300 ℃(10 min);质谱条件:EI 源(70 eV),离子源230 ℃,扫描范围 29～550 amu;数据分析:结果采用Agilent 5977B对样品进行分析[15]。结合 Nist14 和自建香料谱库进行定性检索,匹配度>80% (或设定阈值) 且保留指数 (retention index,RI) 与标准品/文献值吻合 (±20 units) 的化合物予以确认。必要时使用标准品进行保留时间确证。各挥发性化合物的相对含量以其 GC-MS 总离子流图(total ion current chromatogram,TIC) 的峰面积相对于所有鉴定出化合物总峰面积的百分比表示”。
1.3 统计分析
所有实验重复 3 次,数据以“平均值±标准差”表示。采用 SPSS 26.0 进行单因素方差分析(ANOVA),Duncan 多重比较(P<0.05为显著差异)。
2 结果与分析
2.1 分步酶解对底物转化的影响
2.1.1 脂肪酶预处理
如图1所示,Palatase 20000L 在 pH 7.0、50 ℃条件下水解乳脂,酸价从(0.03±0.01) g KOH/g快速升至(54.6±1.8) mg KOH/g (4 h),酸价显著提高(P <0.05),表明Palatase 20000L在初期(0～4 h)高效水解乳脂,释放短链游离脂肪酸(free fatty acid,FFA)(如丁酸、己酸、辛酸、葵酸)。4～6 h时酸价增速显著减缓(仅增加5.3%),可能因底物(甘油三酯)减少及酶活性逐渐丧失(热稳定性下降)。GC-MS分析显示,脂肪酶处理组中短链FFA占比达78.3%(图2-a),与未处理组比较上升,其中丁酸(C4∶0)和己酸(C6∶0)分别占总 FFA的24.4% 和34.4%(图2-b)。值得注意的是,辛酸含量较未处理组呈现显著性差异(P <0.05),这与该酶对低分子质量甘油三酯(如三丁酸甘油酯)的高效水解特性一致[4]。短链FFA不仅是乳制品特征香气的直接贡献者(如丁酸赋予奶油香、己酸呈现果香),更重要的是为后续乳酸菌发酵提供了关键代谢前体[8]。如丁酸已被证实可通过调控乳酸菌的脂肪酸代谢途径,促进乙偶姻等特征风味物质的合成[16]。
图1 酶解时间对黄油酸值的影响
Fig.1 Effect of enzymatic hydrolysis time on the acid value of butter
a-短链游离脂肪酸相对含量;b-单个短链游离脂肪酸相对占比
图2 酶解4 h对黄油中脂肪酸相对含量的影响
Fig.2 Effect of 4 h enzymatic hydrolysis on fatty acid content in butter
注:不同字母表示处理组间差异显著 (P<0.05)。
2.1.2 蛋白酶筛选与作用机制
乳蛋白的酶解特性与其风味前体生成能力密切相关,而蛋白酶的选择是平衡水解效率与感官品质的核心因素。为筛选出能高效释放疏水性肽段同时避免过度苦味、适用于本协同体系的蛋白酶,本研究选择了4种具有不同酶切特性的商品化蛋白酶:Flavorzyme® (复合蛋白酶,含内切和外切酶活性)、Neutrase® (中性内切蛋白酶)、Protamex® (碱性内切蛋白酶)、NS 37071 (具有特定肽键偏好性的内切蛋白酶,据报道对疏水性氨基酸邻位肽键有较高活性)[5,9]。这些蛋白酶在乳制品或蛋白水解领域有广泛应用或表现出特定潜力。实验结果如图3显示,NS 37071在多项指标上呈现显著优势:其水解度[(18.4±0.7)%]虽略低于Flavorzyme®[(20.1±0.9)%],但疏水性肽段比例[(71.5±1.2)%]较Flavorzyme®提高22.3%(P<0.05),且感官苦味值(1.2±0.3)达到可接受范围(<2.0,图4)。这种独特的水解特性可能是因为NS 37071兼具内切酶(优先切割疏水性氨基酸邻位肽键)与外切酶活性(从肽链N端逐步水解),这种协同作用使其在释放苯丙氨酸(Phe)、亮氨酸(Leu)等疏水性氨基酸的同时,避免了过度水解产生的苦味肽(如Leu-Leu-Pro片段)[17]。而Flavorzyme®,其广谱内切酶活性导致产生大量含疏水性末端的小肽(如X-Leu、X-Phe),这些肽段通过激活T2R苦味受体通路引发显著苦味[18],在后续发酵阶段为后续 Strecker 降解生成苯乙醛(巧克力香)和 2-乙酰基吡咯啉(焦糖香)提供前体[5]。感官评价结果显示,以NS 37071组苦味值(1.2±0.1)显著低于Flavorzyme®组(2.1±0.3, P<0.05),且奶香味(4.3±0.3)评分最高(图4)。总上,选择NS 37071蛋白酶参与后续实验。
图3 不同蛋白酶水解黄油的酶解度与疏水性肽段比例比较
Fig.3 Comparison of degree of hydrolysis and hydrophobic peptide content in butter enzymatically hydrolyzed by various proteases
图4 四种蛋白酶酶解黄油感官评价雷达图
Fig.4 Radar chart of sensory evaluation for butter enzymatically hydrolyzed by four proteases
2.2 黄油发酵与酶解代谢特征
2.2.1 菌群生长与产酸特性
如图5所示,在复合菌种(德氏乳杆菌保加利亚亚种∶唾液链球菌嗜热亚种=3∶2)发酵黄油的12 h过程中,pH与菌体生长(OD600值)呈现显著负相关,0～2 h,菌体处于延滞期,代谢活性较低,pH值从6.0缓慢降至5.8(ΔpH/h=0.20),OD600值从1.71升至1.80。对数生长期(2～10 h):pH值急剧下降至5.0(ΔpH/h=0.28),OD600值快速增至2.07。此阶段德氏乳杆菌保加利亚亚种优先分解乳糖产乳酸(pH快速下降),而唾液链球菌嗜热亚种通过代谢乳糖生成乙酸与胞外多糖(exopoly saccharides,EPS)并在酸性环境下激活蛋白酶系统,进一步降解肽段为菌群提供氮源[14]。10～12 h,菌种生长进入稳定期(8～12 h):pH值稳定于4.7～4.8,OD600值增速变缓,乳糖耗尽与乳酸积累抑制菌种生长[1],此时关键风味物质合成达到峰值,故选定12 h为发酵终点。
图5 复合菌种生长过程中pH值和OD600值双变量趋势图
Fig.5 Dynamic changes of pH and OD600 during mixed-strain growth:a bivariate trend analysis
2.2.2 酶解预处理对代谢产物的级联影响
通过GC-MS分析三阶段处理样品的挥发性成分,共鉴定出100种化合物,关键物质如表2所示。
表2 各处理组挥发性化合物分类统计
Table 2 Classification statistics of volatile compounds by treatment group
处理组酯类/种醛类/种酮类/种酸类/种总种类数总峰面积比/%其他/种L(脂肪酶)835153166.821p(蛋白酶)1291184853.118F(发酵)18911204659.934L→P1579225370.019L→P→F211214287579.525
如表2所示,协同处理组(L→P→F)的挥发性物质总峰面积比达79.5%,显著高于其他组(P<0.05)。其丰度较单一脂肪酶处理组(L组,66.8%)提升19.0%,较单一发酵组(F组,59.9%)提升32.7%,证实酶解-发酵协同策略可大幅提高挥发性物质的总体释放效率。分阶段作用机制如下:脂肪酶(L)直接水解乳脂生成SCFAs,使L组酸类物质占比高达66.8%(图6),种类数15种(表2),为后续发酵提供关键底物。P组通过Strecker降解和氨基酸代谢生成醛/酮前体[5],使P组醛酮总种类数达20种(占该组41.7%),显著高于L组(醛3种+酮5种=8种)。L→P→F组的核心酯化反应增强,酯类种类从L组8种增至21种(增加162.5%),峰面积占比跃升至34.7%(图6),反映发酵阶段将脂肪酸与乙醇高效结合;酸类从P组的8种(因蛋白酶不产酸)增至28种(提升250%),体现微生物对脂肪酸的修饰与转化,酸类实现了再积累;酮类14种较P组(11种)增加27.3%,关键化合物2-庚酮含量达3.1%(较F组显著升高520%),酮类实现了定向富集。最终L→P→F组总种类数达75种,其中酯类(21种)、酮类(14种)、酸类(28种)均为各组峰值,证实时序性酶解与发酵的协同显著提升风味丰富度。
图6 各处理组挥发性化合物分类峰面积占比
Fig.6 Relative peak area distri bution of volatile compound categories across treatment groups
如图6和表3所示,L组中SCFAs(C4-C8)占总酸比达68.4%(如丁酸13.2%、己酸25.9%),为后续发酵提供了关键底物。L组中SCFAs总量(54.7%)最高,但L→P→F组通过乳酸菌代谢将部分SCFAs转化为酯类(如丁酸→丁酸乙酯),降低了酸味强度,同时增强风味复杂性。L→P→F组中酯类及总含量(34.7%)显著高于其他组(P <0.05),主要贡献物质为丁酸乙酯(12.5%)、己酸乙酯(8.2%)和癸酸乙酯(5.1%)。L→P→F组中2-庚酮(3.1%)、苯乙醛(2.8%)等阈值低(<0.1 mg/kg)的化合物含量显著提升,直接贡献奶油与焦糖香气[19]。
表3 脂肪酶解组和酶法协同乳酸菌组重要SCFAs对比
Table 3 Comparative analysis of key SCFAs between lipasehydrolysis and enzymatic-LAB synergistic groups
处理组丁酸/%己酸/%癸酸/%L13.2±0.825.9±1.115.6±0.7L→P→F8.4±0.318.5±0.937.2±1.5
2.2.3 关键代谢物积累
丁酸乙酯(阈值<0.1 mg/kg)是黄油奶油香与果香的关键贡献者,由脂肪酶水解乳脂释放的丁酸与乳酸菌代谢产生的乙醇酯化反应生成,极易扩散[20]。如图7所示,L→P→F组(12.5%,峰面积比)中丁酸乙酯含量显著高于L组(0.9%),F组(3.1%)。对比L、P组(仅有丁酸,缺乏充足乙醇和酯化环境)和F组(前体供给不足,酯化效率受限), L→P→F组中L步Palatase 20000L高效水解乳脂,释放丁酸(占SCFAs 24.4%,图2-b)提供充足丁酸前体(图2,表2),P步(和F步菌体代谢)贡献更多的乙醇前体,F步微生物酯酶(如EstA)催化丁酸与乙醇结合,效率较F组提升4.0倍。丁酸乙酯含量与奶香强度呈强正相,其高值(>12%)直接赋予黄油浓郁奶油风味。
图7 各处理组关键风味物质对比
Fig.7 Comparative analysis of key flavor compounds across treatment groups
注:折线图上不同小写字母表示处理组间化合物相对含量具有差异显著 (P<0.05)。
2-庚酮主要由SCFAs(如己酸)的β-氧化途径生成,或通过酮体合成酶催化形成2-庚酮,其阈值低(<0.1 mg/kg),特有的蓝纹奶酪香气显著提升黄油风味的复杂性[20]。如图7所示,L组未检出,说明脂肪酶单独处理仅提供FFA,未能触发β-氧化路径;与F组相比(0.5%)L→P→F组(3.1%)相对含量提升了6.2倍,可能是因为P步释放的疏水性肽段/氨基酸(如如亮氨酸残基)被乳酸菌代谢,激活了相关的β-氧化酶系或提供了特定的酮体合成前体[21]。F组含量低可能是因为前体不足。
苯乙醛来源于苯丙氨酸的Strecker降解,由蛋白酶水解酪蛋白释放的苯丙氨酸经乳酸菌脱氨酶催化生成[22]。脂肪酶处理不涉及氨基酸释放,所以如图7所示,L组中未检出苯乙醛;而在L→P→F组(2.8%)中,NS 37071酶解高效释放了Phe(疏水性氨基酸),结合发酵阶段乳酸菌的脱氨酶和化学环境促使Phe发生Strecker降解生成苯乙醛[5],其相对含量较F组(0.9%)提升3.1倍(前体Phe不足)。苯乙醛具有极低阈值(<0.02 mg/kg),其巧克力香气与丁酸乙酯的奶油香形成协同效应,增强了黄油的整体风味的层次感。
酶解预处理通过分阶段释放前体(FFA→肽段→氨基酸,图8),解决了传统发酵中底物竞争与代谢抑制问题,显著提升关键风味物质的合成效率,使丁酸乙酯、2-庚酮、苯乙醛等关键风味物质含量显著超越传统发酵工艺(L组)。风味物质总量提升2.8倍。这一策略为乳制品风味工程提供了高效、可控的技术路径,具有广阔的工业化应用前景。
图8 分步酶解的时序优势总结
Fig.8 Summary of timing advantages of stepwise enzymatic digestion
3 结论与讨论
本研究证实,酶解预处理通过分阶段释放前体(FFA→肽段→氨基酸)是解决底物竞争与代谢抑制的关键。脂肪酶优先处理释放SCFAs(丁酸24.4%、己酸34.4%,图2-b),不仅激活乳酸菌的乙酰辅酶A羧化酶,更为酯化反应提供充足酸前体,加速酯类合成(丁酸乙酯生成效率提升3.2倍)[3,20]。蛋白酶接力处理,NS 37071特异性释放疏水性肽段(如Leu-Phe-Pro),经Strecker降解生成苯乙醛(含量2.8%,阈值<0.02 mg/kg),其效率较传统工艺提升2.1倍[5,22]。分步供给使酯化通量提升,驱动丁酸乙酯(12.5%)、2-庚酮(3.1%)高效合成。酶解预处理通过分步前体供给,使L→P→F组风味物质总量提升2.8倍(总峰面积比79.5%),且酯/酸比例均衡(0.75),规避了传统发酵的风味失衡问题[23]。与酶解-发酵协同处理工艺对比,发酵虽能产生经多种风味物质(92种),但其风味强度与可控性不足;酯类与酮类占比低,酯类(18种)和酮类(11种)种类较L→P→F组分别少14.3%和21.4%,主要依赖单一菌种的天然代谢活性;风味前体不足[1-2],导致关键风味物质(如丁酸乙酯)含量仅为L→P→F组的24.8%。本研究通过酶-菌协同策略,实现了风味物质的定向富集与工艺参数的精准控制,突破了传统工艺的局限性。
尽管酶解-发酵联用展现出显著优势,仍需解决以下问题,脂肪酶在长时间处理(>4 h)下活性下降30%,需通过固定化技术或耐热酶筛选提高工艺稳定性;蛋白酶过度水解可能生成苦味肽(如含亮氨酸末端肽),需结合风味修饰剂(如酵母抽提物)进行掩蔽[5]。未来研究可进一步利用代谢组学与转录组学技术,揭示乳酸菌对SCFAs与氨基酸前体的代谢偏好性,以优化工艺参数并降低生产成本。除此之外,结合机器学习模型预测最佳酶解参数(如温度、pH、时间),实现动态的风味调控。
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