高尿酸血症(hyperuricemia,HUA)作为嘌呤代谢紊乱性疾病,其全球患病率逐年攀升且趋向年轻化。该疾病核心发病机制与黄嘌呤氧化酶(xanthine oxidase,XOD)催化尿酸过量生成密切相关。XOD是嘌呤代谢通路中的限速酶,其活性异常升高可直接导致血清尿酸水平上升,进而诱发痛风及肾损伤等并发症[1-3]。抑制XOD活性可能导致尿酸前体物质黄嘌呤和次黄嘌呤的水平升高,从而造成黄嘌呤和次黄嘌呤的积累。但黄嘌呤和次黄嘌呤的溶解度显著高于尿酸,其形成结晶并导致病理损伤的风险也远低于尿酸。此外,目前临床一线药物如别嘌醇和非布司他均为XOD抑制剂,虽能有效抑制XOD,但存在严重过敏反应及肝肾毒性风险[4]。因此,开发安全高效的天然降尿酸植物源功能食品成为研究热点。
黄芪(Astragali radix,AR)作为药食同源资源,具有显著抗高尿酸血症活性,其机理涉及抑制XOD活性[5],并通过下调肾脏尿酸重吸收蛋白URAT1/GLUT9表达,上调排泄蛋白ABCG2/OAT1促进尿酸的排泄[6-8]。黄芪经冠突散囊菌发酵后能改变其活性成分组成,并增强体外抗氧化活性和降糖效果[9]。冠突散囊菌可利用植物原料作为营养源并进一步实现其自身的生物转化[10],发酵过程中分泌β-葡萄糖苷酶、纤维素酶及多酚氧化酶等关键酶类[11-12],能水解植物细胞壁,释放结合态活性物质。在罗汉果渣[12]固态发酵中,冠突散囊菌使总黄酮含量提升2.53倍,多糖含量增加1.90倍;在甜荞[13]发酵中,黄酮含量提高了1倍,其α-淀粉酶抑制率提升34%。冠突散囊菌发酵黄芪能提高其降糖作用,但对降尿酸作用影响未见文献报道。因黄芪具有显著的降尿酸效果,但冠突散囊菌发酵对其降尿酸作用的影响有待进一步研究。
冠突散囊菌是茯砖茶发酵过程中的优势菌种与“金花”的主要构成菌株,且对茯砖茶品质的形成起着至关重要的作用[14]。因此,本研究选用茯砖茶作为筛菌对象,以获取优势菌株。随后,利用该菌株对黄芪进行固态发酵,并以XOD抑制率为评价指标,考察发酵产物对XOD的抑制活性,进一步优化发酵工艺参数,探究发酵前后总多糖、总黄酮和抗氧化能力变化情况,旨在为利用黄芪资源开发新型降尿酸功能产品提供新思路。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
茯砖茶,湖南省茶业集团技术中心,分别产自湖南白沙溪茶厂、益阳茶厂和陕西泾渭茯茶;内蒙古黄芪,河北省安国市兴业中药材种植技术开发有限公司;绿碎茶,湖南省茶业集团技术中心。
PDA培养基,广东环凯微生物科技有限公司;XOD、芦丁标准品、DPPH、ABTS,上海源叶生物科技有限公司;黄嘌呤、别嘌呤醇,上海阿拉丁生物科技有限公司;磷酸盐缓冲液干粉,北京索莱宝科技有限公司;无水乙醇、无水葡萄糖、H2SO4、HCl、苯酚、Al(NO3)3,国药集团化学试剂有限公司。
1.2 仪器与设备
HPX-60BS-III恒温恒湿培养箱,上海新苗医疗器械制造有限公司;SB-5200DT超声波清洗机,宁波市新艺超声设备有限公司;LDZH-100KBS立式压力蒸汽灭菌锅,上海申安医疗器械厂;DE-150 g粉碎机,浙江红景天工贸有限公司;HH-4数显恒温水浴锅,上海力晨邦西仪器科技有限公司;UV-2600i紫外可见分光光度计,日本岛津公司;H1850高速台式离心机,湖南湘仪实验室仪器开发有限公司;SW-CJ-1FD超净工作台,苏州净化设备有限公司;FD-1B-50冷冻干燥机,北京博医康实验仪器有限公司。
1.3 试验方法
1.3.1 冠突散囊菌的分离纯化
准确称取茯砖茶样品10 g,置于90 mL无菌蒸馏水(带玻璃珠)内,充分振荡以洗脱茶叶表面附着的菌体。收集洗脱液,制成均匀的孢子悬液。对该悬液进行梯度稀释,取10-4稀释样品100 μL均匀涂布于PDA平板上,并置于28 ℃恒温培养箱中培养。待平板有金黄色菌落生成时,用无菌接种环挑取适量菌体进行多次划线,直至获得形态均一的金黄色单菌落,即为目标菌株。纯化后的菌株斜面于4 ℃冰箱中保藏。
1.3.2 冠突散囊菌形态和分子生物学鉴定
形态学鉴定:经纯化后的菌株接种于PDA平板上置于28 ℃恒温培养箱中倒置培养7 d,观察并记录平板表面菌落的形态特征和生长情况。
分子生物学鉴定:将纯化后的菌株送至上海生工生物工程股份有限公司进行真菌转录间隔区序列(internal transcribed spacer,ITS)测定,将获得的序列提交至NCBI的GenBank数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)进行BLAST同源性搜索,筛选并下载同源性较高的菌株序列,运用MEGA 11.0软件进行序列对比并构建系统发育树。
1.3.3 冠突散囊菌发酵黄芪工艺优化
以冠突散囊菌AH10菌株发酵黄芪的提取液对XOD抑制率为优化指标,确定冠突散囊菌固态发酵黄芪的最佳发酵工艺。
1.3.3.1 冠突散囊菌发酵剂的制备
参考巢瑾[15]的方法略有修改,称取绿茶原料按料液比1∶0.4(g∶mL)加入蒸馏水,混匀制成固态培养基。将混合均匀的培养基置于高压蒸汽灭菌锅中121 ℃灭菌30 min。待培养基冷却后接入冠突散囊菌,于28 ℃恒温培养箱中培养7 d,后于真空冷冻干燥机中冻干处理。干燥所得样本即为冠突散囊菌发酵剂,其冠突散囊菌测定为1.0×107 CFU/g。
1.3.3.2 发酵黄芪提取液的制备
蒙古黄芪为豆科植物蒙古黄芪的干燥根。所购黄芪呈直径1～2 cm,长度2～3 cm的段状;表面呈现淡棕黄色,有不规则的纵沟,可见其放射状纹理;断面纤维性较强且显粉性;质地坚韧不易折断;气微且具有豆腥气。准确称取50 g上述黄芪于300 mL三角瓶中,加入一定量的蒸馏水混合均匀,于灭菌锅内121 ℃灭菌30 min,待冷却后接入冠突散囊菌发酵剂,混合均匀,置于28 ℃恒温恒湿培养箱中培养。将发酵后黄芪于真空冷冻干燥机中冻干后粉碎,过40目筛后制成黄芪粉末,即为发酵黄芪样品,并保存于无菌密封袋中备用。
黄芪醇提液:参考LI等[16]的方法略作修改,称取2.0 g发酵黄芪样品,在50 ℃下用70%乙醇溶液(体积分数,下同)超声提取(40 kHz,300 W)2次。第1次提取加入20 mL的70%乙醇溶液,提取40 min;第2次提取时使用12 mL的70%乙醇溶液,提取20 min。合并2次提取液。于4 000 r/min离心10 min,收集上清液定容至50 mL容量瓶,即黄芪醇提液。
黄芪水提液:参考ZHANG等[17]的方法略作修改,称取2.0 g发酵黄芪样品,采用蒸馏水95 ℃煎煮提取2次。第1次提取加入20 mL的蒸馏水,煎煮1 h;第2次提取加入16 mL的蒸馏水,煎煮40 min。合并2次提取液,于4 000 r/min离心10 min,收集上清液定容至50 mL容量瓶,即黄芪水提液。
1.3.3.3 发酵黄芪提取液对XOD抑制率测定
参考ZHAO等[18]的方法略作修改,分别将黄嘌呤(1.5 mmol/L)和XOD(0.2 U/mL)溶解在磷酸盐缓冲液(pH 7.4)中。将750 μL黄芪醇提液、900 μL磷酸盐缓冲液和600 μL XOD溶液混合,于37 ℃下孵育15 min,随后加入750 μL黄嘌呤溶液反应30 min,最后加入900 μL 1 mol/L稀盐酸终止酶促反应,用紫外分光光度计在295 nm波长处测定吸光度。XOD抑制率的计算如公式(1)所示:
XOD抑制率
(1)
式中:A1,黄芪醇提液、XOD溶液和黄嘌呤溶液混合反应后的吸光度;A2,黄嘌呤溶液和XOD溶液反应的吸光度,不加醇提液;A3,醇提液和黄嘌呤溶液的吸光度,不加XOD溶液;A4,黄嘌呤溶液的吸光度,不加XOD溶液和醇提液。
1.3.3.4 冠突散囊菌发酵条件单因素试验
根据文献[19]并结合前期试验,选择28 ℃为恒定的发酵温度。设定含水量40%(质量分数)、接种量3%(接种量为g发酵剂/g黄芪)、发酵时间4 d为基础发酵条件,改变单一条件,考察在恒定发酵温度下,含水量(10%、20%、30%、40%、50%)、接种量(0%、1%、3%、5%、7%)、发酵时间(0、2、4、6、8、10 d)对发酵黄芪XOD抑制率的影响。
1.3.3.5 冠突散囊菌发酵条件正交优化
基于单因素试验结果,采用L9(34)正交试验设计,选取发酵时间、含水量及接种量为考察因素,将XOD抑制能力作为评价指标,对发酵工艺参数进行正交优化。各因素具体水平设置如表1所示。
表1 L9(34)正交试验因素及水平
Table 1 Factors and levels in L9(34) orthogonal experiment design
水平因素A(发酵时间)/dB(含水量)/%C(接种量)/%D(空列)1630128403310505
1.3.4 冠突散囊菌发酵对黄芪总多糖、总黄酮和抗氧化活性的影响
基于正交试验确定黄芪发酵的最优工艺参数,并在此优化条件下,研究冠突散囊菌发酵对黄芪总多糖、总黄酮含量和抗氧化活性的影响。
1.3.4.1 总黄酮含量测定
采用硝酸铝显色法测定总黄酮含量,参考聂静苑等[20]的方法并稍作调整。精密称取芦丁对照品,用无水乙醇配制质量浓度为0.2 mg/mL标准溶液。分别移取0.0、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0 mL标准溶液置于25 mL容量瓶中。依次向各容量瓶中加入1 mL 50 g/L亚硝酸钠溶液,混匀后避光静置6 min,随后加入1 mL 100 g/L 硝酸铝溶液混匀后继续避光静置6 min,最后加入10 mL 40 g/L NaOH溶液,并用70%乙醇溶液定容至刻度。将反应体系避光静置15 min后,于510 nm波长处测定吸光度。以芦丁标准溶液质量分数为横坐标,吸光度为纵坐标绘制标准曲线,质量分数在0～64 μL/mL呈线性关系,其回归方程为:y=0.011 57x-0.003 582(R2=0.999 3)。分别量取未发酵与发酵黄芪醇提液1 mL于25 mL容量瓶中,严格参照上述步骤进行显色反应并测定吸光度,根据标准曲线计算总黄酮含量。
1.3.4.2 总多糖含量测定
参考张艳贺等[21]的苯酚-硫酸法并略作调整。以无水葡萄糖为对照品,用蒸馏水配制质量浓度为0.5 mg/mL的标准溶液。精密移取该标准溶液0.0、0.2、0.8、1.2、1.6、2.0 mL分别置于10 mL容量瓶中,加蒸馏水定容至刻度。取各梯度稀释液2.0 mL,加入新制1.0 mL 50 g/L苯酚溶液,混匀后迅速加入5.0 mL浓硫酸,充分振荡混合5 min。随后置于沸水浴中加热15 min,再立即转移至冰浴冷却15 min。冷却后于490 nm波长下测定吸光度。以葡萄糖标准溶液质量分数为横坐标,吸光度为纵坐标绘制标准曲线,质量分数在0～100 μL/mL呈线性关系,其回归方程为:y=0.013 49x+0.10(R2=0.998 8)。分别量取未发酵和发酵黄芪水提液0.1 mL定容至50 mL,取此定容后的溶液2 mL,参照上述方法测定吸光度值,根据标准曲线计算总多糖含量。
1.3.4.3 DPPH自由基清除能力
参考郭丽丽等[22]的方法并调整。首先,按照1.3.3.2节制备未发酵与发酵黄芪醇提液,然后以70%乙醇配制成质量浓度为0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 mg/mL的待测溶液。取2 mL上述不同质量浓度待测溶液或阳性对照(维生素C)溶液,加入2 mL 0.1 mmol/L 的DPPH乙醇溶液,室温避光静置30 min,于517 nm波长处测定吸光度(A1);以无水乙醇代替DPPH乙醇溶液,测得吸光度(A2);以70%乙醇代替待测液作为空白对照,测得吸光度(A0)。按公式(2)计算DPPH自由基清除率:
DPPH自由基清除率
(2)
式中:A1,待测溶液或(维生素C溶液)与DPPH乙醇溶液混合后测得的吸光度;A2,待测溶液(或维生素C溶液)与无水乙醇混合后测得的吸光度;A0,70%乙醇溶液与DPPH乙醇溶液混合后测得的吸光度。
1.3.4.4 ABTS阳离子自由基清除能力
ABTS阳离子自由基清除能力的测定参照朱昱琳等[23]的方法并略作调整。首先,按照1.3.3.2节制备未发酵与发酵黄芪醇提取液,然后将7.4 mmol/L ABTS溶液和2.6 mmol/L过硫酸钾溶液等体积混合,于室温暗处反应14 h,生成ABTS储备液。使用70%乙醇溶液稀释ABTS储备液,使其在734 nm处的吸光度值为0.70±0.02,即得ABTS工作液。取0.5 mL不同质量浓度待测溶液(0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 mg/mL)或阳性对照维生素C溶液,加入3.5 mL ABTS工作液,混匀后避光静置10 min,于734 nm波长处测定吸光度(B1)。以70%乙醇代替ABTS溶液,测得吸光度(B2)。以70%乙醇代替待测液作为空白对照,测得吸光度(B0)。按公式(3)计算ABTS阳离子清除率:
ABTS阳离子自由基清除率
(3)
式中:B1,待测溶液(或维生素C溶液)与ABTS工作液混合后测得的吸光度;B2,待测溶液(或维生素C溶液)与70%乙醇溶液混合后测得的吸光度;B0,70%乙醇溶液与ABTS工作液混合后测得的吸光度。
1.3.5 数据处理
试验所得数据采用“平均值±标准差”形式呈现。采用SPSS Statistic 25.0软件进行统计分析,P<0.05表示差异具有统计学意义,所有试验均设3个生物学重复。利用Graphpad Prism 10.1.2和Origin 2024软件进行作图。
2 结果与分析
2.1 菌株的分离纯化及鉴定
2.1.1 菌落形态特征
各茯砖茶(图1-a～图1-c)分离菌株于PDA培养基28 ℃培养5 d,观察菌落形态(图1-d～图1-f)。在PDA平板上,菌株形成近似圆形菌落。菌落表面干燥粗糙,无渗出液产生,且未向培养基中分泌扩散性色素。黄色闭囊壳均匀分布于菌落表面,呈鲜明金黄色泽。菌落中央区域颜色较深,外围可见致密的白色菌丝。
a-白沙溪茯砖茶;b-益阳茯砖茶;c-泾渭茯砖茶;d-白沙溪茯砖茶菌株;e-益阳茯砖茶菌株;f-泾渭茯砖茶菌株
图1 各地区茯砖茶及所分离的菌株
Fig.1 Fuzhuan tea from various regions and the isolated strains
2.1.2 ITS序列比对
委托上海生工生物工程股份有限公司对3株分离菌株进行ITS测序,所得序列通过BLAST与GenBank数据库进行同源序列比对并构建各自系统发育树(图2-a～图2-c)以明确不同产地茯砖茶的优势菌种。系统发育分析结果(图2)显示,从3家茯砖茶中分离纯化得到的优势菌株均鉴定为冠突曲霉(Aspergillus cristatus)AH10菌株。该鉴定结果与赵仁亮等[24]报道陕西、湖南茯砖茶中优势菌群为冠突曲霉一致。冠突散囊菌(即冠突曲霉)是真菌界的益生菌类群,其有性型称为冠突散囊菌,无性型则称为冠突曲霉[25]。后续试验均采用AH10菌株开展。
a-白沙溪茯砖茶;b-益阳茯砖茶;c-泾渭茯砖茶
图2 系统发育树
Fig.2 Phylogenetic trees
2.2 黄芪发酵工艺优化
2.2.1 黄芪发酵条件单因素试验结果
2.2.1.1 不同含水量对XOD抑制率的影响
当接种量为3%,发酵时间为4 d时,不同含水量发酵黄芪样品对XOD抑制率的影响如图3所示。随含水量增加,XOD抑制率先增加后降低,当含水量为40%时,XOD抑制率达到顶峰,为(66.78±4.82)%。因此,后续试验选择40%的含水量进行。
图3 含水量对XOD抑制率的影响
Fig.3 Effects of water content on XOD inhibition rate
注:不同小写字母表示组间差异显著(P<0.05)(下同)。
2.2.1.2 不同接种量对XOD抑制率的影响
当含水量为40%,发酵时间为4 d,不同接种量对XOD抑制率的测定结果如图4所示。随着接种量的增加,XOD抑制率先升高后下降,当接种量为3%时,XOD抑制率达到最高值,为(68.72±3.45)%。因此,在后续试验中,选择3%作为发酵的接种量。
图4 接种量对XOD抑制率的影响
Fig.4 Effects of inoculum size on XOD inhibition rate
2.2.1.3 不同发酵时间对XOD抑制率的影响
在接种量为3%,含水量为40%时,不同发酵时间对XOD的抑制效果如图5所示。随发酵时间延长,XOD抑制率逐渐提高。当发酵时间为8 d时,XOD抑制率达到最大值,为(76.71±1.79)%,继续增加发酵时间至10 d,XOD抑制率显著下降。因此,选择8 d作为发酵时间。
图5 发酵时间对XOD抑制率的影响
Fig.5 Effects of fermentation time on XOD inhibition rate
2.2.2 黄芪发酵条件正交试验结果
为确定最佳工艺参数组合,在单因素试验的基础上,设定含水量30%、40%、50%;发酵时间6、8、10 d和接种量1%、3%、5%作为三因素三水平正交试验变量。选择L9(34)正交表设计正交试验(表2),其中增设空列D用于评估随机误差。方差分析结果(表3)显示发酵时间与含水量对XOD抑制活性有显著影响(P<0.05),而接种量不显著(P>0.05)。各因素影响程度排序为:发酵时间>含水量>接种量。确定发酵参数最佳组合为A2B2C2,即发酵8 d、含水量40%、接种量3%。在此条件下,发酵黄芪对XOD抑制率达(79.13±4.39)%,显著优于未发酵黄芪。阳性药物别嘌呤醇(50 μg/mL)对XOD抑制率为(63.81±1.89)%,表明发酵黄芪具有潜在的降尿酸活性。
表2 正交试验结果
Table 2 The results of orthogonal experiments
试验号因素发酵时间含水量接种量空列ABCDXOD抑制率/%1111155.352122273.543133366.454212375.015223184.396231279.077313270.258321381.609332179.73K1195.34200.61216.02219.46K2238.47239.53228.28222.86K3231.58225.24221.08223.06k165.1166.8772.0173.15k279.4979.8476.0974.29k377.1975.0873.6974.35R14.3812.984.091.20
表3 方差分析表
Table 3 The results of variance analysis
源III类平方和自由度均方F显著性修正模型 641.6146 106.936 78.8220.013截距49 193.761149 193.76136 260.4610.00发酵时间357.892178.945131.8990.008含水量258.4242129.21295.2410.01接种量25.301212.659.3250.097误差2.71321.357总计49 838.0899修正后总计644.3288
2.3 冠突散囊菌发酵对黄芪总多糖、总黄酮含量和抗氧化活性的影响
2.3.1 冠突散囊菌发酵对黄芪总多糖、总黄酮含量的影响
如图6所示,经冠突散囊菌发酵后,黄芪样品中总多糖含量显著减少,而总黄酮含量则显著增加。未发酵黄芪中总多糖含量为(250.19±16.50) mg/g,总黄酮含量为(3.16±0.08) mg/g。最优发酵工艺条件下,黄芪总多糖含量降至(125.56±7.33) mg/g,总黄酮含量提高了2.6倍,为(8.06±0.16) mg/g。这与冠突散囊菌发酵桑叶[26]、罗汉果渣[12]、红薯叶[27]、牛蒡[19]的结果相吻合,一方面是多糖作为碳源被冠突散囊菌消耗以维持生长,同时菌体分泌的纤维素酶、苯丙氨酸解氨酶破坏植物细胞壁,促进结合态黄酮释放[26];另一方面是微生物代谢过程可将糖苷型黄酮转化为生物活性更高的苷元型[27],比如微生物代谢将葛根素转化为大豆苷元,从而导致总黄酮含量增加。
图6 发酵前后总多糖和总黄酮含量
Fig.6 Content of total polysaccharides and total flavonoids before and after fermentation
注:**代表差异显著(P<0.01)。
2.3.2 冠突散囊菌发酵对黄芪抗氧化活性的影响
如图7-a所示,未发酵黄芪和发酵黄芪对DPPH自由基清除率均随浓度增加而升高。发酵黄芪对DPPH自由基清除率最大值出现在质量浓度1.6 mg/mL时,其达到了(86.82±0.52)%,极显著高于(P<0.01)此质量浓度下的未发酵黄芪(35.73±2.20)%。此外发酵黄芪DPPH自由基清除率IC50值为0.59 mg/mL,表明黄芪经过冠突散囊菌发酵后极大提高了其DPPH自由基清除活性。类似结果在葛根[28]、银杏叶[29]中均有报道,经冠突散囊菌发酵后DPPH自由基清除活性显著优于未发酵样品。未发酵黄芪和发酵黄芪对ABTS阳离子自由基清除能力均与质量浓度成正比(图7-b),当质量浓度为2.0 mg/mL时,发酵黄芪对ABTS阳离子自由基清除率为(87.84±6.15)%,极显著高于(P<0.01)当前质量浓度下未发酵黄芪的清除率(41.48±2.18)%。最佳条件下,发酵黄芪清除ABTS阳离子自由基的IC50值为0.93 mg/mL,说明黄芪经发酵后对ABTS阳离子自由基也具有较强的清除活性。这一结果与冠突散囊菌发酵红薯叶[27]、青稞[30]等在ABTS阳离子自由基清除活性研究中的发现一致。
a-DPPH自由基清除率;b-ABTS阳离子自由基清除率
图7 黄芪发酵前后抗氧化活性比较
Fig.7 Comparison of antioxidant activity of Astragali radix before and after fermentation
2.3.3 XOD抑制活性与总黄酮、总多糖和抗氧化活性的相关性分析
本研究结果显示,黄芪经过冠突散囊菌发酵后其XOD抑制活性、总黄酮含量和自由基清除活性(DPPH自由基/ABTS阳离子自由基)均显著提高,总多糖含量明显下降。通过Spearman相关性分析(图8)可知:总黄酮与XOD抑制率、DPPH自由基和ABTS阳离子自由基清除率呈正相关;而总多糖却与XOD抑制率、DPPH自由基和ABTS阳离子自由基清除率呈负相关。马文婧等[31]报道平卧菊三七中总黄酮含量与XOD抑制活性呈极显著正相关(P<0.01,r=0.991),而多糖组分既无抑制活性,其高占比还会稀释黄酮、酚酸等有效成分,导致XOD抑制活性下降;发酵青稞[30]研究中也观察到总黄酮含量与抗氧化活性同步上升,且呈极显著正相关(P<0.01);唐文文等[32]通过相关性分析发现,多糖含量与DPPH自由基/ABTS阳离子自由基清除率呈负相关,而黄酮含量则与两者呈强正相关。
图8 XOD抑制活性与总黄酮、总多糖和抗氧化活性的相关性分析
Fig.8 Correlation analysis of XOD inhibitory activity with total flavonoids, total polysaccharides and antioxidant activity
注:图中颜色标尺表示Spearman相关系数绝对值大小(红色代表正相关,蓝色代表负相关),颜色越深相关性越强;*表示差异显著 (P<0.05),**表示差异极显著(P<0.01)。
3 结论
本研究分别从3家茯砖茶中分离纯化得到优势菌株,经形态观察和分子生物学鉴定均为冠突散囊菌AH10。采用正交试验优化AH10菌株发酵黄芪的工艺条件,确定最优参数为发酵时间8 d、含水量40%、接种量3%。在此优化工艺下,发酵黄芪醇提液对XOD抑制率为(79.13±4.39)%。理化指标检测和抗氧化试验结果表明,黄芪经发酵后总多糖含量显著下降,总黄酮含量显著提升,且抗氧化效果得到明显改善。后续通过Spearman相关性分析发现总黄酮与XOD抑制率、DPPH自由基和ABTS阳离子自由基清除率呈正相关;总多糖与XOD抑制率、DPPH自由基和ABTS阳离子自由基清除率呈负相关。后续研究将聚焦黄芪经冠突散囊菌发酵前后的黄酮类成分与多糖结构差异特征,系统解析其构效关联,以期阐明XOD抑制活性的物质基础。综上,冠突散囊菌发酵可显著提升黄芪中黄酮类等关键活性成分的含量及XOD抑制活性,为新型降尿酸产品的研发提供理论支撑与实践参考。
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